吳霞 肖盼盼 謝曉然 孫雪茜 付冰冰 孫曉鵬

摘 ? 要：目的 ?運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）法分析系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者腸道菌群數(shù)量的變化，探討雙歧桿菌、柔嫩梭菌與復(fù)發(fā)性SLE活動(dòng)的關(guān)系。方法 ?提取糞便細(xì)菌組DNA，運(yùn)用qRT-PCR法分析此二菌絕對(duì)數(shù)量的變化。結(jié)果 ?SLE復(fù)發(fā)活動(dòng)期雙歧桿菌、柔嫩梭菌數(shù)量均較治療后穩(wěn)定期減少（P<0.05），對(duì)比正常對(duì)照組也均減少（P<0.05）。結(jié)論 ?雙歧桿菌、柔嫩梭菌菌群數(shù)量與SLE活動(dòng)度評(píng)分相關(guān)，腸道內(nèi)此二菌數(shù)量減少可能與SLE病情的復(fù)發(fā)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：系統(tǒng)性紅斑狼瘡;雙歧桿菌;柔嫩梭菌;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：R593.241 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.05.022

文章編號(hào)：1006-1959（2018）05-0065-05

Analysis of the Changes of Intestinal Bifidobacterium and Clostridium Tenella in Patients with Recurrent SLE by qRT-PCR

WU Xia1，XIAO Pan-pan1，XIE Xiao-ran1，SUN Xue-qian2，F(xiàn)U Bing-bing2，SUN Xiao-peng2

（1.Jiamusi University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China;

2.Department of Rheumatological Immunology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，Heilongjiang，China）

Abstract：Objective ?To investigate the relationship between bifidobacterium，Clostridium tenella and recurrent SLE activity in patients with systemic lupus erythematosus by real-time quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR）.Methods ?The DNA of fecal bacteria group was extracted，and the absolute quantity of the two bacteria was analyzed by qRT-PCR method.Results ?Bifidobacterium in the recurrent stage of SLE was found to be bifidobacterium.The number of Clostridium tenella was lower than that of stable period after treatment（P<0.05），compared with the normal control group，it was also decreased（P<0.05）.Conclusion ?The number of bifidobacterium and Clostridium tenella was correlated with the SLE activity score，and the decrease of these two bacteria in the intestinal tract might be related to the recurrence of SLE.

Key words：Systemic lupus erythematosus;Bifidobacterium;Clostridium tenella;Real-time fluorescence quantitative PCR

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及全身各組織的自身免疫炎癥性疾病[1]，腸道內(nèi)多種細(xì)菌與SLE相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明[2]，機(jī)體免疫功能的正常與宿主腸道內(nèi)微生物群和宿主免疫系統(tǒng)間的動(dòng)態(tài)平衡密切相關(guān)。Yeoh N等[3]提出腸道菌群與自身免疫病存在一定的關(guān)聯(lián)。2013年Kamada等[4]發(fā)現(xiàn)小鼠腸道內(nèi)微生物的菌群失調(diào)與多種自身免疫性疾病有關(guān)。2014年Hevia A[5]首次證實(shí)人SLE可致腸道中厚壁菌門/擬桿菌門數(shù)量改變。本研究旨在分析SLE患者在病情活動(dòng)期治療前、穩(wěn)定期治療后及正常對(duì)照組糞便中雙歧桿菌、柔嫩梭菌數(shù)量的變化，探討此二菌與復(fù)發(fā)性SLE病情活動(dòng)的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料 ?選取2015年12月～2016年12月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院SLE患者30例為SLE組，男4例，女26例，年齡15～50歲，平均年齡（27.52±12.51）歲。對(duì)照組男4例，女26例，年齡11～50歲，平均年齡（26.81±13.70）歲。SLE組用藥為：潑尼松1 mg/（kg·d）至病情穩(wěn)定2周后每周減量10%，羥氯喹0.4 g/d。根據(jù)SLE活動(dòng)度評(píng)分（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）分為治療前活動(dòng)期組（≥5分）和治療后穩(wěn)定期組（≤4分）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①11～50歲之間的非絕經(jīng)期女性和同年齡段的男性患者;②符合SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為狼瘡者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①首次確診SLE者;②合并嚴(yán)重的心腦血管、肝、腎、肺等疾病不能后續(xù)追蹤病情者;③合并消化道慢性疾病者;④近4周內(nèi)使用可能對(duì)菌群造成影響的藥物;⑤合并可引起口腔菌群改變的口腔疾病者。本實(shí)驗(yàn)已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2方法

1.2.1糞便標(biāo)本采集及DNA提取 ?采集研究對(duì)象新鮮便標(biāo)本迅速置于-80 ℃冰箱凍存。秤取中段標(biāo)本180～200 mg，糞便基因組DNA提取試劑盒（北京天根）提取糞便細(xì)菌組DNA，洗脫體積50 μl。DU800核酸蛋白分析儀測(cè)OD260值，確定DNA濃度并稀釋成20 ng/μl，小管分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳 ?PCR反應(yīng)體系：2X PCR Taq MasterMix/with dye 25 μl;上下游引物各1 μl;DNA模板7 μl;ddH2O 16 μl。條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，退火30 s，72 ℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，產(chǎn)物行2.0%瓊脂糖凝膠電泳（100 V，30 min）。Tocan800凝膠成像分析儀留取圖像。雙歧桿菌、柔嫩梭菌引物由北京擎科生物公司合成，見表1。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)品制備 ?瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（北京天根）回收PCR產(chǎn)物膠塊DNA，DU800測(cè)定濃度及純度，選擇純度最佳者為標(biāo)準(zhǔn)品，并將其換算成各標(biāo)準(zhǔn)品1 μl的拷貝數(shù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR ?①標(biāo)準(zhǔn)品曲線生成：將2種標(biāo)準(zhǔn)品做10倍倍比稀釋（106～102 copies/μl），設(shè)5個(gè)濃度梯度分別作為模板加入qRT-PCR體系中。總體系20 μl：SYBR Premix Ex Taq II（2×）10 μl;上下游引物各0.8 μl;ROX Reference Dye 0.4 μl;DNA模板2 μl，ddH2O 6 μl。條件：95 ℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，60 ℃退火31 s，40個(gè)循環(huán)，95 ℃復(fù)性15s，95～60 ℃以0.5 ℃間隔收集熒光，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。②樣本絕對(duì)定量：將DNA提取液作模板，反應(yīng)體系及條件同標(biāo)準(zhǔn)品，各實(shí)驗(yàn)均設(shè)有校正組和陰性對(duì)照組，3個(gè)平行復(fù)孔，反應(yīng)完畢生成擴(kuò)增曲線及溶解曲線。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各組間年齡、性別、體重指數(shù)等差異采用單因素方差分析。細(xì)菌計(jì)量資料以（x±s）表示，SLE治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組比較采用SLD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SLE治療前活動(dòng)期組菌群數(shù)量與SLEDAI關(guān)系采用線性回歸法分析。

2結(jié)果

2.1引物特異性驗(yàn)證 ?100bp DNA Marker標(biāo)準(zhǔn)，引物特異性良好，見圖1，圖2。

2.2熒光定量PCR ?①標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3，圖4，計(jì)算各樣本中二菌的絕對(duì)拷貝數(shù)。②擴(kuò)增曲線：以校正后熒光強(qiáng)度ΔRn為縱坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，閾值在對(duì)數(shù)期內(nèi)，見圖5，圖6。③溶解曲線：二菌均為單峰，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，引物特異性好，見圖7，圖8。

2.3腸道菌群的絕對(duì)定量結(jié)果 ?年齡、性別、體重指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。復(fù)發(fā)活動(dòng)期治療前糞便中雙歧桿菌、柔嫩梭菌數(shù)量均明顯低于穩(wěn)定期治療后組相較于正常對(duì)照組，此二菌數(shù)量亦明顯降低，治療后穩(wěn)定期組與正常對(duì)照組無明顯差異（P>0.05），見表3。雙歧桿菌、柔嫩梭菌菌群數(shù)量與SLEDAI相關(guān)性分析，見圖9。

3討論

人的腸道內(nèi)包含原生動(dòng)物、真菌和細(xì)菌的多種組合（>1000種）。在健康人體腸道內(nèi)，其數(shù)量能達(dá)到1014個(gè)[6]。本研究中雙歧桿菌、柔嫩梭菌是人體腸道內(nèi)的常駐厭氧菌。雙歧桿菌通過抑制B細(xì)胞轉(zhuǎn)化并促進(jìn)抗炎因子IL-10、TGF-β的分泌、保護(hù)腸上皮細(xì)胞免于致病菌的侵襲;柔嫩梭菌抑制外周血單核細(xì)胞（PBMC）中促炎細(xì)胞因子如IL-12、IFN-γ、TNF-α的釋放抑制炎癥反應(yīng)。同時(shí)研究證實(shí)，短鏈脂肪酸（SCFAs）是SLE腸道菌群與宿主代謝之間交叉反應(yīng)的潛在協(xié)調(diào)者[7]。SCFAs的異常生成與微生物的腸道改變密切相關(guān)[8]。丁酸鹽是SCFAs中的一員，是腸道最豐富的微生物代謝產(chǎn)物之一[9]。雙歧桿菌、柔嫩梭菌等厭氧菌能夠?qū)⑻妓衔镛D(zhuǎn)化為丁酸鹽，后者則通過誘導(dǎo)粘蛋白合成，抑制NF-κB等多個(gè)代謝通路抑制腸道致病菌的繁殖;也能在應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)HSP25（腸上皮熱休克蛋白）和HSP72的產(chǎn)生，下調(diào)促炎細(xì)胞因子表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用;同時(shí)為哺乳動(dòng)物腸上皮細(xì)胞再生、修復(fù)以及發(fā)育提供主要能量DE來源[10]等多種方式維持宿主的腸黏膜免疫功能正常。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比復(fù)發(fā)性SLE患者與健康對(duì)照組糞便中兩細(xì)菌的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，SLE復(fù)發(fā)活動(dòng)期治療前兩種細(xì)菌數(shù)量較正常對(duì)照組均明顯降低，提示復(fù)發(fā)性SLE患者活動(dòng)期腸道內(nèi)此二菌菌群失調(diào);復(fù)發(fā)治療前活動(dòng)期組較治療后穩(wěn)定期組兩菌群數(shù)量明顯減少。本次實(shí)驗(yàn)中腸道內(nèi)雙歧桿菌、柔嫩梭菌菌群數(shù)量與SLEDAI也存在明顯相關(guān)，菌群數(shù)量隨SLEDAI評(píng)分的降低而逐漸增多。綜上推斷，宿主腸道內(nèi)此二菌菌數(shù)量減少可能與復(fù)發(fā)性SLE患者病情活動(dòng)有關(guān)。

SLE是累及胃腸道等全身多系統(tǒng)癥狀的一種慢性的自身免疫炎性疾病。臨床上常采用潑尼松聯(lián)合羥氯喹等免疫抑制劑控制炎癥、抑制免疫反應(yīng)治療SLE。羥氯喹直接作用于宿主細(xì)胞，并不直接作用于入侵的病原體，得出羥氯喹對(duì)細(xì)菌的作用是非常有限的，故本研究中治療藥物羥氯喹對(duì)腸道菌群數(shù)量的影響認(rèn)為是可以忽略的。

本研究可能為深入研究SLE的腸道菌群提供一些參考。但由于實(shí)驗(yàn)條件有限，未能明確闡述潑尼松不同劑量對(duì)腸道內(nèi)雙歧桿菌、柔嫩梭菌數(shù)量的影響，將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案后再繼續(xù)論述。

參考文獻(xiàn)：

[1]Rodríguezcarrio J，López P，Sánchez B，et al.Intestinal Dysbiosis Is Associated with Altered Short-Chain Fatty Acids and Serum-Free Fatty Acids in Systemic Lupus Erythematosus[J].Frontiers in Immunology，2017，8（1）：23.

[2]Strober W.Impact of the gut microbiome on mucosal inflammation[J].Trends in Immunology，2013，34（9）：423-430.

[3]Yeoh Nigel，Burton J P，Suppiah P，et al.The role of the microbiome in rheumatic diseases[J].Current Rheumatology Reports，2013，15（3）：1-11.

[4]Kamada N，Seo SU，Chen GY，et al.Role of the gut microbiota in immunity and inflammatory disease[J].Nature Reviews Immunology，2013，13（5）：321-335.

[5]Hevia A，Milani C，López P，et al.Intestinal dysbiosis associated with systemic lupus erythematosus[J].Mbio，2014，5（5）：e01548.

[6]Sommer F， Bckhed F.The gut microbiota-masters of host development and physiology[J].Nature Reviews Microbiology，2013，11（4）：227-38.

[7]Rodríguez-Carrio J，López P，Sánchez B，et al.Intestinal Dysbiosis Is Associated with Altered Short-Chain Fatty Acids and Serum-Free Fatty Acids in Systemic Lupus Erythematosus[J].Frontiers in Immunology，2017，8（1）：23.

[8]Salonen A，Lahti L，Salojarvi J，et al.Impact of diet and individual variation on intestinal microbiota composition and fermentation products in obese men[J].The ISME Journal，2014，8（11）：2218-2230.

[9]Park JH，Kang SG，Kim MH，et al.Short-chain fatty acids activate GPR41 and GPR43 on intestinal epithelial cells to promote inflammatory responses in mice[J].Gastroenterology，2013，145（2）：396-406.

[10]De Vadder F，Kovatcheva-Datchary P，Goncalves D，et al.Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits[J].Cell，2014，156（1-2）：84.