張玉婷，文美瓊

(楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000)

多糖類化合物是一類重要的廣泛存在于自然界的有機化合物，是目前備受關(guān)注的產(chǎn)物之一。植物多糖具有廣泛的藥理作用，參與機體各種生理代謝，具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、抑制腫瘤、抗衰老、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化等多種生物活性[1―2]。

野壩子(Elsholtziarugulosa)是一種非常常見的植物，還是一種藥食同源的植物，來源非常廣泛。野壩子是漢藥名，它有許多種叫法，如：野壩蒿、野拔子、野蘇草、野香蘇、小鐵蘇、夸巴脂、草拔子、掃把茶、草芝麻蒿、皺葉香薷等等。野壩子始載于《中國彝藥學(xué)》，在《全國中藥匯編》中記載了它的藥效[3]。其味辛、性涼，具疏風(fēng)解表，利濕、消食化積等功效。用于治療四季感冒、咽喉炎、消化不良、腹?jié)M脹痛、泄瀉、急性腸炎、潰爛瘡瘍、中耳炎等[4]。

迄今為止，有不少學(xué)者對野壩子進行了許多研究，如：野壩子微量元素分析[4]、紅外光譜分析[5]、化學(xué)成分分析[6]，總黃酮的提取及對活性氧自由基的清除作用[3]等，但對其中的多糖含量的研究尚未見報道。本文對野壩子中多糖的含量進行測定，旨在為它的綜合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料、試劑和儀器

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

樣品野壩子于2014年12月采自云南楚雄西山。

1.1.2 試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(南京春秋生物工程有限公司)，活性炭、石油醚、無水乙醇、苯酚、硫酸、鋁粉、碳酸氫鈉、丙酮等均為分析純，水為楚雄師范學(xué)院實驗室自制超純水。

1.1.3 儀器

SHZ-A(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵(河南省豫華儀器有限公司)；Alpha-1502型紫外可見分光光度計(上海譜元儀器有限公司)； HH-2型恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；80-2離心機、202-2型干燥箱(中華人民共和國上海市實驗儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 原料處理

將野壩子地上部分自然晾干， 60℃烘干，將其用粉碎機粉碎，樣品密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 多糖的測定[7―10]

2.2.1 多糖的提取與精制

準(zhǔn)確稱取野壩子地上部分樣品粗粉5.0000g，用濾紙包好。先加入石油醚80mL，水浴回流1h，樣品再用80mL80%乙醇水浴回流1h，在室溫條件下?lián)]干乙醇；將揮干乙醇的樣品回流提取三次(1h、1h、0.5h)，每次加入超純水80mL。用抽濾機趁熱抽濾，將三次濾液合并，用活性炭脫色大約半小時，又抽濾，將濾液水浴濃縮至40mL，流水冷卻，然后定容到50mL容量瓶中制得提取液；用吸量管精確吸取1mL提取液放于離心試管中，然后加入7mL無水乙醇，攪拌，離心(4000r/m， 10min)，棄去上層清液，用熱水溶解沉淀，定容至10mL，制得樣品液。

精密稱取鐵皮石斛樣品粗粉3.0000g，按“多糖的提取”方法進行提取，濾液濃縮至80mL，加入無水乙醇至溶液含醇80%，靜置過夜。過濾，用無水乙醇、丙酮依次洗滌沉淀，制得多糖精制品，60℃烘干1h后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 提取液中多糖的定性檢驗

吸取1mL提取液置于試管中，先加入幾滴5%的苯酚溶液，搖勻后加入幾滴濃硫酸，再搖勻，結(jié)果溶液出現(xiàn)棕色環(huán)，說明野壩子的提取液中含有多糖。

2.2.3 苯酚、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取苯酚100g， 鋁粉0.10g和碳酸氫鈉0.05g，混勻后常壓蒸餾，用溫度計測量溫度，收集182℃的餾分。稱取餾分5g，然后加入100mL超純水混勻后，將其轉(zhuǎn)移到棕色試劑瓶中，制得5%的苯酚溶液。

精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1000g，溶解并定容于100mL容量瓶中。用吸量管精密吸取10mL溶液置于100mL容量瓶中定容并搖勻，即得濃度為100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.4 測定波長的選擇

測得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液最大吸收波峰分別在490nm和485nm處，故確定試驗的測定波長為490nm。

2.2.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、0.70mL分別置于8支比色管中，分別向這八支比色管中加入超純水至2.00mL，按照上面“測定波長的選擇”進行顯色，以試劑空白為參比，在490nm處測定吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。

求得葡萄糖含量c (μg/mL)與吸光度A間的回歸方程為：A = 0.0125c + 0.0023 ，R2= 0.9992，表明葡萄糖濃度在0―35μg/mL范圍內(nèi)與吸光度A呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 顯色穩(wěn)定性實驗

吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品液各0.40mL，加超純水至2.00mL，按照上面“測定波長的選擇”來進行顯色，分別測定0min、5min、10min，直至60min的吸光度。

結(jié)果表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品液顯色后在60min內(nèi)其吸光度值變化不大，具有一定的穩(wěn)定性。葡萄糖顯色溶液在20―35min的時間內(nèi)其吸光度值不變，樣品顯色液在15―40min的時間內(nèi)其吸光度值不變，因此選擇在顯色26min后來測定溶液的吸光度。

1)當(dāng)NH(q)>Q*時，收益表達(dá)式為(36)，對公式(36)分別求q，α，β三者的一、二階導(dǎo)數(shù)，求解最優(yōu)的訂貨量以及彈性系數(shù).

2.2.7 測定換算因數(shù)

精確稱取烘干后的多糖精制品0.0106g、0.0105g、0.0104g三份，分別定容到50mL容量瓶中制得溶液。分別用2mL吸量管分別精取多糖溶液1.7mL，加超純水至2mL，按照上面“測定波長的選擇”處的做法來進行顯色，重復(fù)做三次取平均值。

換算因數(shù)計算公式如下：

F = M/(C·D)

M為多糖質(zhì)量；

C為多糖液中的葡萄糖濃度；

D為多糖的稀釋倍數(shù)。

根據(jù)以上計算公式，計算結(jié)果換算因數(shù)F為5.46。

2.2.8 多糖含量的測定(重復(fù)性試驗)

分別用1mL吸量管精確吸取樣品液0.50mL置于比色管中，加超純水至2.00mL，按照上面“測定波長的選擇”的做法來進行顯色，測定其吸光度，每個樣品液平行顯色三次取平均值。計算樣品中多糖的含量。

M多糖= F × M葡萄糖

表1 多糖含量

計算結(jié)果為野壩子多糖含量為7.96%，RSD為0.24%，說明重復(fù)性較好。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗

用吸量管精確吸取樣品液0.50mL置于比色管中，加超純水至2.00mL，按照上面“測定波長的選擇”的做法來進行顯色，測定吸光度，平行測定5次。

表2 精密度試驗結(jié)果

測定結(jié)果見表2，計算RSD為0.26%，表明精密度好。

2.3.2 加標(biāo)回收率試驗[11]

精確稱取野壩子地上部分粗粉三份，質(zhì)量分別為5.0005g，5.0004g，5.0009g，分別向其中加入一定質(zhì)量的多糖精制品，用濾紙包好，如“多糖的提取”操作，制得3份待測液。分別向三份待測液中吸取一定體積的溶液，按照上面“測定波長的選擇”的做法來進行顯色，測定其吸光度，每份待測液平行顯色三次，取其吸光度平均值計算。

表3 回收率實驗結(jié)果

由表3表明，樣品回收率在90.02%到94.51%之間，表明準(zhǔn)確度較高。

3 結(jié)論

本實驗通過回流提取法來提取野壩子中的多糖，利用苯酚-濃硫酸顯色法，根據(jù)吸光度與葡萄糖濃度成線性關(guān)系成正比，以此來測定其含量。結(jié)果測得野壩子中的多糖含量為7.96%，試驗結(jié)果的重復(fù)性好( RSD=0.24%，n=8)，精密度高(RSD=0.26%，n=5)，準(zhǔn)確度也較高(樣品回收率在90.02%到94.51%之間，RSD=1.43%，n=3)。

[1]鄭永飛.活性多糖的保健功能及其應(yīng)用[J].糧食與食品工業(yè)，2009，16(4):22―25.

[2]申利紅，王建森，李雅，等.植物多糖的研究及應(yīng)用進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報.2011， 27(2):349―352.

[3]文美瓊，李璐，楊申明，等.彝藥野壩子花總黃酮的提取及對活性氧自由基的清除作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21(6):1444―1445.

[4]楊永壽，肖培云，董光平，等. 白族藥野壩子的微量元素分析[J]. 微量元素與健康研究，2002，19(3):34―35.

[5]張麗梅，王怡林，董勤，等.彝藥野壩子FTIR光譜分析[J].楚雄師范學(xué)院學(xué)報，2005， 20(6):27.

[6]趙勇，李慶春，趙焱，等.野壩子的化學(xué)成分研究[J]. 中國中藥雜志，2004，29(12)：1144.

[7] 文美瓊，李璐，楊申明，等.龍陵縣不同時期鐵皮石斛不同部位多糖及生物堿含量比較分析[J]. 中國民族民間醫(yī)藥，2015，24(10):15―17.

[8]張惟杰主編.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)(第二版)[M].杭州:浙江大學(xué)出版社，1998.

[9]董群，鄭麗伊，方積軍.改良的苯酚-硫酸法測定多糖和寡糖含量研究[J].中國藥學(xué)雜志，1996，31(9):550―552.

[10]高麗君，王漢忠，崔建華，等.苯酚-硫酸法測定白首烏中多糖含量[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2004，35(2):295―297.

[11]聶國朝.中藥木瓜多糖的提取分離及含量測定[J].微量元素與健康研究，2003，20(5):30―38.