吳雪瓊

·述評(píng)·

提高結(jié)核抗體試劑質(zhì)量加強(qiáng)臨床篩選評(píng)估研究

吳雪瓊

全球結(jié)核病(TB)疫情依然相當(dāng)嚴(yán)重。根據(jù)WHO 2017年報(bào)告，2016年全球有1040萬(wàn)例TB患者、49萬(wàn)例耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者和11萬(wàn)例單耐利福平的TB患者；只有57%的肺結(jié)核患者是經(jīng)細(xì)菌學(xué)證實(shí)的，自2013年以來(lái)菌陽(yáng)患者逐年減少，合計(jì)167.4萬(wàn)例患者死于TB[1]。中國(guó)的TB疫情相當(dāng)嚴(yán)重，2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果表明，15歲及以上人群肺結(jié)核的患病率為459/10萬(wàn)，其中涂陽(yáng)肺結(jié)核患病率為66/10萬(wàn)，菌陽(yáng)肺結(jié)核患病率為119/10萬(wàn)，由此可見(jiàn)，我國(guó)50%以上為菌陰肺結(jié)核患者[2]。

顯然目前臨床上常規(guī)應(yīng)用的病原學(xué)檢查方法(涂片、培養(yǎng)和基因擴(kuò)增)均不能滿足菌陰結(jié)核病早期診斷和鑒別診斷的需要[3-4]。而免疫學(xué)檢查方法從宿主的免疫應(yīng)答角度間接地反映了結(jié)核分枝桿菌(MTB)的感染，而且血液標(biāo)本來(lái)源方便，檢測(cè)簡(jiǎn)便、快速，已成為結(jié)核病尤其是菌陰肺結(jié)核、肺外結(jié)核和兒童結(jié)核病輔助診斷的重要手段[3,5-6]。但目前國(guó)際上對(duì)結(jié)核抗體的診斷價(jià)值存在諸多爭(zhēng)議，《中國(guó)防癆雜志》編輯部于2017年6月30日在湖北省宜昌市召開(kāi)了結(jié)核抗體檢測(cè)專家共識(shí)討論會(huì)，以期闡明問(wèn)題之所在，探索解決之辦法，指導(dǎo)臨床之應(yīng)用。筆者概要地介紹了結(jié)核感染者的體液免疫應(yīng)答，及結(jié)核抗體檢測(cè)試劑的臨床診斷表現(xiàn)，并進(jìn)一步探討存在的問(wèn)題和未來(lái)發(fā)展的前景。

結(jié)核感染者的體液免疫應(yīng)答

MTB感染人體后，其細(xì)胞壁抗原和在體內(nèi)生長(zhǎng)、代謝過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、糖脂類抗原，均可誘導(dǎo)人體B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生具有免疫活性的免疫球蛋白(immunoglobulin， Ig)，即抗體。這些抗體是一類重要的免疫效應(yīng)分子，其主要作用是與抗原起免疫反應(yīng)，生成抗原-抗體復(fù)合物，從而阻斷病原體對(duì)機(jī)體的危害，使病原體失去致病作用。此外，抗體通過(guò)與細(xì)胞免疫的相互作用，在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮重要作用。抗體根據(jù)其結(jié)構(gòu)主要分為5種類型：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。IgG占血清總Ig的70%～75%，在機(jī)體免疫防護(hù)中發(fā)揮重要的抗感染作用，并且隨病變加重而增強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)；因此，IgG一直是臨床檢測(cè)抗結(jié)核抗體的主要類型。IgM占血清總Ig的5%～10%，是初次體液免疫應(yīng)答中出現(xiàn)最早的抗體，是機(jī)體抗感染的“先頭部隊(duì)”，但持續(xù)時(shí)間短，是近期感染的標(biāo)志；因此，活動(dòng)性TB患者中IgM陽(yáng)性率低[7]。IgA占總Ig的10%～20%，其中以血清型IgA為主，有介導(dǎo)、調(diào)理吞噬和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)作用。IgE在血清中的含量很低，與肺結(jié)核的嚴(yán)重程度具有一定的相關(guān)性。IgD在血清中的含量極低，主要以膜結(jié)合形式存在于成熟的B淋巴細(xì)胞表面，在B細(xì)胞分化發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，在抗感染中也發(fā)揮一定的作用[8]。

臨床上TB患者免疫功能紊亂，表現(xiàn)為輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)1和Th2免疫應(yīng)答失衡，Th1型免疫應(yīng)答先增強(qiáng)、而后逐漸減弱，Th2型免疫逐漸增強(qiáng)，使Th1型免疫向Th2型免疫轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為血清抗體逐漸增高[9]。因此，抗體水平增高是MTB活動(dòng)感染的標(biāo)志，MTB潛伏感染一般抗體水平不高[9-10]?？贵w存在于各種體液標(biāo)本中，如血清、胸腔積液、腦脊液、腹腔積液、關(guān)節(jié)腔積液、尿液等，由于血清是主要的檢測(cè)樣品，因此又稱為血清學(xué)檢測(cè)?？贵w檢測(cè)對(duì)活動(dòng)性TB具有輔助診斷價(jià)值，尤其是對(duì)于那些診斷困難的菌陰肺結(jié)核、兒童結(jié)核病或肺外結(jié)核(如脊柱結(jié)核)具有實(shí)用價(jià)值[3,11]。

結(jié)核抗體檢測(cè)取得的主要進(jìn)展

1.抗體檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展：1898年Arloing等發(fā)明了血凝集試驗(yàn)；1976年Engvall和Perlmann發(fā)明了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)技術(shù)；20世紀(jì)90年代膠體金技術(shù)問(wèn)世；近年來(lái)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記系統(tǒng)、液晶光學(xué)傳感器、磁珠微芯片ELISA、電化學(xué)檢測(cè)、免疫PCR試驗(yàn)等[12-14]諸多新技術(shù)問(wèn)世，使檢測(cè)敏感度顯著提高。

2.抗原的發(fā)展：抗體檢測(cè)所用抗原從最初的菌裂解液、培養(yǎng)濾液蛋白至純蛋白衍化物、純化的糖脂抗原、純化的天然蛋白抗原，最后發(fā)展為純化的重組蛋白抗原；從單一抗原到多種抗原(如多點(diǎn)抗原組合、混合抗原、融合抗原、表位串連抗原)[15-17]。

3.檢測(cè)抗體類型的發(fā)展：從IgG單一抗體類型檢測(cè)發(fā)展為與 IgM、IgA和IgE的聯(lián)合檢測(cè)或混合檢測(cè)[7,18]，以提高檢測(cè)的敏感度。

4.檢測(cè)標(biāo)本的擴(kuò)展：從血清標(biāo)本檢測(cè)到體液標(biāo)本檢測(cè)，體液標(biāo)本從胸腔積液、腦脊液、腹腔積液進(jìn)展到檢測(cè)尿液中抗結(jié)核抗體[19]。同種抗原同時(shí)檢測(cè)血清和尿中抗結(jié)核抗體的敏感度和特異度相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但血抗體與尿抗體檢測(cè)的一致性差；兩種標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)可起互補(bǔ)作用，顯著提高檢測(cè)的敏感度。

結(jié)核抗體檢測(cè)試劑的臨床診斷表現(xiàn)及存在問(wèn)題

目前已有許多商業(yè)化的結(jié)核抗體試劑盒在臨床應(yīng)用，絕大多數(shù)是檢測(cè)血清抗體IgG，少數(shù)是檢測(cè)IgM和IgA[7,18]，但其診斷TB的效能差異極大，大多數(shù)試劑盒的臨床診斷表現(xiàn)不能滿足臨床需求。2008年WHO 對(duì)19個(gè)商業(yè)化TB血清抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)，其敏感度和特異度分別為1%～60%和53%～99%[20]。Steingart等[21]對(duì)1990—2010年商業(yè)化血清抗體檢測(cè)試劑的研究文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)綜述與Meta分析，結(jié)果顯示其中67個(gè)肺結(jié)核診斷研究的敏感度和特異度分別為0%～100%和31%～100%；25個(gè)肺外結(jié)核診斷研究的敏感度和特異度分別為0%～100%和59%～100%。國(guó)內(nèi)來(lái)自不同醫(yī)院對(duì)不同商業(yè)化結(jié)核抗體試劑盒的臨床評(píng)價(jià)結(jié)果也證實(shí)抗體試劑盒在臨床上的表現(xiàn)差異極大[7,22-25]。

分析產(chǎn)生上述結(jié)果的原因可能存在下列幾個(gè)方面的問(wèn)題：

1.試劑盒質(zhì)量不穩(wěn)定：這是目前商業(yè)化抗體檢測(cè)試劑在臨床應(yīng)用不理想的最主要的問(wèn)題。生產(chǎn)廠家對(duì)試劑盒的原材料、生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制不嚴(yán)格，對(duì)試劑盒的2個(gè)關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)(敏感度和特異度)缺乏合理的控制，過(guò)高的敏感度可能導(dǎo)致特異度降低，過(guò)高的特異度可能導(dǎo)致敏感度下降。此外，抗原的制備方法、純度、濃度、活性也影響試劑盒的質(zhì)量[26]；部分廠家外購(gòu)抗原，質(zhì)量不可控，一般應(yīng)用MTB天然抗原檢測(cè)抗體的敏感度高于大腸埃希菌表達(dá)的MTB重組蛋白[27]，這可能是因?yàn)樘烊豢乖钚暂^高，而大多數(shù)大腸埃希菌表達(dá)的重組蛋白抗原為非可溶性[28]，其空間構(gòu)象可能發(fā)生某些變化而影響了其反應(yīng)性?？乖兌炔桓咭矔?huì)導(dǎo)致與其他細(xì)菌抗原產(chǎn)生交叉反應(yīng)而影響特異度；抗原濃度過(guò)低可影響檢測(cè)的敏感度，而抗原濃度過(guò)高可影響檢測(cè)的特異度。

2.抗原的選擇不同：不同的試劑盒所選擇的MTB抗原并不完全相同，目前已發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性TB患者血清只能識(shí)別大約10%的MTB蛋白，對(duì)不同MTB抗原產(chǎn)生不同水平的抗體[3]；而同一例患者在疾病的不同階段對(duì)不同抗原的免疫反應(yīng)也不同。隨著疾病的發(fā)展，MTB在體內(nèi)增殖、代謝，體液免疫應(yīng)答會(huì)從聚焦膜相關(guān)抗原轉(zhuǎn)向細(xì)胞外蛋白抗原，使得每一例患者血清識(shí)別抗原的種類、數(shù)目和水平都有很大的差異，抗原識(shí)別的個(gè)體差異是人類TB體液免疫的主要特性[29]。Kunnath-Velayudhan等[9]通過(guò)MTB蛋白質(zhì)組芯片檢測(cè)人血清中抗結(jié)核抗體，才發(fā)現(xiàn)13個(gè)與活動(dòng)性TB相關(guān)的蛋白。目前，結(jié)核抗體試劑盒大多數(shù)選擇相對(duì)分子質(zhì)量為38 000(以下采用“38 kD”表示)和相對(duì)分子質(zhì)量為16 000(以下采用“16 kD”表示)的免疫顯性抗原，通常免疫顯性蛋白抗原均含有較多的B細(xì)胞表位。少數(shù)膜蛋白既可能來(lái)源于活菌和死菌，也可能來(lái)源于巨噬細(xì)胞外泌體，而可能被潛伏感染者、活動(dòng)性TB患者和非TB患者血清識(shí)別導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。選擇的抗原若與其他細(xì)菌、尤其是環(huán)境中非結(jié)核分枝桿菌有交叉反應(yīng)也易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[30]。因此，選擇多個(gè)高敏感度、高特異度并有互補(bǔ)性的特異性抗原進(jìn)行組合或融合對(duì)于TB的血清學(xué)診斷是非常重要的[31-32]。

3.體內(nèi)MTB含量及代謝狀態(tài)不同：人體受MTB感染后，從臨床角度可分為2個(gè)階段，即潛伏感染和活動(dòng)性TB；從MTB代謝角度可分為3個(gè)階段，即休眠狀態(tài)、增殖狀態(tài)(活動(dòng)性感染)和活動(dòng)性TB。近年來(lái)的研究表明，感染的MTB菌株不同、生長(zhǎng)狀態(tài)不同則表達(dá)的蛋白也不完全相同[33]，細(xì)胞壁抗原和細(xì)胞外蛋白主要誘導(dǎo)抗結(jié)核抗體的產(chǎn)生，而大多數(shù)潛伏期蛋白不誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，抗體水平與體內(nèi)MTB感染的進(jìn)展、MTB含量及其復(fù)制狀態(tài)相關(guān)[9,34]；通過(guò)研究MTB感染不同階段機(jī)體的體液免疫應(yīng)答可了解宿主與MTB斗爭(zhēng)的歷程。筆者[35-36]以前的研究和Zhang等[11]的研究均發(fā)現(xiàn)：菌陽(yáng)TB患者抗體水平高于菌陰TB患者，活動(dòng)性TB患者高于結(jié)核潛伏感染者，PPD試驗(yàn)陽(yáng)性健康人群抗體水平高于PPD試驗(yàn)陰性健康人群和卡介苗接種的健康人群。Kunnath-Velayudhan 等[9]和Steingart等[21]的研究均證實(shí)體內(nèi)細(xì)菌載量會(huì)增加抗體的反應(yīng)性，這可能是因?yàn)楦髟噭┖兴x擇的抗原大多是細(xì)胞增殖期的細(xì)胞外蛋白或細(xì)胞壁抗原，MTB活躍增殖時(shí)表達(dá)的抗原增多，在體內(nèi)菌量較少時(shí)這些抗原也較少，而MTB潛伏、休眠時(shí)這些增殖期抗原表達(dá)少或不表達(dá)。但也有少數(shù)的研究顯示菌陽(yáng)和菌陰TB患者的抗體水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7,36]。大多數(shù)MTB休眠相關(guān)抗原一般不誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體[10,37]。因此，結(jié)核抗體可作為MTB活動(dòng)感染、進(jìn)展的標(biāo)志物[38-39]。應(yīng)用高質(zhì)量的結(jié)核抗體檢測(cè)試劑在人群中大規(guī)模篩查活動(dòng)性TB，不僅較γ干擾素釋放試驗(yàn)具有較高的敏感度和特異度，而且操作更簡(jiǎn)便、成本更低廉[40]。

4.有TB病史和胸部X線表現(xiàn)異常的非TB患者是導(dǎo)致假陽(yáng)性的主要原因之一[9]：TB患者已治(自)愈后結(jié)核抗體仍存在較長(zhǎng)時(shí)間(12～15個(gè)月)[41]，這可能是部分患者體內(nèi)MTB未完全清除，仍在少量不定期增殖所致。Feng 等[18]的研究顯示，化療前和化療1～6個(gè)月后結(jié)核抗體水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，結(jié)核抗體檢測(cè)不能作為TB療效判斷的指標(biāo)(如好轉(zhuǎn)、治愈)，也不能作為TB復(fù)發(fā)的診斷依據(jù)。但也有一些研究顯示化療后抗體水平下降。

5.檢測(cè)技術(shù)性能不同：目前，我國(guó)臨床常用的結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒大多數(shù)采用膠體金抗體檢測(cè)技術(shù)(如膠體金滲濾法、膠體金免疫層析法)[3,7,22-25]，方法簡(jiǎn)便、快速，且無(wú)需特殊儀器而易在臨床上廣泛開(kāi)展，但其敏感度低；少數(shù)采用ELISA、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記系統(tǒng)等敏感度較高的、半定量的檢測(cè)技術(shù)，能獲得敏感度較高和準(zhǔn)確的結(jié)果。

6.一個(gè)抗體檢測(cè)試劑盒無(wú)法滿足所有年齡段的檢測(cè)需求[42]：成人和嬰幼兒的免疫狀況不同，成人的診斷界限值不一定適合于嬰幼兒。

7.試劑盒選擇的問(wèn)題：大多數(shù)臨床檢驗(yàn)科選擇試劑盒時(shí)較盲目，缺乏科學(xué)的評(píng)估，對(duì)其診斷性能不太了解。

8.臨床評(píng)價(jià)設(shè)計(jì)不合理：采用抗體輔助診斷是為了彌補(bǔ)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)的不足，若以細(xì)菌學(xué)檢查為金標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)免疫學(xué)方法，則使高敏感度的免疫學(xué)檢測(cè)出現(xiàn)大量“假陽(yáng)性”結(jié)果，不能體現(xiàn)免疫學(xué)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，造成大量菌陰肺結(jié)核患者的漏診。因此，WHO 推薦“準(zhǔn)確的微生物或分子檢測(cè)方法”的建議不能完全解決臨床存在的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。此外，許多試劑盒在臨床評(píng)價(jià)時(shí)，只納入健康人群作為陰性對(duì)照組，不能客觀反映試劑的特異度，在健康人群中檢測(cè)的特異度明顯高于非結(jié)核呼吸疾病患者，假陽(yáng)性大多來(lái)自非結(jié)核呼吸疾病患者。因此，必需納入非結(jié)核呼吸疾病人群，以排除呼吸道常見(jiàn)細(xì)菌和病毒感染的干擾。

9.臨床醫(yī)生對(duì)結(jié)核抗體的診斷能力期望值高：免疫學(xué)指標(biāo)是根據(jù)宿主對(duì)MTB產(chǎn)生的免疫應(yīng)答進(jìn)行檢測(cè)的，存在較大的個(gè)體差異，不如可作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌學(xué)指標(biāo)直接檢測(cè)病原菌所具有的高特異度。因此，臨床醫(yī)生不要對(duì)此期望過(guò)高，免疫學(xué)檢測(cè)只是輔助診斷指標(biāo)。

展 望

結(jié)核抗體檢測(cè)應(yīng)用于臨床已有40多年的歷史，結(jié)核抗體檢測(cè)的研發(fā)也已形成一定規(guī)模的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，但在臨床診斷上的總體表現(xiàn)不佳，并未達(dá)到預(yù)期的效果[23，25]，未能發(fā)揮其應(yīng)有的對(duì)TB輔助診斷的作用。2011年WHO“鑒于商業(yè)化血清學(xué)檢測(cè)試劑敏感度和特異度高度可變，存在大量假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果，產(chǎn)品質(zhì)量低，強(qiáng)烈呼吁停止血清學(xué)檢測(cè)用于肺結(jié)核、肺外結(jié)核的診斷”。面對(duì)上述存在的問(wèn)題，建議未來(lái)采取以下應(yīng)對(duì)措施：(1)生產(chǎn)廠家嚴(yán)把產(chǎn)品質(zhì)量關(guān)；(2)國(guó)家監(jiān)管部門加強(qiáng)上市產(chǎn)品的監(jiān)管；(3)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)試劑盒定期評(píng)估和選擇，為臨床提供準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是結(jié)核實(shí)驗(yàn)室的職責(zé)；(4)抗體檢測(cè)技術(shù)及方法尚需不斷地發(fā)展、完善：如開(kāi)展新的抗原、標(biāo)記物、檢測(cè)技術(shù)等的研究。

隨著MTB致病機(jī)制的進(jìn)一步闡明、對(duì)人類與MTB相互作用的免疫應(yīng)答機(jī)制的深入了解，以及我國(guó)企業(yè)產(chǎn)業(yè)化水平的不斷提高，相信結(jié)核抗體檢測(cè)在臨床上將能發(fā)揮其應(yīng)有的作用。

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10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.003

100091 北京，解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所 全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

吳雪瓊,Email: xueqiongwu@139.com

2017-12-02)

薛愛(ài)華)