張瑞濤,徐 媛,王慶偉

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科,西安 710038)

根皮素是一種被稱為維生素P的類黃酮化合物[1-2],是植物次生代謝產(chǎn)物,化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-(4-羥基苯基)-1-(2,4,6-三羥基苯基)-1-丙酮,包含4個酚羥基,獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了其強大的抗氧化活性[3-5]。根皮素主要存在于蘋果、梨和金橘等水果果皮中[6-9]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,根皮素具有多種生物學(xué)活性,對骨質(zhì)疏松癥具有預(yù)防和治療作用,對心血管硬化、高脂血癥、肥胖癥和阿爾茨海默疾病也有影響[10-16]。

根皮素的不穩(wěn)定性會影響根皮素的研究、生產(chǎn)和推廣應(yīng)用,這也是根皮素相關(guān)制劑在加工和使用過程中一個急需解決的難題。本研究建立了一種簡單、靈敏、快速的測定根皮素含量的HPLC法[17-18],系統(tǒng)研究了溶劑、溫度、pH值和光照對根皮素穩(wěn)定性的影響,為研制穩(wěn)定的根皮素相關(guān)制劑提供強有力的理論依據(jù)[19-20]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司,VWD紫外檢測器)；CP225D型電子分析天平(德國Sartarius有限公司)；HH-1型恒溫水浴箱(北京科偉有限公司)；TGL20M型高速冷凍離心機(湖南湘儀有限公司)；UMV-1型多管漩渦混合器振蕩器(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司)；KH5200DV型超聲儀(浙江昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Milli-Q Advantage A10型超純水機(美國密理博有限公司)。

1.2試藥 根皮素(第四軍醫(yī)大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%)；磷酸(天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；磷酸氫二鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸(西安市長安精細(xì)化工廠)；氫氧化鈉(天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純,美國Tedia公司提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1根皮素HPLC測定方法的建立

2.1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：Inertsil ODS-3(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙腈-水(45∶55)；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量20 μL;流速：1 mL·min-1。 色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

1.根皮素。

Fig.1 HPLC chromatograms

1.phloretin.

2.1.2溶液的配制

2.1.2.1磷酸鹽緩沖液 取磷酸16.6 mL，加水至1 000 mL使溶解,作為A液；取磷酸氫二鈉71.63 g,加水至1 000 mL使溶解,作為B液；取A、B不同體積,混合,精確配制成pH值分別為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0和9.0的系列溶液。

2.1.2.2對照品溶液 精密稱取根皮素對照品10 mg,加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液,即得。

2.1.3線性關(guān)系考察 精密稱取根皮素10 mg,置于100 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為儲備液；取儲備液適量,分別稀釋成質(zhì)量濃度為100,50,25,10,2和1 μg·mL-1的系列溶液。按照2.1.1項下色譜條件,進(jìn)樣20 μL,以峰面積為縱坐標(biāo)y、根皮素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x進(jìn)行線性回歸,得回歸方程y=74.680x+10.087,r=0.999 2,結(jié)果表明,根皮素質(zhì)量濃度在1～100 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4精密度實驗 精密吸取根皮素對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,每次20 μL,按照2.1.1項下色譜條件進(jìn)行測定,測得RSD值為1.06%,結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.2根皮素影響因素的考察 對根皮素進(jìn)行強酸(1 mol·L-1HCl)、強堿(1 mol·L-1NaOH)、強光、強氧化(30 mL·L-1H2O2)、高溫(100 ℃)破壞,初步結(jié)果表明,根皮素在強酸、強光、高溫環(huán)境下較穩(wěn)定,在強堿、強氧化條件下不穩(wěn)定,尤其在強堿下根皮素迅速降解。

2.2.1室溫下根皮素在不同溶液中的穩(wěn)定性實驗 取pH 值分別為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0和9.0的緩沖液及水、0.1 mol·L-1HCl、30 mL·L-1H2O2各100 mL,分別加入根皮素4 mg,超聲處理15 min,振蕩搖勻,以3 000 r·min-1離心10 min,取上清,過濾,分別在0,1,2,4,6,8,12和24 h取樣,微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,按照2.1.1項下色譜條件測定峰面積,用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算溶液中根皮素含量,以質(zhì)量濃度C(μg·mL-1)對時間t作圖。見圖2。

圖2根皮素在室溫下的質(zhì)量濃度變化曲線

Fig.2 The concentration curve of phloretin at room temperature

2.2.235,55和75 ℃下根皮素在不同pH值緩沖液及水中的穩(wěn)定性實驗 實驗結(jié)果表明,根皮素在堿性條件下降解速度較快,因此實驗只考察pH值為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0的緩沖液及水、0.1 mol·L-1HCl和30 mL·L-1H2O2中的不同溫度的穩(wěn)定性,取pH值為3.0,4.0,5.0,6.0和7.0的緩沖液及水、0.1 mol·L-1HCl和30 mL·L-1H2O2各100 mL,分別加入根皮素4 mg,超聲處理15 min,振蕩搖勻,以3 000 r·min-1離心10 min,取上清液置于EP管中,進(jìn)行HPLC測定,作為0 h點,其余分別置于35,55和75 ℃的恒溫水浴中,分別在0,1,2,4,6,8,12和24 h取樣,微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,按照2.1.1項下色譜條件測定峰面積,用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算溶液中根皮素含量,以藥物殘留百分比的自然對數(shù)對時間t作圖。見圖3～5。

由圖3～5可知,根皮素的降解曲線基本符合一級動力學(xué)方程。按照一級動力學(xué)方程,求出不同溫度和pH值下的根皮素的降解反應(yīng)速度常數(shù)K值,見表1。

圖3根皮素在35℃不同pH值緩沖液中的降解曲線

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0。

Fig.3 The degradation curves of phloretin in different pH solutions at 35 ℃

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0.

圖4根皮素在55℃不同pH值溶液中的降解曲線

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0。

Fig.4 The degradation curves of phloretin in different pH solutions at 55 ℃

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0.

圖5根皮素在75℃不同pH值溶液中的降解曲線

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0。

Fig.5 The degradation curves of phloretin in different pH solutions at 75 ℃

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0.

表1降解反應(yīng)速度常數(shù)K

Tab.1 The degradation constantK

溫度/℃H2OHClH2O2pH3.0pH4.0pH5.0pH6.0pH7.0350.0200.0030.0360.0150.0160.0260.0310.072550.0490.0060.6250.0260.0380.0510.1571.463750.0890.0182.2860.0610.0730.1051.3894.403

根據(jù)Arrhenius公式可以求出室溫下的降解反應(yīng)速度常數(shù)K,由其可求出降解10%的時間,即有效期t0.9,求得相同pH值以及不同溶液下的直線方程,見表2。

2.2.3室溫25 ℃下根皮素在不同溶液中的最大溶解度 分別取各溶液10 mL,置于離心管中,加足量的根皮素,然后超聲15 min,振蕩搖勻,以3 000 r·min-1離心10 min,取上清液,濾膜過濾,進(jìn)行HPLC測定,得色譜峰峰面積,以外標(biāo)法計算各個溶液的質(zhì)量濃度,實驗重復(fù)3遍,取平均值。見表3。

表2根皮素水解Arrhenius方程和t0.9

Tab.2 The Arrhenius equation of phloretin hydrolysis andt0.9

項目Arrhenius方程rK(T=298)t0.9(h)H2OLnK=9.1456-4011.7/T0.99680.0133007.900.1mol·L-1HClLnx=9.6078-4773.2/T0.98640.00164664.0030mL·L-1H2O2Lnx=33.224-11194/T0.98420.0130008.08pH3.0LnK=7.8756-3737.9/T0.98740.00940011.20pH4.0LnK=9.1101-4073.8/T0.99890.01000010.00pH5.0LnK=8.4499-3733.1/T0.99840.0170006.22pH6.0LnK=29.344-10146/T0.99280.00900011.60pH7.0LnK=33.708-11112/T0.97440.0278003.78

表3室溫下不同溶劑根皮素的最大溶解度

Tab.3 Maximum solubility of phloretin in different solvents at room temperature

溶劑最大溶解度/μg·mL-1H2O47.40.1mol·L-1HCl25.730mL·L-1H2O225.3pH3.013.6pH4.016.5pH5.017.1pH6.022.2pH7.055.34

3 討論

在影響因素考察實驗中,根皮素在強氧化性條件下不穩(wěn)定,在堿性條件下迅速降解,而其對強酸、強光、高溫較穩(wěn)定。筆者研究了根皮素在pH值為3.0,4.0,5.0,6.0和7.0的緩沖液及水、30 mL·L-1H2O2和0.1 mol·L-1HCl 中的恒溫加速實驗以及室溫下根皮素在不同pH值緩沖液及水溶液、30 mL·L-1H2O2中的最大溶解度。實驗結(jié)果表明,根皮素在酸性環(huán)境下比較穩(wěn)定,根皮素在溶液0.1 mol·L-1HCl,pH3.0,pH4.0,水,pH5.0,pH6.0,30 mL·L-1H2O2,pH 7.0緩沖液中的穩(wěn)定性依次降低,對于根皮素及其相關(guān)產(chǎn)品的研究具有重要意義。

[1] Bentsáth A,Szent-Gy?rgyi A.Vitamin P[J].Nature,1937,140(3540):426.

[2] Rusznyak S,Szentgyorgyi A.Vitamin P:flavonols as vitamins[J].Nature,1936,138(3479):27.

[3] Heim K E,Tagliaferro A R,Bobilya D J.Flavonoid antioxidants:chemistry,metabolism and structure-activity relationships[J].J Nutr Biochem,2002,13(10):572-584.

[4] 陸曉宇,曾耀英,葉燕霞,等.根皮素的抗炎和免疫抑制作用[J].藥學(xué)學(xué)報,2009,44(5):480-485.

[5] Rezk B M,Haenen G R,Van W J,et al.The antioxidant activity of phloretin:the disclosure of a new antioxidant pharmacophore in flavonoids[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,295(1):9-13.

[6] Rezk B M,Haenen G R,Wim V D V,et al.The antioxidant activity of phloretin:the disclosure of a new antioxidant pharmacophore in flavonoids[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,295(1):9-13.

[7] Oresajo C,Stephens T,Hino P D,et al.Protective effects of a topical antioxidant mixture containing vitamin C,ferulic acid,and phloretin against ultraviolet-induced photodamage in human skin[J].J Cosmet Dermatol,2008,7(4):290-297.

[8] Picinelli A,Dapena E,Mangas J J.Polyphenolic pattern in apple tree leaves in relation to scab resistance.A preliminary study[J].J Agric Food Chem,1995,43(8):2273-2278.

[9] Miksicek R J.Interaction of naturally occurring nonsteroidal estrogens with expressed recombinant human estrogen receptor[J].J Steroid Biochem Mol Biol,1994,49(2/3):153-160.

[10]Kim J L,Kang M K,Gong J H,et al.Novel antiosteoclastogenic activity of phloretin antagonizing RANKL-induced osteoclast differentiation of murine macrophages[J].Mol Nutr Food Res,2012,56(8):1223-1233.

[11]Lee E J,Kim J L,Kim Y H,et al.Phloretin promotes osteoclast apoptosis in murine macrophages and inhibits estrogen deficiency-induced osteoporosis in mice[J].Phytomedicine,2014,21(10):1208-1215.

[12]Wang X,Poole R C,Halestrap A P,et al.Characterization of the inhibition by stilbene disulphonates and phloretin of lactate and pyruvate transport into rat and guinea-pig cardiac myocytes suggests the presence of two kinetically distinct carriers in heart cells[J].Biochem J,1993,290 (Pt 1):249-258.

[13]Hassan M,El Y C,Landrier J F,et al.Phloretin enhances adipocyte differentiation and adiponectin expression in 3T3-L1 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,361(1):208-213.

[14]Vasantha Rupasinghe H P,Yasmin A.Inhibition of oxidation of aqueous emulsions of omega-3 fatty acids and fish oil by phloretin and phloridzin[J].Molecules,2010,15(1):251-257.

[15]羅輝,汪亞君,陳杰,等.根皮素誘導(dǎo)肝癌BEL-7402細(xì)胞凋亡[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2008,28(7):1249-1251.

[16]李靜,余燕影,曹樹穩(wěn).根皮素異煙酰基腙的合成、表征及抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2011,23(5):824-827.

[17]暢敏,王慶偉,劉新友,等.反相高效液相色譜法測定根皮素溶解度[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2011,8(32):33-34.

[18]尹貽珍,李燕文,韓慧琴,等.高效液相色譜法測定蘋果花中根皮素含量[J].中南藥學(xué),2016,14(8):871-873.

[19]佘定平,何英,陳欽榜,等.注射用頭孢拉定在25 ℃時的穩(wěn)定性研究[J].西北藥學(xué)雜志,2016,31(1):79-82.

[20]高茹,王江濤.鹽酸伊托必利分散片溶出度與穩(wěn)定性考察[J].西北藥學(xué)雜志,2015,30(4):400-402.