王安遠+丁健+李志杰+吳利敏

[摘要] 目的 探討Cyr61在增生性瘢痕成纖維細胞及正常皮膚成纖維細胞中表達差異及其意義。方法 取自愿捐獻的增生性瘢痕及正常皮膚標本，采用組織塊法進行原代成纖維細胞培養(yǎng)。采用實時定量PCR法及細胞免疫熒光法檢測Cyr61在兩種細胞中的表達。結(jié)果 在mRNA水平及蛋白水平上，Cyr61在增生性瘢痕成纖維細胞中的表達均高于正常皮膚成纖維細胞。結(jié)論 Cyr61在增生性瘢痕形成過程中可能存在一定的作用，可能通過調(diào)節(jié)膠原代謝以及調(diào)節(jié)成纖維細胞增殖影響增生性瘢痕的形成。

[關(guān)鍵詞] Cyr61；增生性瘢痕；成纖維細胞；創(chuàng)面愈合

[中圖分類號] R622 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）30-0037-04

[Abstract] Objective To observe the differential expression and significance of Cyr61 in hypertrophic scar and normal skin fibroblasts， and to explore its significance. Methods The hypertrophic scar and normal skin specimens voluntarily donated were taken. Primary fibroblasts were cultured using tissue block method. The expression of Cyr61 in two kinds of cells was detected by real-time quantitative PCR and immunofluorescence. Results The expression of Cyr61 in hypertrophic scar fibroblasts was higher than that in normal skin fibroblasts at mRNA level and protein level. Conclusion Cyr61 may have a role in the formation of hypertrophic scars， which may affect the formation of hypertrophic scars by regulating collagen metabolism and regulating fibroblast proliferation.

[Key words] Cyr61； Hypertrophic scar； Fibroblasts； Wound healing

增生性瘢痕是以成纖維細胞過度增殖分化以及細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）過度沉積為特征的皮膚纖維化疾病，探索皮膚過度纖維化的機制以及控制纖維化進程成為防治增生性瘢痕的焦點。Cyr61屬于CNN家族的一員，是一種分泌性的基質(zhì)細胞蛋白。目前多數(shù)研究認為Cyr61在內(nèi)皮細胞及皮膚成纖維細胞中參與細胞的粘附、遷移以及細胞外基質(zhì)的合成[1-3]。在創(chuàng)面的愈合過程中，Cyr61在成纖維細胞中呈現(xiàn)動態(tài)的表達，并可通過誘導(dǎo)成纖維細胞衰老產(chǎn)生抗纖維化作用[4]。本研究采用realtime-PCR、細胞免疫熒光以及WesternBlot技術(shù)，檢測Cyr61在增生性瘢痕及正常皮膚成纖維細胞中mRNA及蛋白表達情況，以探討其與增生性瘢痕發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（美國Gibco公司），Dispase（日本Sanko公司），兔抗人CYR61多克隆抗體（美國Abcam公司），Trizol（美國Invitrogen公司），SYBR Green PCR試劑盒（上海達為科生物科技公司），Real-timePCR檢測儀（美國ABI公司），低溫冷凍離心機（美國Sigma公司），激光共聚焦顯微鏡（日本OLMPUS公司）。

1.2 標本來源

增生性瘢痕組織分別來自我院3例臨床瘢痕增生患者，其中男2例，女1例，年齡15、16、20歲，標本分別取自于大腿外側(cè)2例及前臂1例，瘢痕生長時間不超過1年。正常皮膚組織分別取自正常人群大腿2例和上臂1例，年齡16、18、21歲，男2例，女1例。

1.3 細胞培養(yǎng)

無菌條件下，用PBS液沖洗組織塊3遍，剪棄脂肪和結(jié)締組織。用刀片割成1～2 mm寬的小皮條，置于培養(yǎng)皿中，加入2.0 U/mL的DispaseⅡ，4℃中冷消化，16～18 h后分離表皮真皮，將表皮剪成1～2 mm3的小組織，放入培養(yǎng)瓶中，加入3～5 mL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在環(huán)境設(shè)為37℃、含5 %CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換次培養(yǎng)液。培養(yǎng)5～7 d可見成纖維細胞，爬滿瓶底后用 0.25%胰蛋白酶消化傳代。本實驗取第3～5代的成纖維細胞進行。

1.4 總RNA提取及實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測Cyr61的表達

按照Trizol試劑說明書提取正常成纖維細胞和增生性成纖維細胞總RNA，用DEPC處理過的蒸餾水溶解。采用德國EPPENDORF公司分光光度計檢測RNA溶液A260/A280吸光度，計算RNA濃度和純度，A260/A280比值>1.8方可用于檢測，1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。依據(jù)real-time PCR試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA模板，進行目的基因的 PCR擴增， 產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙酰胺凝膠電泳分析。所有反應(yīng)均設(shè)立3復(fù)孔，記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達所設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值。以GAPDH作為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對定量法，以2-ΔCt表示目的基因相對于內(nèi)參的相對表達量，其中ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH。熒光定量PCR的反應(yīng)體系與條件： 95℃ 預(yù)變性10 min ， 1 個循環(huán)， 95℃、變性 30 s ， 退火 40 s，72 ℃延伸 40 s ， 共 45 個循環(huán)。本實驗應(yīng)用到的引物：Cyr61 正向 5CTCCCTGTTTTTGGAATGGA3，負向5TGGTCTTGCTGCATTTCTTG3；GAPDH 正向5GAGTCAACGGATTTGGTCGT3，負向5TTGATTTTGGAGGGATCT CG3。endprint

1.5 細胞免疫化學(xué)檢測Cyr61蛋白的表達

正常皮膚細胞及增生性瘢痕細胞種植于放有蓋玻片的6孔板，用4%的多聚甲醛于室溫固定10 min，用PBS沖洗三次，在常溫利用0.2%Triton X-100透化5 min。沖洗后用5%的BSA封閉30 min，1：50的兔抗人Cyr61抗體孵育過夜。清洗后，用1：50稀釋的結(jié)合FITC的山羊抗兔抗體避光常溫孵育1 h。用PBS清洗后，將蓋玻片取出，置于滴有緩沖甘油的載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS）觀察，發(fā)射光波長495 nm，激發(fā)光波長488 nm。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用 t 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 增生性瘢痕及正常皮膚成纖維細胞中Cyr61的mRNA檢測

為檢測Cyr61的mRNA表達水平，我們利用實時PCR分析。本實驗增生性瘢痕Cyr61mRNA的表達高于正常皮膚（P<0.05），見封三圖1。

2.2 增生性瘢痕及正常皮膚成纖維細胞中Cyr61的檢測

Cyr61在胞質(zhì)表達后與一抗、二抗結(jié)合，在藍光激發(fā)下發(fā)射出綠光，在顯微鏡下顯示成綠色，綠光強度越高代表細胞中Cyr61的含量也多，每一蓋玻片任意取6個視野拍照，再運用IMAGE-PRO PLUS軟件對圖像進行分析，計算出綠光的平均光強度，比較兩種細胞中Cyr61的表達差異。增生性瘢痕成纖維細胞Cyr61表達量明顯高于正常皮膚成纖維細胞（P<0.05），見封三圖2～6。

3 討論

增生性瘢痕的形成包括遺傳、炎癥、免疫、細胞因子等多種因素。增生性瘢痕的特點是在皮膚創(chuàng)傷愈合后仍持續(xù)發(fā)生的真皮纖維結(jié)締組織增生，組織學(xué)上以Ⅰ型膠原為主的細胞外基質(zhì)過度沉積、成纖維細胞過度增生為特點[5-7]。對成纖維細胞的增殖進行干預(yù)，調(diào)控膠原的合成，加速膠原的降解，進而治療膠原紊亂引起的各類纖維化疾病在理論上是可行的，在臨床中也取得了一定的療效。

目前的研究發(fā)現(xiàn)Cyr61參與多種病理生理過程，具有明顯的促有絲分裂活性和趨化性，可誘導(dǎo)成纖維細胞增殖和分泌細胞外基質(zhì)，并參與調(diào)解細胞增生、分化、胚胎發(fā)育形成[8，9]。成人Cyr61的表達與組織的炎癥及創(chuàng)傷修復(fù)是相關(guān)的，在皮膚創(chuàng)面愈合過程中，其與TGF-β在創(chuàng)傷修復(fù)中所介導(dǎo)的通路可以是相互疊加，相互抵抗，相互協(xié)助的。作為細胞外基質(zhì)結(jié)合信號蛋白，Cyr61與整合素受體結(jié)合介導(dǎo)粘附信號、細胞遷移及增強生長因子誘導(dǎo)的有絲分裂。它不僅在血管內(nèi)皮細胞中通過直接結(jié)合整合素αvβ3誘導(dǎo)血管生成，而且在肌成纖維細胞增殖并合成細胞外基質(zhì)以保持組織的完整性以及幫助提供抗菌的屏障，它們甚至能合成α-肌動蛋白促進創(chuàng)口攣縮加速創(chuàng)口愈合[10-12]，Cyr61在這一時期的肌成纖維細胞中表達明顯增高，當 Cyr61積累達到相當高的水平時表現(xiàn)為促進肌成纖維細胞衰老[13，14]，在創(chuàng)面愈合后期這一促衰老的過程表現(xiàn)為對細胞外基質(zhì)合成及沉積的自我限制[15， 16]，以避免細胞外基質(zhì)的過度合成沉積所致的過度纖維化，瘢痕化及功能喪失。

本實驗中，Cyr61 mRAN及Cyr61蛋白在增生性瘢痕成纖維細胞中的表達均明顯高于正常皮膚成纖維細胞。創(chuàng)面的損傷以及修復(fù)過程中，細胞外基質(zhì)分泌沉積及塑形，創(chuàng)面在肌成纖維細胞的作用下開始攣縮，此時創(chuàng)面新生的肉芽組織成纖維細胞中的Cyr61就會明顯增高[17]。而創(chuàng)面修復(fù)完成后，成纖維細胞增殖過度，肉芽組織就會轉(zhuǎn)化為瘢痕組織，該瘢痕組織中Cyr61的高表達，表明其在增加細胞外基質(zhì)分泌及促進瘢痕形成中起到一定作用。有學(xué)者研究證實Cyr61參與成纖維細胞的增殖以及細胞外基質(zhì)的沉積是通過結(jié)合細胞膜上的整合素αvβ3，故在瘢痕的形成過程中，Cyr61可能通過相同的細胞內(nèi)信號通路促使成纖維細胞增殖從而導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的分泌與沉積[12，18，19]。Cyr61在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的肉芽組織中表達明顯增高，且Cyr6通過結(jié)合成纖維細胞粘附受體（整合素α6β1及細胞表面的肝磷脂蛋白聚糖），依賴p-53及p16INK4a介導(dǎo)衰老的信號途徑誘導(dǎo)成纖維細胞衰老，在創(chuàng)面愈合后期該過程則表現(xiàn)為對細胞外基質(zhì)分泌及沉積的自我限制，以避免細胞外基質(zhì)的過度沉積所致的纖維化、瘢痕化及功能喪失。

有學(xué)者認為[20]Cyr61在膠原的合成和降解中起著關(guān)鍵作用，其在成纖維細胞中能使膠原Ⅰ的減少而金屬蛋白酶Ⅰ表達增多。我們的結(jié)果顯示，Cyr61在增生性瘢痕的表達較正常皮膚中減少，考慮其具有降解膠原的作用，而增生性瘢痕是膠原過度沉積所致，故我們推測可能是Cyr61下游通路某種因子缺失或無表達所致的一種負反饋。在本次試驗并未對Cyr61的下游信號通路受體進行檢測，對該解釋仍需進一步進行試驗研究。

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（收稿日期：2017-08-08）endprint