強(qiáng) 倩， 羅海青， 張建梅， 沈 婷， 王新風(fēng)， 胡衛(wèi)成， 紀(jì)麗蓮，3

(1.淮陰師范學(xué)院/江蘇省高校區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇淮安 223300； 2.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/

大蒜是一種古老的藥食兩用植物，在我國已有2 000多年的種植歷史[1]，是我國的特色農(nóng)產(chǎn)品和傳統(tǒng)調(diào)味料，其性味溫?zé)?，具有抗菌、抗氧化、降血糖、護(hù)肝及殺蟲等性能[2]。此外，大蒜作為一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的傳統(tǒng)藥物，能緩解疲勞，增加體力，幫助消化，預(yù)防腹瀉及蠕蟲感染，可用于治療心臟病和關(guān)節(jié)炎[3]。相關(guān)研究表明，大蒜具有抗腫瘤功能，可誘導(dǎo)人體產(chǎn)生強(qiáng)烈的TH1免疫反應(yīng)[4]。我國大蒜消費(fèi)主要以其原料和初級(jí)加工產(chǎn)品為主，其中腌漬蒜產(chǎn)品在大蒜的加工和貿(mào)易中占主要地位[5]。目前，幾種大蒜產(chǎn)品如脫水大蒜粉、大蒜精油、大蒜油浸膏和老化的大蒜提取物已被逐漸引入市場(chǎng)[6]。

黑蒜，又名黑大蒜，是以新鮮大蒜為原料，在嚴(yán)格控制溫度和濕度的情況下發(fā)酵而成的一種新型大蒜制品。黑蒜在加工過程中，自身的組織被破壞，其物質(zhì)所發(fā)生的一系列的酶促反應(yīng)和非酶褐變反應(yīng)，其中包括美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)等[7]。黑蒜在加工過程中變成黑色，同時(shí)，呈色物質(zhì)本身也有一些生物活性。加工后的黑蒜無辛辣及刺激性氣味，具有高含量的多糖、還原糖、蛋白質(zhì)、酚類化合物、有機(jī)硫化合物和類黑素[8]，其中多酚類物質(zhì)含量高出5倍以上[9]，其超氧化物歧化酶活性高出10倍以上[10]，這使得生大蒜的抗氧化功效有了很大的提高，對(duì)保持人體健康起著積極作用。目前對(duì)黑蒜的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道很少，對(duì)黑蒜抗氧化機(jī)制的研究尚未清楚，為了對(duì)黑蒜的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，本試驗(yàn)對(duì)黑蒜的抗氧化性進(jìn)行研究，并以DPPH清除率、Fe3+還原能力、ABTS清除率及氧自由基清除能力測(cè)定黑蒜的抗氧化能力，以期明確黑蒜的抗氧化能力，為黑蒜深加工利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白蒜及黑蒜由菏澤天鴻果蔬有限公司提供；2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、水溶性維生素E(Trolox)、熒光素(FL)、2，2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP)槲皮素(Quercetin)、沒食子酸、福林試劑、碳酸鈉、鐵氰化鉀、硫酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鐵、甲醇、無水乙醇均為分析純。

DHG-9240A型烘箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Centrifuge 5418型離心機(jī)，德國Eppendorf公司；分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ecan infinite M200PRO酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；Q-250B3高速多功能粉碎機(jī)，上海冰都電器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取液的制備 將新鮮的白蒜、黑蒜烘干至恒質(zhì)量，加入粉碎機(jī)粉碎后，分別稱取1 g白蒜、黑蒜樣品機(jī)械粉，按1 ∶20的料液比加入50%的乙醇溶液20 mL，于30 ℃超聲提取30 min，離心、過濾，用50%的乙醇定容至20 mL作為樣品液待用。

1.2.2 黑蒜加工前后多酚含量的測(cè)定[11]

1.2.2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取0.02 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品置于燒杯中，用80%乙醇溶解后定容至50 mL，得到400 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍吸取沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、350.0、400.0 μL，分別置于12支離心管中，向每支離心管中各加入80%乙醇至0.2 mL。依次加入1 mL蒸餾水，0.2 mL 福林試劑，混勻靜置3 min后，加入0.6 mL 7.5%碳酸鈉，再次混勻，靜置40 min后，在D765 nm處測(cè)定其吸光度。并以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.007 1x+0.016 9，r2=0.999 8。式中y為吸光度；x為多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)。

1.2.2.2 樣品測(cè)定 取制備好的白蒜、黑蒜乙醇提取液 1 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法，在D765 nm處測(cè)定其吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算黑蒜加工過程中多酚含量，樣品總多酚含量以每克樣品中所含沒食子酸的毫克數(shù)表示(mg GA eq/g)。

1.2.3 黑蒜加工前后體外抗氧化能力的測(cè)定

1.2.3.1 清除DPPH自由基的測(cè)定 按濃度大小依次向96孔透明板中加入100 μL白蒜、黑蒜提取液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg/mL)，再分別加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液。依照相同的操作方法，將不同濃度的樣品液分別與甲醇混勻作為空白組，DPPH溶液與甲醇混勻作為對(duì)照組。室溫避光靜置30 min后，在D517 nm處測(cè)其吸光值，重復(fù)3次，每次3組平行，取平均值。

式中：D1為DPPH溶液與樣品液的吸光度之和；D2為樣品液與提取溶劑的吸光度之和；D3為DPPH溶液與提取溶劑的吸光度之和。

1.2.3.2 Fe3+還原能力的測(cè)定[12-13]準(zhǔn)確吸取0.2 mL不同濃度白蒜、黑蒜提取液(0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/mL)置于5支2 mL離心管中，分別加入0.5 mL 0.2 mol/L pH值6.6磷酸緩沖液和0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后，于50 ℃溫度下水浴20 min，然后加入0.5 mL 10%的三氯化鐵溶液(TCA)，混合均勻，置于離心機(jī)中以 5 000 r/min 離心5 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL蒸餾水和0.1 mL 0.1%氯化鐵溶液，混勻后，靜置10 min，在D700 nm處測(cè)其吸光值，重復(fù)3次，每次3組平行，取平均值。

1.2.3.3 清除ABTS+自由基的測(cè)定 用PBS(pH值=7.4)配制7 mmol/L的ABTS+溶液，將7 mmol/L的ABTS和 2.45 mmol/L 過硫酸鉀等體積混合均勻，在室溫下避光反應(yīng)12～16 h生成ABTS+儲(chǔ)備液，使用前用PBS稀釋到D734 nm處吸光度為0.66±0.03的工作液。取20 μL不同濃度白蒜、黑蒜提取液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg/mL)加到96孔透明酶標(biāo)板中，分別加入150 μL 0.2 mmol/L ABTS+儲(chǔ)備液，以PBS作為對(duì)照，室溫下反應(yīng) 10 min 后，在D517 nm處測(cè)其吸光值，重復(fù)3次，每次3組平行，取平均值。

式中：D0為ABTS+工作液與PBS的吸光度之和；D為ABTS+工作液與樣品液的吸光度之和。

1.2.3.4 氧自由基吸收能力(ORAC)的測(cè)定 取不同濃度白蒜、黑蒜提取液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg/mL)和Trolox標(biāo)準(zhǔn)液(用pH值=7.4的75 mmol/L PBS稀釋)20 μL加到96孔黑色酶標(biāo)板中，分別加入180 μL FL，在37 ℃條件下孵育20 min，隨后加入20 μL 119 mmol/L的ABAP溶液。用485 nm激發(fā)波長和535 nm發(fā)射波長測(cè)定其熒光強(qiáng)度，測(cè)定時(shí)間間隔為5 min，連續(xù)測(cè)定35次。ORAC值以Trolox當(dāng)量表達(dá)，單位為mmol TE/g DW。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑蒜加工前后多酚含量比較

多酚類物質(zhì)含有多個(gè)酚基團(tuán)，具有良好的抗氧化性和抗癌活性。多酚類物質(zhì)種類很多、結(jié)構(gòu)各異，其抗氧化性、生物利用率及對(duì)人體影響也有所不同，在食品醫(yī)藥中具有廣泛的應(yīng)用。多酚類物質(zhì)的提取率不僅因溶劑種類、提取時(shí)間、提取溫度、溶劑用量等條件的不同而存在差異，同時(shí)，在天然產(chǎn)物中多酚類物質(zhì)因種類的不同，其含量也存在很大差異[14]。本試驗(yàn)利用50%的乙醇分別對(duì)白蒜、黑蒜粉末進(jìn)行提取，采用福林-酚法測(cè)定其多酚的含量，從圖1可以看出，白蒜、黑蒜的多酚含量分別為0.49、2.60 mg GA eq/g，二者差異顯著。表明黑蒜在發(fā)酵過程中，多酚含量增加，本結(jié)果與連毅等的研究結(jié)果[9]一致。安東認(rèn)為，多酚類物質(zhì)含量的增加可能是因?yàn)榇蠡衔镝尫懦龈嗟姆恿u基，使多酚的相對(duì)含量升高[15]；Kwon等指出，可能是在高溫情況下其他化合物轉(zhuǎn)化成了多酚類物質(zhì)[16]。表明黑蒜在發(fā)酵過程中多酚類物質(zhì)增加，使黑蒜具有更好的抗氧化、抗癌活性。

2.2 黑蒜加工前后體外抗氧化活性

酚類物質(zhì)組成比較復(fù)雜，其種類和含量隨著植物品種、成熟度、季節(jié)域等不同有很大差異，單一的抗氧化方法很難完全有效地對(duì)其含量及活性進(jìn)行測(cè)定，而且不同的方法研究結(jié)果也存在很大差異，且缺乏可比性。因此，選用多種方法對(duì)其進(jìn)行研究，力求全面對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.2.1 黑蒜加工前后對(duì)DPPH自由基的清除作用 DPPH是一種具有單電子、穩(wěn)定的氮中心的自由基，廣泛用于動(dòng)植物提取物或者食品的抗氧化特性評(píng)價(jià)。當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，DPPH自由基接受一個(gè)電子或氫原子，形成穩(wěn)定的化合物，使其溶液從深紫色變?yōu)榈S色，變色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，可通過吸光值大小來判斷清除能力。本研究用酶標(biāo)儀對(duì)其吸光值進(jìn)行測(cè)定。從圖2可以看出，黑蒜在加工前后對(duì)DPPH自由基都有清除能力，且隨著樣品濃度的增加，DPPH的清除能力增強(qiáng)，黑蒜加工前后半抑制濃度IC50(指對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到50%時(shí)所需樣品的濃度)分別為13.98、5.99 mg/mL，與王衛(wèi)東等所報(bào)道的黑蒜的自由基的清除率是普通大蒜的3倍結(jié)論[17]一致。這可能是由于黑蒜加工過程中多酚含量增加，抗氧化能力增強(qiáng)，對(duì)自由基的清除能力也增強(qiáng)。

2.2.2 黑蒜加工前后的還原力 還原力是用來評(píng)價(jià)抗氧化劑活性的常用方法，根據(jù)樣品本身的還原作用，給出電子清除

自由基，樣品作為一種還原劑，其還原能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)，反之越弱。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，樣品中的多酚類化合物可作為一種很強(qiáng)的天然抗氧化劑，具有很強(qiáng)的抗氧化性，可以通過測(cè)定其還原力來評(píng)價(jià)其抗氧化能力。從圖3可以看出，不同質(zhì)量濃度下白蒜與黑蒜提取液還原能力的強(qiáng)弱，相同濃度下黑蒜的還原力明顯高于白蒜，在低濃度情況下白蒜和黑蒜的還原能力不明顯，當(dāng)濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)，黑蒜的還原力為白蒜的1.82倍，且隨著提取液濃度的升高，還原能力也逐漸升高。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道樣品的還原能力強(qiáng)弱與樣品中所含的多酚類物質(zhì)呈正相關(guān)性[18]，本試驗(yàn)中，白蒜總酚的含量 0.49 mg GA eq/g，而黑蒜的總酚含量達(dá)到 2.60 mg GA eq/g，是白蒜的5倍之多，從而證實(shí)了黑蒜的還原能力強(qiáng)于白蒜。

2.2.3 黑蒜加工前后對(duì)ABTS+自由基的清除 從圖4可以看出，黑蒜加工前后ABTS+清除能力與濃度呈正相關(guān)性，即隨著樣品濃度的增加，清除率逐漸升高，黑蒜ABTS+清除率明顯高于白蒜，且隨著樣品濃度的增大清除能力差別明顯。在濃度為0.05 mg/mL時(shí)，白蒜、黑蒜提取液對(duì)ABTS+沒有清除作用，隨著濃度的增大，當(dāng)濃度為0.50 mg/mL時(shí)，白蒜的清除率為6.23%，黑蒜的清除率為20.35%；當(dāng)濃度為 1 mg/mL 時(shí)，白蒜的清除率為11.23%，黑蒜的清除率為38.71%，即隨著濃度的增加，白蒜、黑蒜的清除率都在上升，且黑蒜的清除能力強(qiáng)于白蒜。這可能是由于濃度的增大，白蒜、黑蒜中活性成分含量升高。總體來看，黑蒜提取液的ABTS+自由基的清除能力明顯優(yōu)于白蒜，一方面可能與多酚含量有關(guān)，黑蒜在加工過程中多酚含量是白蒜的5倍以上；另一方面可能與多酚的形態(tài)有關(guān)，黑蒜在加工過程中可能產(chǎn)生很多游離多酚類物質(zhì)且其具有很強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力。因此，黑蒜對(duì)ABTS+的清除率明顯高于白蒜。

2.2.4 黑蒜加工前后對(duì)氧自由基的清除能力 ORAC抗氧化原理是指自由基能破壞熒光探針，使熒光強(qiáng)度發(fā)生變化，其變化的大小反映自由基破壞的程度?？寡趸瘎┛梢砸种朴勺杂苫鸬臒晒庾兓?，而抑制程度能反映其對(duì)自由基的抗氧化能力的大小。從圖5可以看出，無論是白蒜、黑蒜均顯示出對(duì)氧自由基清除能力，但是黑蒜的清除能力比白蒜的要強(qiáng)，白蒜的氧自由基吸收能力為324.43 μmol TE/g DM，黑蒜吸收能力達(dá)到了984.56 μmol TE/g DM，二者差異顯著。這與DPPH、Fe3+還原能力的結(jié)果一致，這是由于黑蒜中的多酚含量明顯高于白蒜。

3 結(jié)論

與普通的白蒜相比，黑蒜以其極高的營養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值受到很多消費(fèi)者歡迎。黑蒜加工前后的多酚含量存在顯著差異，經(jīng)發(fā)酵后的黑蒜多酚含量增加了4倍以上，使黑蒜具有更好的抗氧化、抗癌活性。黑蒜加工過程中多酚含量增加，抗氧化能力增強(qiáng)，使得加工后的黑蒜對(duì)DPPH自由基清除能力增加了1倍多。黑蒜加工前后的還原能力與其多酚含量呈正相關(guān)，相同濃度下，經(jīng)發(fā)酵后的黑蒜的還原力明顯高于白蒜；ABTS+清除能力與濃度呈正相關(guān)，黑蒜ABTS+清除率明顯高于白蒜，且隨著樣品濃度的增大清除能力差別明顯。黑蒜加工前后都具有對(duì)氧自由基清除能力，但加工后的黑蒜的清除能力顯著高于白蒜。黑蒜在加工過程中多酚含量增加，加工后的黑蒜對(duì)DPPH的清除率、還原能力、ABTS+自由基清除率及對(duì)氧自由基的清除能力都顯著高于白蒜，表明黑蒜抗氧化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于加工前普通白蒜。本研究結(jié)果為黑蒜研究及發(fā)展提供了理論依據(jù)，并為大蒜市場(chǎng)發(fā)展提供了廣闊前景。

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