孫學(xué)亮 高微微 石洪玥 方珍珍 梁健 季延濱 陳成勛 胡婷瑩

摘 要：為了解色素相關(guān)基因和體色之間的關(guān)系，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)分析血鸚鵡的酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）基因的表達(dá)譜，通過(guò)Primer 5 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增血鸚鵡TYR基因片段的引物并進(jìn)行qPCR評(píng)估研究。結(jié)果顯示，引物TYR2F-TYR2R在qPCR擴(kuò)增時(shí)，融解曲線為單一尖銳峰；標(biāo)準(zhǔn)曲線分析顯示，引物的擴(kuò)增效率為103.3%，R2值為0.994。上述結(jié)果說(shuō)明該對(duì)引物具有良好的擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率，滿足了qPCR擴(kuò)增的要求，該研究結(jié)果可為血鸚鵡TYR基因表達(dá)的qPCR分析奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：血鸚鵡；酪氨酸酶基因（TYR）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；融解曲線

中圖分類號(hào)：S965.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.12.014

Abstract： To understand the relationship between the related genes and body color pigment， the application of real-time fluorescent quantitative PCR （qPCR） technical analysis blood parrot tyrosinase， tyrosinase， TYR） gene expression profile， this research designed blood parrot TYR gene primers and qPCR assessment through the Primer amplification 5 software. The results showed that the melting curve was a single sharp peak when the primer TYR2F-TYR2R was amplified by qPCR. The standard curve analysis showed that the amplification efficiency of primers was 103.3% and R2 was 0.994. The above results showed that the primers have good amplification specificity and amplification efficiency and meet the requirement of qPCR amplification. This study will lay a foundation for the qPCR analysis of TYR gene expression.

Key words： Amphilophus； tyrosinase gene （TYR）； real-time fluorescence quantitative PCR； melting curve

體色是魚(yú)類獨(dú)特的表型性狀和經(jīng)濟(jì)性狀[1]， 觀賞魚(yú)類的體色和斑紋直接決定其觀賞價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。隨著人們對(duì)觀賞魚(yú)要求的提高，如何增強(qiáng)觀賞魚(yú)的觀賞性成為一個(gè)重要的問(wèn)題。許多魚(yú)類從仔魚(yú)階段到幼魚(yú)階段都會(huì)有一個(gè)“體色褪黑”的現(xiàn)象，如血鸚鵡魚(yú)、日本錦鯉、小丑魚(yú)等[2]。目前，生產(chǎn)中常利用體色完全褪黑的血鸚鵡進(jìn)行揚(yáng)色，然而，體色褪黑的程度往往不符合生產(chǎn)的需求，如血鸚鵡會(huì)出現(xiàn)返黑現(xiàn)象。因此，深入了解魚(yú)類體色褪黑的機(jī)制，尋找人工改良體色的方法，非常值得研究。

魚(yú)類體色的形成和維持受到一系列細(xì)胞、基因和生理因素的復(fù)雜調(diào)控[3]，其體色構(gòu)成不僅與色素合成有關(guān)，更取決于所含色素細(xì)胞的種類、數(shù)量、分布及色素細(xì)胞之間的相互作用[4]。關(guān)于魚(yú)類色素細(xì)胞的分類目前有很多種說(shuō)法，普遍認(rèn)為，魚(yú)類色素細(xì)胞主要有6種類型：紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、白色素細(xì)胞、藍(lán)色素細(xì)胞[5]。目前，已知腺苷酸環(huán)化酶、酪氨酸激酶、蛋白激酶三種信號(hào)通路，都能調(diào)控黑色素合成，并且激活其中任意一個(gè)信號(hào)通路均能激活細(xì)胞增殖或黑色素顆粒的形成[6]。黑色素顆粒吸收特定波長(zhǎng)的光使其體現(xiàn)為黑色，這是由酪氨酸和多巴胺通過(guò)一系列復(fù)雜的反應(yīng)合成的[7]。具體過(guò)程可簡(jiǎn)化為酪氨酸—多巴—多醌—多巴色素—5，6-二羥基吲哚酸或5，6-二羥基吲哚—5，6吲哚醌--真黑素[8]。

大量研究證明，有多個(gè)基因參與魚(yú)類色素細(xì)胞形成和色素細(xì)胞間的相互作用[5，9-12]，其中，在一系列復(fù)雜的基因中，酪氨酸酶（Tyrosinase， TYR）基因在黑色素形成中起著關(guān)鍵性作用，TYR是動(dòng)物體內(nèi)黑色素合成信號(hào)通路中最重要的限速酶之一[13]， 其表達(dá)量和活性水平?jīng)Q定著黑色素形成的種類和速度，若TYR提前終止轉(zhuǎn)錄，黑色素則無(wú)法合成，進(jìn)而會(huì)造成白化現(xiàn)象等。

血鸚鵡魚(yú)（Blood parrot fish）是由紫紅火口（Cichlasoma synspilum）為母本、紅魔鬼魚(yú)為父本（Cichlasoma citrinellum）雜交而成的，屬淡水熱帶觀賞魚(yú)類，體形肥胖，全身鮮艷通紅。因其色彩艷麗，嘴型酷似鸚鵡嘴型而得名，因此深受魚(yú)迷們喜愛(ài)[14]。血鸚鵡魚(yú)的體色變化過(guò)程不同于其他觀賞魚(yú)品種，仔魚(yú)期為黑色，逐漸褪去變成黃色，添加色素后，魚(yú)體變紅。為了培養(yǎng)出高品質(zhì)的觀賞魚(yú)，必須添加外源色素，但目前對(duì)于觀賞魚(yú)著色機(jī)理的研究還比較少。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescencequantitative PCR，qPCR）是指在反應(yīng)體系中加入熒光分子，分析和檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的累積擴(kuò)增產(chǎn)物，其結(jié)果可以用于定性和定量分析。qPCR 可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性的測(cè)定、細(xì)胞因子的表達(dá)分析、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測(cè)[15]。

為應(yīng)用qPCR技術(shù)分析血鸚鵡的酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）基因的表達(dá)譜，本試驗(yàn)通過(guò)擴(kuò)增血鸚鵡TYR基因片段的引物并進(jìn)行qPCR評(píng)估，旨在為血鸚鵡TYR基因的定量表達(dá)分析及魚(yú)類體色遺傳和體色改良研究積累資料。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試魚(yú)取自天津?qū)氎胬镒怨良魏烫镌答B(yǎng)殖基地，經(jīng)麻醉后，解剖其鰭、皮和眼，液氮中迅速冷凍后放入-80 ℃冰箱中，備用。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取 應(yīng)用Trizol 試劑（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）提取血鸚鵡的鰭、皮和眼3種組織的RNA。試驗(yàn)步驟如下：加入適量Trizol研磨，靜置5 min，12 000 r·min-1，4 ℃離心5 min取上清至離心管中；加入氯仿，振蕩混勻，靜置5 min，12 000 r·min-1離心15 min取上清；加等體積異丙醇，靜置10 min，12 000 r·min-1 離心10 min棄去上清；加入75%乙醇1 mL，離心15 min，棄乙醇，保留沉淀，干燥2 min，溶入DEPC水中，溶解后用超微量分光光度計(jì)（德國(guó)IMPLEN公司）分析其純度；然后再在1%左右的普通瓊脂糖凝膠、5 V·cm-1 的恒壓電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察與拍照。

1.2.2 cDNA第一條鏈的合成 依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)，在離心管中加入1 μL Oligo dT Primer，1 μL dNTP Mixture，計(jì)算好標(biāo)定為1 000 mg·μL-1的提取得到的RNA模板溶液，再加上ddH2O配平至10 μL，放入65 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，迅速冷卻，加4 μL 5×Prime ScriptⅡ Buffer，0.5 μL RNase lahibitor，1 μL Prime ScriptⅡRTase于離心管中，最后加入4.5 μL ddH2O于45 ℃水浴中反應(yīng)45 min，95 ℃水浴5 min，冷卻，最后將得到的cDNA產(chǎn)物放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)、常規(guī)PCR的篩選 依據(jù)GenBank公布的血鸚鵡近緣物種TYR的基因序列信息（GenBank號(hào)：KU308394.1），應(yīng)用Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

取魚(yú)的鰭、皮和眼的cDNA進(jìn)行TYR基因片段的常規(guī)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25 μL，包括cDNA 1 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 15.3 μL，dNTP 2 μL， 合成的引物各4 μL，Taq 0.2 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35～40次。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%左右的瓊脂糖凝膠、5 V·cm-1 的恒壓電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察與拍照。之后對(duì)得到的TYR基因的單一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.4 qPCR引物的設(shè)計(jì)與評(píng)估 根據(jù)本試驗(yàn)獲得的TYR基因序列以及qPCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)原則，對(duì)用于qPCR分析的引物，經(jīng)過(guò)常規(guī)PCR檢測(cè)后，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。

根據(jù)Real Master Mix（SYBR Green I）試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)反應(yīng)體系，對(duì)引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為6 μL ddH2O，0.4 μL ROXⅡ，0.8 μL正向引物，0.8 μL反向引物，2 μL模板和10 μLSYBR。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，一定的退火溫度退火30 s，72 ℃延伸25 s。共循環(huán)40次。

退火溫度的優(yōu)化：根據(jù)引物的Tm值，對(duì)TYR的基因片段進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。每個(gè)反應(yīng)為3個(gè)技術(shù)重復(fù)，同時(shí)進(jìn)行融解分析，并設(shè)置陰性對(duì)照（用PCR水替代cDNA）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以cDNA原液為最高濃度，采用10倍稀釋法獲得5個(gè)不同濃度的cDNA模板（用PCR水替代cDNA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取及檢測(cè)結(jié)果

血鸚鵡鰭、皮和眼3種組織的總RNA經(jīng)檢測(cè)顯示，28 S rRNA和18 S rRNA條帶亮度比值在1～2（圖1），OD260/OD280均在1.8～2.0。

2.2 引物的設(shè)計(jì)、常規(guī)PCR的篩選

根據(jù)GenBank檢索的血鸚鵡近緣物種TYR的基因序列，應(yīng)用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)得出的引物中，只有1對(duì)引物（表1）適宜進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

以血鸚鵡鰭、皮、眼的cDNA為模板，對(duì)表1引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增篩選。圖2結(jié)果顯示，引物TYR-F，TYR-R的擴(kuò)增產(chǎn)物僅有一個(gè)擴(kuò)增條帶（泳道1～3），大小與理論值相符。

對(duì)擴(kuò)增后獲得的單一產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，其序列包含引物為293 bp。對(duì)該序列進(jìn)行GenBank BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，TYR基因與已報(bào)道的近緣物種橘色雙冠麗魚(yú)的cDNA序列（GenBank號(hào)：KU308394.1）一致性為99%；與紫藍(lán)叮當(dāng)?shù)囊恢滦詾?9%（GenBank號(hào)：AB178940.1）；與藍(lán)馬面的一致性為89%（GenBank號(hào)：AB178937.1）；與噴點(diǎn)珍珠虎的一致性為89%（GenBank號(hào)：AB178936.1）；與非洲慈鯛的一致性為89%（GenBank號(hào)：AB178939.1）（表2）。

2.3 qPCR引物的設(shè)計(jì)與評(píng)估

2.3.1 qPCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)試驗(yàn)所得的基因序列，設(shè)計(jì)并得到2對(duì)qPCR擴(kuò)增的產(chǎn)物（表3）。

試驗(yàn)所得的序列為：CGGGGCTACAGCCAAGAGCACTGTGTAACGCCACCGGGGAGGGTCCACTGTTACGTAATCCCGGTAACCATGATTCCAATCGTGTGCAACGAATTCCACTTCGGCTGATGTGGAGTTCACTTTGGGCCTCCCCGAGTACGAGACGGGAACCATGGACCGCTTTGCAACATGAGCTTTAGAAACGTATTAGAGGGTTTTGCAAGTCCAGAGACAGGTATGGCCCTGACAGGCCAGAGTACCATGCACAACTCCTTGCATA。

2.3.2 qPCR引物的評(píng)估 根據(jù)TYR1F-TYR1R和TYR2F-TYR2R的Tm值，進(jìn)行qPCR溫度梯度試驗(yàn)的擴(kuò)增，結(jié)果顯示，TYR2F-TYR2R在退火溫度為57 ℃時(shí)的Ct值最小（表4），所以，引物TYR2F-TYR2R用于qPCR的擴(kuò)增。

采用退火溫度57 ℃，應(yīng)用引物TYR2F-TYR2R對(duì)系列稀釋cDNA樣本進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，在指數(shù)擴(kuò)增區(qū)相鄰的擴(kuò)增曲線間隔相似（圖3-A），每個(gè)反應(yīng)的融解曲線為單一尖銳峰（圖3-B），從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出引物的擴(kuò)增效率為103.3%，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2值為0.994（圖3-C）。

3 結(jié)論與討論

總RNA的純度和完整性關(guān)系到后面的cDNA合成及PCR擴(kuò)增。因此，所提的總RNA要求純度高，完整性好并達(dá)到一定的濃度。本研究表明，從血鸚鵡中提取的總RNA樣本的28 S/18 S rRNA的條帶亮度比值在1～2，而OD260/OD280在1.8～2.0，沒(méi)有蛋白的污染。表明總RNA有較好的完整性，可用于后續(xù)的試驗(yàn)。

引物的設(shè)計(jì)一般應(yīng)遵循以下原則：引物的GC含量在50%～60%較為合適，避免序列中連續(xù)出現(xiàn)超過(guò)3個(gè)G或C重復(fù)片段；引物的Tm值在50～65 ℃之間，且上下游引物的Tm值的差在5 ℃以內(nèi)，可增加PCR反應(yīng)成功的可能性，引物自身和引物間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，從而避免產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體[16]；而對(duì)于qPCR擴(kuò)增還要求擴(kuò)增子的長(zhǎng)度最好在75～200 bp之間，片段越長(zhǎng)擴(kuò)增效率越低。本試驗(yàn)基于GenBank公布的血鸚鵡魚(yú)近緣物種所得的基因序列（KU308394.1），僅得到1對(duì)引物，即：TYR-F和TYR-R，擴(kuò)增子理論大小值為293 bp，在常規(guī)PCR中，引物的擴(kuò)增子理論大小值為293 bp與理論值相符且無(wú)雜帶，特異性較強(qiáng)?；谠撘镄蛄?，進(jìn)一步設(shè)計(jì)用于qPCR試驗(yàn)的引物，得到2對(duì)用于qPCR試驗(yàn)的引物。擴(kuò)增子理論大小值分別為112，161 bp。之后經(jīng)過(guò)qPCR溫度梯度擴(kuò)增試驗(yàn)，結(jié)果顯示，TYR2F-TYR2R引物更適合用于qPCR的試驗(yàn)。

在qPCR擴(kuò)增時(shí)，每次均應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照，且無(wú)擴(kuò)增信號(hào)；所有的擴(kuò)增樣本都應(yīng)有2～3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，同時(shí)技術(shù)重復(fù)樣本的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)<0.5，否則應(yīng)對(duì)樣本重新進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。本試驗(yàn)中的陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，qPCR擴(kuò)增樣本的3個(gè)重復(fù)的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差<0.5，說(shuō)明了本試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

退火溫度的高低影響引物與目標(biāo)序列的退火，不適宜的退火溫度會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的形成，因此，在qPCR試驗(yàn)中，要進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化。引物擴(kuò)增的特異性是qPCR分析成敗的關(guān)鍵，因此在進(jìn)行退火溫度優(yōu)化的同時(shí)要進(jìn)行融解分析，判斷引物擴(kuò)增的特異性[17]。融解曲線若為單一尖銳峰，則表明引物的qPCR擴(kuò)增為特異性反應(yīng)；相反，如果在融解曲線上不只有一個(gè)波峰，則表明有非特異性的反應(yīng)，應(yīng)淘汰該引物[18]。依據(jù)本試驗(yàn)引物的Tm值，經(jīng)過(guò)優(yōu)化，結(jié)果顯示，退火溫度為57 ℃時(shí)，qPCR擴(kuò)增的Ct值最小，故選擇57 ℃作為退火溫度對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增效率的檢測(cè)。

引物除了具有擴(kuò)增特異性外還應(yīng)具有良好的擴(kuò)增效率，才能最終用于試驗(yàn)樣本的qPCR 分析。qPCR的擴(kuò)增效率一般通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定，而標(biāo)準(zhǔn)曲線可通過(guò)對(duì)一系列倍比稀釋的cDNA模板進(jìn)行qPCR而得出。擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增曲線應(yīng)間隔均勻、理想的擴(kuò)增效率在90%～105%、標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)（R2）>0.980[19-20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，引物TYR2F-TYR2R在qPCR擴(kuò)增時(shí)，融解曲線為單一尖銳峰；標(biāo)準(zhǔn)曲線分析顯示：引物的擴(kuò)增效率為103.3%，R2值為0.994。上述結(jié)果說(shuō)明，該對(duì)引物具有良好的擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率，滿足了qPCR擴(kuò)增的要求。

通過(guò)對(duì)引物TYR2F-TYR2R的退火溫度優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，結(jié)果表明，該引物可適用于樣本的qPCR分析，這一研究將為T(mén)YR基因表達(dá)量與血鸚鵡體色變化的關(guān)系及研究鸚鵡魚(yú)體色形成機(jī)制提供理論依據(jù)。

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