沈文通

(江蘇省阜寧縣危險(xiǎn)化學(xué)品管理辦公室，江蘇 阜寧 224400)

殼聚糖(Chitosan, CTS)是由β(1,4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖(GlcN)和β(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡聚糖(GlcNAc)構(gòu)成的線性天然高分子共聚物，主要通過(guò)甲殼素(Chitin)在濃堿存在下脫乙酰生成[1]。作為唯一的帶有氨基的天然堿性多糖，其pKa值一般為6.2～7.0，并且在水溶液中往往會(huì)表現(xiàn)出典型的弱陽(yáng)離子高分子化合物特征[2]。殼聚糖不但具有優(yōu)良的生物降解性和生物相容性，而且還具有良好的吸附性和生物安全性。同時(shí)，殼聚糖的抗微生物活性、金屬離子螯合性能和游離基捕集性能也優(yōu)于甲殼素[3]。但是，殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中的羥基和氨基在分子鏈上的排布的規(guī)整性及這種規(guī)整性導(dǎo)致的殼聚糖分子鏈間存在的強(qiáng)烈氫鍵作用，使殼聚糖在中性或堿性水溶液中的溶解性顯著下降，這也對(duì)殼聚糖在食品行業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用產(chǎn)生了不利影響[4]。為克服這一不足，并結(jié)合食品行業(yè)的特點(diǎn)和要求，人們提出了多種方法用于殼聚糖的改性，以制備具有良好水溶性的殼聚糖衍生物，其中通過(guò)殼聚糖降解制備水溶性的甲殼低聚糖(也稱殼寡糖，Chito-oligosaccharides)得到廣泛研究。

與殼聚糖相比，甲殼低聚糖不但有更低的分子量，而且分子結(jié)構(gòu)中羥基和氨基在分子鏈上排布的規(guī)整性和分子鏈間的氫鍵作用顯著降低，因而可在水溶液中表現(xiàn)出良好的溶解性[5]。同時(shí)，甲殼低聚糖在保持了殼聚糖具有的生物降解性、生物相容性和生物安全性外，還具有更好的抗氧、防腐、抗腫瘤等活性[6～10]。本文主要對(duì)通過(guò)過(guò)氧化氫直接氧化降解法制備甲殼低聚糖的方法及其影響因素進(jìn)行研究，并對(duì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料與儀器

殼聚糖：生化試劑，脫乙酰度90.84%(電位滴定法測(cè)定)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；30%過(guò)氧化氫：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：化學(xué)純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；鹽酸：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

紅外光譜分析儀：Nicolet 670型，美國(guó)Nicolet 公司；核磁共振分析儀：DRX500型，BRUKER公司(瑞士)。

1.2 甲殼低聚糖的制備

將4.1 g CTS和120 mL蒸餾水加入到四口反應(yīng)瓶中并攪拌分散，再在室溫下由滴液漏斗向反應(yīng)瓶慢慢滴加一定體積質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為30%的H2O2水溶液，滴加過(guò)程中控制物料溫度不高于40 ℃；H2O2水溶液滴加完畢后，水浴加熱物料使其升至設(shè)定溫度，并恒溫反應(yīng)一定時(shí)間；反應(yīng)完成后，對(duì)反應(yīng)物料進(jìn)行過(guò)濾，并將得到的濾液濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上于減壓條件下濃縮，直到物料呈粘稠的淺黃綠色液體。攪拌下將濃縮后的物料緩慢加入到50mL無(wú)水乙醇中，待析出的淺黃白色沉淀物聚集成團(tuán)后，再將乙醇液分出。向析出的黏結(jié)成團(tuán)的沉淀物中再加入30 mL無(wú)水乙醇，并研磨脫水(重復(fù)數(shù)次，直至黏結(jié)成團(tuán)的沉淀物完全轉(zhuǎn)化為黃白色粒狀物)；抽濾并將得到的淡黃白色粒狀物料置于冷凍干燥器中干燥，即得到水溶性甲殼低聚糖。

1.3 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

用KBr壓片法對(duì)殼聚糖和甲殼低聚糖進(jìn)行FT-IR分析，以D2O和TFA-D2O分別作溶劑對(duì)甲殼低聚糖和殼聚糖進(jìn)行1H NMR分析。

1.4 產(chǎn)物的脫乙酰度測(cè)定

利用雙突躍電位滴定法測(cè)定產(chǎn)物的脫乙酰度，過(guò)程如下：準(zhǔn)確稱量一定量的干燥至恒重的甲殼低聚糖樣品，并用過(guò)量的HCl溶液溶解；用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，并作出溶液pH隨NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的變化曲線；根據(jù)pH～VNaOH曲線，作出其一級(jí)微商關(guān)系曲線，并通過(guò)兩突變點(diǎn)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積差，按式(1)計(jì)算甲殼低聚糖的脫乙酰度α。

(1)

式中：△v為兩突變點(diǎn)間的消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液體積差(mL)；CNaOH為標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液的濃度(mol·L-1)；m為水溶性甲殼低聚糖樣品質(zhì)量(g)；16為氨基的相對(duì)摩爾質(zhì)量；0.0994為完全脫乙酰甲殼低聚糖中氨基的理論含量。

2結(jié)果和討論

2.1 H2O2水溶液用量對(duì)水溶性甲殼低聚糖收率的影響

在反應(yīng)溫度為60℃和保溫時(shí)間為7.0 h條件下，考察了質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為30%的H2O2水溶液對(duì)水溶性甲殼低聚糖收率的影響，其結(jié)果見表1。

表1 不同H2O2水溶液用量時(shí)水溶性甲殼低聚糖的收率Table 1 Effect of H2O2 dosage on the yieldof water-soluble chito-oligosaccharides

由表1可以看出，在一定范圍內(nèi)H2O2水溶液用量的增加有利于殼聚糖降解生成水溶性甲殼低聚糖，但用量過(guò)大也會(huì)由于其對(duì)氨基氧化能力的提高而導(dǎo)致產(chǎn)物被部分進(jìn)一步氧化而轉(zhuǎn)化為其它非水溶性甲殼低聚糖等物質(zhì)。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)水溶性甲殼低聚糖收率的影響

在保溫時(shí)間為7.0 h和30% H2O2水溶液用量為12.0 mL條件下，考察了反應(yīng)溫度對(duì)水溶性甲殼低聚糖收率的影響，其結(jié)果見表2。

表2 不同反應(yīng)溫度下水溶性甲殼低聚糖的收率Table 2 Effect of reaction temperature on theyield of water-soluble chito-oligosaccharides

由表2可知，在40～70 ℃范圍內(nèi)，溫度的提高有利殼聚糖轉(zhuǎn)化為水溶性甲殼低聚糖；反應(yīng)溫度達(dá)80 ℃時(shí)，產(chǎn)物的收率會(huì)顯著下降。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，40～60 ℃范圍內(nèi)得到的產(chǎn)物為淺白色或淺黃白色，70 ℃時(shí)的產(chǎn)物為黃色，而80 ℃時(shí)的產(chǎn)物為棕黃色，這說(shuō)明過(guò)高的反應(yīng)溫度會(huì)導(dǎo)致氧化副反應(yīng)發(fā)生程度明顯提高。

2.3 保溫時(shí)間對(duì)水溶性甲殼低聚糖收率的影響

在反應(yīng)溫度為60℃和30% H2O2水溶液用量為12.0 mL條件下，考察了保溫時(shí)間對(duì)水溶性甲殼低聚糖收率的影響，其結(jié)果見表3。

表3 不同保溫時(shí)間時(shí)水溶性甲殼低聚糖的收率Table 3 Effect of reaction time on the yieldof water-soluble chito-oligosaccharides

由表3 可知，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間總體上對(duì)提高水溶性甲殼低聚糖的收率是有利的，但以7.0～8 h 為宜；但是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)7 h后，反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)提高水溶性甲殼低聚糖的收率已經(jīng)影響較小了。

2.4 水溶性甲殼低聚糖脫乙酰度測(cè)定結(jié)果

通過(guò)雙突躍電位滴定法測(cè)定產(chǎn)物脫乙酰度時(shí)得到的pH～VNaOH曲線見圖1，對(duì)應(yīng)的一級(jí)微商關(guān)系曲線見圖2。

圖1 pH～VNaOH關(guān)系曲線Fig 1 Relationship curve of pH versus VNaOH

圖2 一級(jí)微商關(guān)系曲線Fig 2 Relationship curve of first derivative

根據(jù)一級(jí)微商關(guān)系曲線中兩突變點(diǎn)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積差，按式(1)計(jì)算得到的水溶性甲殼低聚糖的脫乙酰度α為85.61%。此值較之于未降解的殼聚糖有所下降，其原因可能與H2O2在反應(yīng)過(guò)程中使殼聚糖間的糖苷鍵發(fā)生斷裂時(shí)，也部分使殼聚糖結(jié)構(gòu)中的氨基發(fā)生了轉(zhuǎn)化。

2.5 水溶性甲殼低聚糖FT-IR測(cè)定結(jié)果及其歸屬

殼聚糖及水溶性甲殼低聚糖FT-IR圖見圖3。

圖3 殼聚糖及水溶性甲殼低聚糖的FT-IR圖Fig 3 FT-IR spectra of CTS and water-solublechito-oligosaccharides

由圖3可以看出，水溶性甲殼低聚糖FT-IR圖中的主要吸收峰在殼聚糖的FT-IR圖中基本都出現(xiàn)，但其主吸收峰數(shù)少于殼聚糖，說(shuō)明H2O2氧化降解殼聚糖制備水溶性甲殼低聚糖過(guò)程中，糖單元的基本結(jié)構(gòu)變化較小。但由于降解反應(yīng)中存在糖苷鍵的斷裂及H2O2對(duì)殼聚糖結(jié)構(gòu)中氨基的作用，會(huì)使殼聚糖FT-IR圖中原有反映糖苷鍵、羥基和氨基的吸收峰出現(xiàn)位置及強(qiáng)度有部分程度的變化。

2.6 水溶性甲殼低聚糖1H NMR測(cè)定結(jié)果及其歸屬

殼聚糖及水溶性甲殼低聚糖的1H NMR圖分別見圖4和圖5。

圖4 殼聚糖1H NMR圖Fig 4 1H NMR spectrum of CTS

圖5 水溶性甲殼低聚糖1H NMR圖Fig 5 1H NMR spectrum of water-solublechito-oligosaccharides

從圖4和圖5可以看出，殼聚糖與水溶性甲殼低聚糖的1H NMR圖存在一定差異。在殼聚糖的1H NMR圖中，4.83和3.12 ppm處的峰分別對(duì)應(yīng)于氨基葡萄糖單元C1和C2上H，3.50、3.70和3.86 ppm處的峰則對(duì)應(yīng)于糖單元中C3、C4、C5和C6上H，2.68 ppm處的峰對(duì)應(yīng)于乙酰氨基葡萄糖單元C2上H，2.01 ppm處的峰對(duì)應(yīng)于乙酰胺基中甲基上H，8.41ppm處的峰對(duì)應(yīng)于糖單元在水中部分鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)中醛基H。在水溶性甲殼低聚糖的1H NMR圖中，8.44ppm處的峰高明顯增大，說(shuō)明殼聚糖降解后生成的產(chǎn)物中有更多的鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)成分存在；殼聚糖氨基葡萄糖單元C1和C2上H對(duì)應(yīng)的峰則分別在4.71和3.16 ppm處出現(xiàn)，反映糖單元中C3、C4、C5和C6上H對(duì)應(yīng)的峰則分別出現(xiàn)在3.66～4.09 ppm處，反映乙酰胺基中甲基上H的峰出現(xiàn)在2.06 ppm處，而在1.18 ppm處出現(xiàn)的峰應(yīng)為殼聚糖降解生成的產(chǎn)物中亞甲基上的H。

3結(jié) 論

以H2O2為氧化劑，在中性介質(zhì)中可使殼聚糖氧化降解為水溶性甲殼低聚糖，并且H2O2用量、反應(yīng)溫度和保溫時(shí)間對(duì)產(chǎn)物收率存在影響，過(guò)高的反應(yīng)溫度和H2O2用量都不利于水溶性甲殼低聚糖的生成；與殼聚糖相比，產(chǎn)物的脫乙酰度有一定降低，且水溶性甲殼低聚糖產(chǎn)物中含醛基的鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)組成明顯高于殼聚糖；在H2O2用量為3.0～3.5 mL(30%H2O2)/g(CTS)，反應(yīng)溫度和保溫時(shí)間則分別為60 ℃和7.0～8 h的條件下，水溶性甲殼低聚糖的收率可達(dá)90%左右。

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