劉效栓++肖正國(guó)++羅燕燕++李喜香++李季文++畢映燕++劉軍剛

摘要：目的 建立指紋圖譜與一測(cè)多評(píng)相結(jié)合的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式分析化學(xué)轉(zhuǎn)化法富集的甘草藥渣總黃酮，為生產(chǎn)中質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。方法 以破壁富集的總黃酮為研究對(duì)象建立指紋圖譜，以甘草苷為內(nèi)參物，分別建立異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草酸的相對(duì)校正因子，計(jì)算其含量。并對(duì)計(jì)算值與外標(biāo)法測(cè)定值進(jìn)行比較，以驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的實(shí)用性與穩(wěn)定性。結(jié)果 建立了甘草藥渣總黃酮HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了11個(gè)共有峰，確定了其中5個(gè)共有峰，10批提取物相似度>0.99；一測(cè)多評(píng)法計(jì)算結(jié)果與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值之間相對(duì)誤差<4%，以多濃度法計(jì)算試驗(yàn)所得相對(duì)校正因子RSD<2%。結(jié)論 本方法準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，可有效控制甘草藥渣提取物的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：指紋圖譜；一測(cè)多評(píng)；甘草藥渣提取物；質(zhì)量評(píng)價(jià)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.015

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）01-0069-05

Study on Enrichment of Total Flavonoids from Licorice Residue by Chemical Conversion Method Based on Fingerprint and Quantitative Analysis of Multi-components with

a Single-marker Technique

LIU Xiao-shuan1， XIAO Zheng-guo1， LUO Yan-yan2， LI Xi-xiang1， LI Ji-wen1， BI Ying-yan1， LIU Jun-gang1

1. Pharmacy Department of Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China；

2. Pharmacy College of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To establish a combined quality evaluation model of fingerprint and quantitative analysis of multi-components with a single-marker （QAMS） to analyze the total flavonoids from licorice residue by the chemical conversion method； To provide technical support for quality control in production. Methods Total flavonoids of breaking cell wall and enriching were taken as the object of study to establish fingerprint. With liquiritin as internal reference， the relative correction factors of isoliquiritin， glycyrrhizin， isoliquiritigenin and glycyrrhizic acid were established respectively， and the contents were determined. Meanwhile， the calculated values were compared with the measured value by external standard method to verify the practicability and stability of QAMS. Results The HPLC fingerprint of total flavonoids from licorice residue was established. 11 common peaks were identified， and 5 common peaks were identified， and the similarity of the 10 extracts was >0.99； the relative error between the calculated results of QAMS and the measured values of the external standard method was <4%； the RSD of relative correction factor calculated by the multiple concentration method was <2%. Conclusion The method is accurate， reliable， specific， and stable， with good repeatability， which can be used for the quality control of total flavonoids from licorice residue.

Keywords： fingerprint； quantitative analysis of multi-components with a single-marker； licorice residue extract； quality evaluationendprint

中藥指紋圖譜指中藥經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析方法得到的能夠體現(xiàn)中藥整體化學(xué)特性的色譜

基金項(xiàng)目：蘭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（蘭州市科技局2014-2-32）

或光譜圖。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）新收載特征圖譜28個(gè)品種，其中提取物3個(gè)品種、中藥材2個(gè)品種、中成藥23個(gè)品種；新收載指紋圖譜9個(gè)品種，均為中成藥品種[1-3]。目前，指紋圖譜已廣泛應(yīng)用到藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別及新藥生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制中[4-6]。對(duì)于市場(chǎng)上通過(guò)加入單一成分達(dá)到現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的偽藥，采用指紋圖譜進(jìn)行多成分的全面控制切實(shí)可行。

一測(cè)多評(píng)方法（QAMS）又稱一標(biāo)多評(píng)法，是指在含量測(cè)定時(shí)，只使用一個(gè)對(duì)照品，可同時(shí)計(jì)算出供試品中其他待測(cè)成分的含量，使其計(jì)算值與實(shí)測(cè)值符合定量方法學(xué)研究的要求。目前，美國(guó)藥典（USP33）收載的108個(gè)植物藥標(biāo)準(zhǔn)（13種植物）中36個(gè)使用校正因子，歐洲藥典（EP7.0）在232個(gè)植物藥標(biāo)準(zhǔn)中11個(gè)使用了一測(cè)多評(píng)，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》593個(gè)植物藥標(biāo)準(zhǔn)（9種植物）通過(guò)相對(duì)保留時(shí)間及對(duì)照藥材（或?qū)φ仗崛∥铮┑奶卣鲌D譜確認(rèn)色譜峰，進(jìn)而根據(jù)相對(duì)因子計(jì)算其他色譜峰的含量[7]，如黃連（小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬亭含量測(cè)定）、丹參、生姜、銀杏提取物等。

甘草具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效。隨著對(duì)甘草藥理作用的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，全世界對(duì)甘草的需求日益增長(zhǎng)，甘草資源急劇減少[8]。本課題前期進(jìn)行了“基于化學(xué)轉(zhuǎn)化法破壁富集甘草藥渣中總黃酮的開(kāi)發(fā)研究（蘭州市科技局人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目2014-2-32）”，完成了提取工藝試驗(yàn)及中試研究。本試驗(yàn)以甘草藥渣提取物為研究對(duì)象，建立指紋圖譜，并構(gòu)建一測(cè)多評(píng)法測(cè)定提取物中5種成分的含量，對(duì)甘草藥渣提取物進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（包括Waters1525二元泵、Waters717進(jìn)樣器、Waters2487雙通道紫外檢測(cè)器、Breeze工作站）；Mettler AE240電子分析天平；SB-3200D型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

甘草素對(duì)照品（批號(hào)B-20416）、異甘草素對(duì)照品（批號(hào)B-21525）、甘草苷對(duì)照品（批號(hào)B-20414）、異甘草苷對(duì)照品（批號(hào)B-21524）、甘草酸對(duì)照品（B20417），上海源葉生物科技有限公司；甘草飲片（批號(hào)150922、150701），甘肅康樂(lè)藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)甘肅省藥檢院宋平順主任藥師鑒定為Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖；甘草藥渣提取物10批（批號(hào)分別為20160504、20160505、20160506、20160509、20161102、20161104、20161108、20161107、20161114、20161126），甘肅省中醫(yī)院制劑室提供，制備過(guò)程見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。無(wú)水乙醇（批號(hào)20160905）、乙腈（批號(hào)20160505）、磷酸（批號(hào)20160307）均為色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；含量測(cè)定用水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定量分析方法驗(yàn)證

2.1.1 色譜條件

色譜柱為島津Inerisil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 ?m），乙腈為流動(dòng)相A，0.85%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（見(jiàn)表1），柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm，流速1 mL/min。

2.1.2 混合對(duì)照品的制備

分別精密稱取對(duì)照品甘草苷5.1 mg、異甘草苷6.6 mg、甘草素5.6 mg、甘草酸5.6 mg、異甘草素5.3 mg，用70%乙醇溶解并定容至25 mL，得到濃度分別為0.204、0.264、0.224、0.224、0.212 mg/mL的單一對(duì)照品溶液，分別精密吸取2.0、2.0、0.5、2.0、1.0 mL，置10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，得濃度分別為0.040 8、0.052 8、0.011 2、0.044 8、0.021 2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，4 ℃冰箱保存。

2.1.3 供試品溶液的制備

取甘草藥渣提取物約100 mg，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，加70%乙醇至刻度，精密稱定，超聲處理（180 W，40 kHz）30 min，冷卻，稱定補(bǔ)足減失的質(zhì)量，0.45 ?m微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果各成分色譜峰分離度良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、1、5、10、15 ?L進(jìn)樣，在上述色譜條件下記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。甘草苷：Y=2 296 046.078X-10 769.500，r=0.999 98，線性范圍0.020 4～0.612 0 ?g；異甘草苷：Y=1 361 314.394X-7737.500，r=0.999 91，線性范圍0.026 4～0.792 0 ?g；甘草素：Y=5 011 214.286X-15 122.500，r=0.999 83，線性范圍0.005 6～0.168 0 ?g；甘草酸：Y=661 750.893X-8479.500，r=0.999 69，線性范圍0.022 4～0.672 0 ?g；異甘草素：Y=1 976 024.528X-7840.000，r=0.999 95，線性范圍0.010 6～0.318 0 ?g。各成分在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10 ?L，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素峰面積RSD分別為0.66%、1.52%、0.81%、0.59%、0.71%；以甘草苷（4號(hào)峰）為內(nèi)參物s，其他共有峰相對(duì)保留時(shí)間為ras=tRa/tRs，RSD分別為0.72%、0.52%、0.40%、0.46%、0.42%，共有峰相似度達(dá)1.000。endprint

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品溶液，分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣10 ?L，記錄峰面積，RSD分別為0.65%、1.56%、1.85%、0.95%、0.65%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批提取物6份，約100 mg，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備6份，進(jìn)樣10 ?L，記錄峰面積。甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素平均含量分別為8.981、2.770、0.401、5.334、0.611 mg/g，峰面積RSD分別為0.68%、1.08%、1.58%、0.90%、1.25%，相似度1.000，符合指紋圖譜要求。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批樣品（批號(hào)20160506）6份，約60 mg，精密稱定，每份加入約1 mL混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10 ?L分析。計(jì)算甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸及異甘草素平均加樣回收率分別為100.1%、100.8%、102.2%、103.6、99.2%，RSD分別為1.80%、1.01%、0.85%、1.47%、1.22%。

2.2 指紋圖譜分析

2.2.1 指紋圖譜的建立

按照中藥指紋圖譜要求，對(duì)10批樣品進(jìn)行檢測(cè)，其所有成分在80 min內(nèi)全部出完。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.130723版），將10批樣品HPLC圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件，進(jìn)行相似度分析，生成對(duì)照?qǐng)D譜。以甘草苷（4號(hào)峰）為參照，11個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積見(jiàn)表2。對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖2。

2.2.2 相似度評(píng)價(jià)

以S1樣品的指紋圖譜作為參照?qǐng)D譜，用平均數(shù)法生成10批樣品的對(duì)照指紋圖譜（見(jiàn)圖3），10批樣品與對(duì)照指紋圖譜相似度分別為1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、0.999、0.998、1.000、0.999、1.000。

2.3 一測(cè)多評(píng)法分析

2.3.1 5種化合物相對(duì)校正因子測(cè)定

取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 ?L，記錄甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素的峰面積，以甘草苷為內(nèi)參物s，采用多濃度計(jì)算法，計(jì)算相對(duì)校正因子。fsi=fs/fi=（As/Cs）/（Ai/Ci）。fs為甘草苷絕對(duì)校正因子，fs6、fs8、fs10、fs11分別為異甘草苷、甘草素、甘草酸、異苷草素的相對(duì)校正因子。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.2 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察

采用Waters2487考察3種不同型號(hào)色譜柱，用島津Inerisil ODS-3色譜柱考察2種色譜系統(tǒng)對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果重現(xiàn)性良好，RSD<5%，見(jiàn)表4。

2.3.3 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法比較

取10批甘草藥渣提取物，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣10 ?L測(cè)定，分別采用外標(biāo)法和QAMS法計(jì)算5種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

甘草有效成分主要為甘草酸和黃酮類化合物。目前對(duì)甘草中的甘草酸進(jìn)行開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)的利用率不超過(guò)30%，其余則作為廢渣丟棄[10-11]。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上建立指紋圖譜及一測(cè)多評(píng)的分析方法，為大規(guī)模生產(chǎn)開(kāi)發(fā)甘草藥渣提供依據(jù)。

試驗(yàn)過(guò)程中，選擇雙通道雙波長(zhǎng)同時(shí)掃描，得到同步雙譜圖，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)λ237色譜圖與λ254色譜圖基本接近，但甘草苷在λ237處有最大吸收，保留時(shí)間為（14.953±0.258）min。以甘草苷作為內(nèi)參物，符合易得、穩(wěn)定、定位準(zhǔn)確、重復(fù)性好的原則[3]，故選擇λ237為測(cè)定波長(zhǎng)。

有文獻(xiàn)報(bào)道采用變波長(zhǎng)法測(cè)定[10]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)變波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)背景吸收不易控制、基線不平，且由于特征峰較多，實(shí)際操作有困難。本研究最大限度參考藥典數(shù)據(jù)及方法，方便實(shí)際操作，耐用性符合要求。

目前已有文獻(xiàn)報(bào)道從甘草藥渣中分離并鑒定了甘草查耳酮等多種成分[12-14]，但本試驗(yàn)所用到的樣品中尚未發(fā)現(xiàn)含有甘草查耳酮B，有待進(jìn)一步分析考察。

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（收稿日期：2017-03-23）

（修回日期：2017-04-11；編輯：陳靜）endprint