孫華偉，盧鳳英，張敬峰，張曉曦，徐 凱，劉傳敏，張小飛

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室，江蘇省農(nóng)科院動物疫病診斷檢測中心，江蘇 南京 210014）

影子病在人醫(yī)領域研究較多，在獸醫(yī)領域研究少之又少。何謂影子??？指的是感染某種疾病后，患另一種疾病的風險明顯增高，后一種疾病如同前一種疾病的影子，醫(yī)學專家形象地稱之為影子病[1]。為什么會有影子??？因為身體是一個有機整體，各系統(tǒng)相互關聯(lián)和影響，使得一些看似不相關的疾病常常互為“影子”。副豬嗜血桿菌(HPS)常被稱為豬藍耳病(PRRS)的影子病[2]，但極少有文獻報道兩者之間相關性的確切數(shù)據(jù)。遂對江蘇省農(nóng)科院動物疫病診斷檢測中心2017年5-8月份臨床接診的32份豬樣品同時進行PRRSv與HPS的檢測。具體報告如下：

1 材料

1.1 檢測地點與檢測時間

PRRSV的PCR檢測和HPS的檢測于2017年8月在江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所動物疫病診斷檢測中心實驗室進行。

1.2 主要試劑及儀器

PCR 儀（Applide Biosystems）購自ABI公司；Tanon凝膠成像系統(tǒng)（2500）購自上海天能公司；電泳儀（cavoy）購自凱元信瑞儀器公司；冷凍離心機型號為Centrifuge5424R，產(chǎn)自德國；生化培養(yǎng)箱購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；生物安全柜購自蘇凈集團保護氣氛有限公司；胰蛋白大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基購買美國BD公司；NAD（氧化型輔酶Ⅰ）購自南京奧多福尼生物科技有限公司；新生小牛血清，購自上海語純生物科技有限公司；其他化學試劑為進口產(chǎn)品或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；各種規(guī)格移液器，購自德國Eppendorf公司。

1.3 檢測試劑盒

核酸提取及PCR試劑盒；Axy-Prep體液病毒DNA小量試劑盒購自康寧公司；PCR試劑盒等購自上海Sangon公司。

1.4 引物

1.4.1 PRRSV引物

參照相關文獻設計引物，引物由南京思普金生物科技有限公司合成，該對引物的擴增目的片段大小為372 bp，見表1。

1.4.2 HPS引物

參照相關文獻設計引物，引物由南京思普金生物科技有限公司合成，該對引物的擴增目的片段大小為822 bp，見表2。

2 方法

2.1 樣品PRRSV的檢測

待檢樣品PRRSV核酸的提取及PCR過程嚴格按照Sangon公司的試劑盒說明書進行相關操作。

2.2 樣品HPS的檢測

TSA平板、TSB肉湯配制時，分別添加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）終濃度為10 mg/L和犢牛血清（終濃度50 mL/L）。燒灼剪刀、接種環(huán)，無菌采集現(xiàn)場剖殺的新鮮豬肺臟、心血接種涂抹于TSA平板中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察平板，挑取表面光滑、邊緣圓滑、針尖大小成露珠樣的單個菌落進一步純化。將疑似的單個菌落進行涂片、固定、染色，油鏡下觀察。對分離菌株進行DNA提取，PCR反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳；用膠回收試劑盒回收陽性PCR產(chǎn)物進行測序、比對分析。

3 結果與分析

3.1 樣品PRRSV的PCR檢測結果

共檢測臨床樣品32份，其中檢出PRRSV陽性樣品12份，檢測樣品的PRRSV病原陽性率為37.5%；部分樣品的電泳圖見圖1。

表1 PRRSV引物序列信息

表2 HPS引物序列信息

圖1 部分樣品PRRSV PCR 擴增結果

3.2 HPS檢測結果

3.2.1 HPS的菌落形態(tài)

見圖2和圖3。

圖2 HPS在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)

圖3 HPS在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)

HPS在TSA 平板上生長緩慢，培養(yǎng)24 h 后，生長出邊緣整齊、光滑、透明的針尖大小的菌落，菌落直徑約0.3～1.2 mm。

3.2.2 HPS的細菌形態(tài)

見圖4和圖5。

圖4 HPS革蘭氏染色后的細菌形態(tài)

圖5 HPS革蘭氏染色后的細菌形態(tài)

取上述經(jīng)純化的菌落涂片，革蘭染色后在顯微鏡下觀察，見革蘭陰性桿菌，具有多種形態(tài)，從短桿狀、細長桿狀到細長絲狀不等，多數(shù)細菌形態(tài)為略微彎曲桿狀。

3.2.3 分 離 菌 株 16SrRNAPCR檢測

見圖6。

圖6 分離菌株 16S rRNA PCR 擴增結果

在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，分離菌株經(jīng)PCR檢測擴增出大小為822 bp的特異性條帶，與預期結果一致(圖6)。用膠回收試劑盒回收陽性PCR產(chǎn)物進行測序（測序結果未列出），并在NCBI數(shù)據(jù)庫應用在線軟件Nucleotide Blast進行比對分析。發(fā)現(xiàn)與本實驗測序序列同源性最高的10個序列均為NCBI數(shù)據(jù)庫已發(fā)布的HPS 16SrRNA基因序列，其同源性都在98%以上，可判定為HPS。

4 討論

HPS和PRRS常常以混合感染或繼發(fā)感染的形式發(fā)生[3]，為什么HPS被稱為PRRS的影子病，而不是豬鏈球菌、豬傳染性胸膜放線桿菌等別的細菌？說明豬群感染PRRS以后，感染HPS的幾率更大，本次檢測也驗證了這一點，本次檢測的32份樣品共分離到3例豬鏈球菌，未分離到豬傳染性胸膜放線桿菌，豬鏈球菌和豬傳染性胸膜放線桿菌的檢出率明顯低于HPS。人類醫(yī)學研究顯示： “影子病”的發(fā)生有兩大原因：一是一種疾病導致的損傷引發(fā)了第二種疾??；二是有缺陷的基因觸發(fā)了另一種疾病。豬群感染PRRS以后很容易繼發(fā)感染HPS的分子生物學機制還有待于進一步研究。

目前HPS的臨床發(fā)病率遠遠高于分離率，原因在于HPS體外培養(yǎng)營養(yǎng)要求較高[4]，培養(yǎng)基中需要加入NAD（氧化型輔酶Ⅰ）[5]和牛血清；且HPS抵抗力不強，在體外很容易死亡，分離時，病料必須是新鮮的組織，不能凍存，采集的病料在冷藏條件下不能超過1周[6]；細菌分離鑒定時應當采集處于病急性期的豬并且沒有使用抗生素的病料[7]，否則分離率大大降低。

目前防治副豬嗜血桿菌病的主要方法是抗生素的應用及滅活疫苗的使用。但隨著抗生素的長期使用，HPS的耐藥性越來越強，藥物治療對副豬嗜血桿菌病的防治已愈發(fā)困難，HPS發(fā)病嚴重的豬場，使用疫苗來預防是可選方案[8]。

[1] 蘭曉雁.健康關鍵詞：影子病[J].健康生活，2016（1）：11-12.

[2] 葉飛，賀云霞，徐慧，等.副豬嗜血桿菌病研究進展 [J]. 動物醫(yī)學研究進展，2011，32（2）101-104.

[3] MACLNNES J I，GOTTSCHALK M，LONE A G，et al. Prevalence of Actinobacillus pleuropneumoniae，Actinoba-cillus，Haemophilus parasuis，Pasteurella multocida，and Streptococcus suis inrepresentative Ontario swine herds [J] .Can J Vet Res，2008，72(3)：242-248.

[4] 李曦婷，王超，薛彥杰，等.一例副豬嗜血桿菌的分離鑒定及16SrRNA生物信息學分析[J] .沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2016，47（4）：438-444.

[5] KIELSTEINA P， WUTHEB H H，ANGENC O.Phenotypic and genet-ic characterization of NAD dependent Pasteurella ceae from the respiratory tract of pigs and their possible pathogenetic importance [J].Vet Microbiol，2001，81：243-255.

[6] 王建，邵衛(wèi)星，呂占軍，等.2012年我國部分省市規(guī)?；i場副豬嗜血桿菌分離鑒定及菌株血清分型[J].動物醫(yī)學進展，2014，35（3）：48-52.

[7] 魏鳳，張文通，李峰，等.副豬嗜血桿菌病實驗室診斷方法綜述[J].豬業(yè)科學，2017.34（5）：54-55.

[8] 易新健，王小波，高清清，等.蘇皖地區(qū)副豬嗜血桿菌的分離鑒定與三價滅活疫苗的初步研制[J].中國獸醫(yī)學報，2017.37（5）：823-827.