紀(jì) 洋，于海洋，CONRAD Ralf ，徐 華*

(1 南京信息工程大學(xué)應(yīng)用氣象學(xué)院，南京 210044；2 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所)，南京 210008；3 Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, Marburg 35043)

稻田是大氣 CH4排放的重要來(lái)源，其 CH4排放量達(dá)25.6 Tg/a[1]。我國(guó)水稻種植面積占世界總種植面積的20%，其水稻產(chǎn)量占世界總量的32%～35%[2]。稻田CH4排放包括 CH4產(chǎn)生、再氧化和傳輸3個(gè)過(guò)程[3]，其中前兩個(gè)過(guò)程與土壤中產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的數(shù)量及活性密切相關(guān)。產(chǎn)甲烷菌功能基因mcrA控制甲烷化的最后一步反應(yīng)，將輔酶M連接的甲基催化還原為CH4[4]，甲烷氧化菌功能基因pmoA編碼利用甲烷的第一個(gè)關(guān)鍵酶，將甲烷氧化為甲醇[5]。因而稻田土壤中含有上述基因的功能微生物種群豐度結(jié)構(gòu)及其演變規(guī)律受到廣泛關(guān)注。

以前期淹水、中期烤田和后期干濕交替為特征的間隙灌溉是我國(guó)稻田主要的水分管理措施[1]。大量研究表明，相對(duì)于持續(xù)淹水，稻田烤田可顯著抑制水稻生長(zhǎng)期 CH4排放。水稻生長(zhǎng)季持續(xù)淹水造成稻田極端厭氧，有利于 CH4的產(chǎn)生排放；相反，間隙灌溉模式下烤田增加土壤通透性，土壤中原有的還原狀態(tài)被破壞，土壤Eh迅速增加，土壤CH4的生成受到限制[6]；烤田期間土壤氧化CH4能力的提高是導(dǎo)致CH4排放減少的另一個(gè)原因[7-8]。然而有關(guān)間隙灌溉抑制稻田 CH4排放的微生物機(jī)理尚不清楚?？蒯尫适羌冗m應(yīng)作物全生長(zhǎng)季不同生育階段氮素營(yíng)養(yǎng)的需求，而又不使土壤中剩余無(wú)機(jī)氮濃度過(guò)高的一種可控釋放氮肥。目前有關(guān)控釋肥對(duì)稻田 CH4排放影響的研究結(jié)果不一致。李方敏等[9]大田試驗(yàn)研究表明，稻季控釋肥處理CH4排放量是尿素處理的2～3倍；林匡飛等[10]兩季稻試驗(yàn)表明控釋肥施用均顯著降低50% 左右的早、晚稻CH4排放量；筆者前期研究發(fā)現(xiàn)稻季尿素處理和控釋肥處理 CH4排放量之間無(wú)顯著差異[11]。然而有關(guān)控釋肥施用對(duì)稻田土壤微生物種群的影響，尤其是對(duì)與 CH4排放相關(guān)的功能微生物種群的了解很少。羅蘭芳等[12]研究表明，短期施用控釋氮肥的稻田土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量明顯高于不施氮處理；土壤氨化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌的數(shù)量比尿素處理低；但控釋氮肥處理的周年土壤細(xì)菌、放線菌數(shù)量明顯高于尿素處理，真菌數(shù)量略低于尿素處理，說(shuō)明控釋肥能明顯增加土壤微生物的數(shù)量。劉蕊等[13]發(fā)現(xiàn)控釋尿素提高了小麥近根區(qū)土壤微生物的功能多樣性和活性，促進(jìn)了小麥近根區(qū)養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)。張怡等[14]研究發(fā)現(xiàn)控釋肥增加了覆膜栽培稻田土壤細(xì)菌數(shù)量，提高了土壤微生物生物量氮。以上研究均采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法，對(duì)土壤微生物的認(rèn)識(shí)十分有限。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，基于16S rDNA基因及其他功能基因的非培養(yǎng)技術(shù)，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，克隆文庫(kù)技術(shù)(Clone)和核酸定量技術(shù)(real-time PCR)的出現(xiàn)為揭示自然環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的分子生態(tài)學(xué)研究開(kāi)辟了一個(gè)全新的研究平臺(tái)[15]。

本研究通過(guò)采集稻季田間原位試驗(yàn)新鮮土樣，采用核酸定量技術(shù)(qPCR)和末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(T-RFLP)，研究間隙灌溉和控釋肥施用對(duì)與CH4排放相關(guān)的土壤微生物群落豐度和結(jié)構(gòu)的影響，探討不同水肥管理?xiàng)l件下稻田CH4排放的微生物機(jī)理，從而為農(nóng)田系統(tǒng)溫室氣體減排提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方案及樣品采集

供試土壤是采自于2011年江蘇省句容市行香鎮(zhèn)(31°58′N, 119°18′E)水稻生長(zhǎng)季田間原位新鮮土。試驗(yàn)地屬北亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫15.1℃，年平均降雨量為1 100～1 200 mm。試驗(yàn)土壤為發(fā)育于下蜀黃土的爽水性水稻土，其基本理化性質(zhì)為：pH 6.91，有機(jī)碳含量為18.9 g/kg，全N含量為1.2 g/kg，砂粒(2～0.02 mm)14%，粉粒(0.02～0.002 mm)69%，黏粒(＜0.002 mm)17%，土壤WHC為 55%。

試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理：①對(duì)照處理(CK)：不施氮肥；②尿素處理(U)：稻季尿素施用量為N 240 kg/hm2，麥季尿素施用量為N 200 kg/hm2；③控釋肥處理(C)：與尿素處理相同施氮量。本試驗(yàn)所施用的控釋肥為山東金正大生態(tài)工程股份有限公司生產(chǎn)的可降解樹(shù)脂包膜尿素肥料，含氮量為42%。小區(qū)面積均為3 m ×5 m，每個(gè)處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。

田間管理措施與當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的大田管理相同。稻季尿素按基肥∶分蘗肥∶穗肥為 50%∶25%∶25% 施用(施用時(shí)間分別為2011年7月2日、7月22日和8月20日)；控釋肥作為基肥一次性施入。所有處理均施用450 kg/hm2的過(guò)磷酸鈣和225 kg/hm2的氯化鉀，作為基肥一次性施入。水稻品種為華粳3號(hào)，

于7月2日移栽(水稻移栽密度為24穴/m)，11月6日收割。水分管理參照當(dāng)?shù)氐咎锍Ｒ?guī)管理方式，采用傳統(tǒng)的前期淹水(7月1日—8月1日)、中期烤田(8月2日—8月13日)、后期干濕交替(8月14日—10月7日)和末期排水落干(10月8日—11月6日)的管理模式。

稻季土壤樣品分別在淹水期(7月23日)、烤田初期(8月3日)、烤田末期(8月11日)和水稻成熟前排水落干期(11月4日)采集。各小區(qū)按“S”形多點(diǎn)采樣法取表層(0～15 cm)土壤混合。取200 g新鮮土壤用液氮冷凍后-80 ℃ 保存，供分子生物學(xué)研究。

1.2 土壤DNA提取

稱取 0.5 g 土壤用 Fast DNA SPIN KIT 試劑盒(MP Biomedicals, Eschwege, Germany)提取總DNA，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所提 DNA 質(zhì)量與長(zhǎng)度通過(guò) 1%凝膠電泳檢測(cè)。所得 DNA 均稀釋 10 倍后再進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。

1.3 定量PCR

細(xì)菌16S rRNA基因、古菌16S rRNA基因、產(chǎn)甲烷菌功能基因mcrA和甲烷氧化菌功能基因pmoA的定量PCR分析均采用SYBR Green染色法。各基因定量PCR所用的引物和參考文獻(xiàn)如表1所示。

表1 各目標(biāo)基因定量PCR所用引物及參考文獻(xiàn)Table 1 Primers and references used in qPCR

1.4 古菌的T-RFLP分析

根據(jù)不同處理下古菌 T-RFLP 圖譜的差異研究間隙灌溉和控釋肥施用對(duì)稻田土壤古菌群落結(jié)構(gòu)的影響。采用正向引物為 109f，反向引物為 915r[16]，其中反向引物 5′ 端用 6-羧基二乙酸熒光素(FAM)標(biāo)記的古菌通用引物擴(kuò)增古菌 16S rRNA 片段[17]。擴(kuò)增后的產(chǎn)物用TaqI進(jìn)行消化酶切，酶切產(chǎn)物用ABI 3130 DNA sequencer(Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序分析。T-RFLP圖譜中每一個(gè)限制性片段(T-RF)作為一個(gè) OTU(operational taxonomic unit)，T-RFs片段大小 ±1 bp是同一個(gè)OTU。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 13.0 for Windows(SPSS Inc., USA)軟件對(duì)不同處理的功能基因數(shù)目進(jìn)行顯著性差異分析(One-way ANOVA)。采用R3.0.0軟件對(duì)不同處理古菌 T-RFs片段結(jié)構(gòu)進(jìn)行典型相關(guān)性分析(canonical correspondence analysis，CCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻季土壤微生物的群落豐度

圖 1表示稻季不同水分管理時(shí)期土壤細(xì)菌、古菌、產(chǎn)甲烷菌(mcrA)和甲烷氧化菌(pmoA)群落豐度變化。土壤中檢測(cè)到的細(xì)菌數(shù)量多于古菌，介于2.1×109～6.0×109copies/g干土之間。隨著水稻生長(zhǎng)，各處理細(xì)菌數(shù)量逐漸降低。與不施氮肥的對(duì)照處理相比，在水稻生長(zhǎng)前期的淹水期、烤田期和烤田末期，施用尿素和控釋肥均促進(jìn)細(xì)菌數(shù)量增加，其中尿素處理細(xì)菌數(shù)量高于控釋肥處理；而在水稻收獲前的落干期，施用尿素降低細(xì)菌數(shù)量，施用控釋肥對(duì)細(xì)菌數(shù)量沒(méi)有明顯影響。檢測(cè)到的古菌數(shù)量在 1.3×108～3.8×108copies/g干土之間，隨著水稻生長(zhǎng)，各處理古菌數(shù)量逐漸增加。與不施氮肥的對(duì)照處理相比，施用尿素和控釋肥均降低稻季古菌數(shù)量；與尿素相比，施用控釋肥增加土壤中古菌數(shù)量。

產(chǎn)甲烷菌(mcrA)數(shù)量分別介于 5.0×106～2.1×107copies/g干土之間?？咎锍跗诤涂咎锬┢诘漠a(chǎn)甲烷菌數(shù)量均小于淹水期和收獲前的落干期。在淹水期，水稻正處于幼苗期，施用尿素和控釋肥均促進(jìn)產(chǎn)甲烷菌數(shù)量增加，隨著水稻生長(zhǎng)，氮肥施用逐漸抑制產(chǎn)甲烷菌生長(zhǎng)。在水稻收獲前的落干期期，尿素和控釋肥均顯著抑制產(chǎn)甲烷菌生長(zhǎng)，其中控釋肥處理產(chǎn)甲烷菌數(shù)量高于尿素處理。甲烷氧化菌(pmoA)數(shù)量介于 1.2× 107～4.2×107copies/g干土之間，且隨著水稻的生長(zhǎng)而增加。在水稻生長(zhǎng)前期的淹水期、烤田初期和末期，尿素施用抑制甲烷氧化菌生長(zhǎng)，隨著水稻的生長(zhǎng)，在水稻收獲前的落干期，尿素施用促進(jìn)甲烷氧化菌生長(zhǎng)；在整個(gè)稻季，控釋肥施用抑制甲烷氧化菌生長(zhǎng)，但其抑制作用小于尿素處理。

圖1 稻季土壤微生物的群落豐度Fig. 1 Abundances of soil microorganisms during the rice growing season

2.2 稻季古菌群落的T-RFLP對(duì)比分析

根據(jù)毛細(xì)管凝膠電泳分離后所得到的有效T-RF數(shù)目來(lái)確定樣品中古菌種群數(shù)，每個(gè)T-RF所對(duì)應(yīng)峰的面積反映了該種群的豐度，而每個(gè)不同長(zhǎng)度 T-RF的峰面積在所有T-RF的峰面積總和中的比例可以反映這個(gè)片斷在酶切產(chǎn)物中的相對(duì)豐度，從而間接反映出這個(gè)片斷所代表的物種在微生物群落中的相對(duì)豐度。圖2表示水稻不同生長(zhǎng)時(shí)期古菌群落組成的T-RF相對(duì)豐度變化。

由圖2可知，整個(gè)水稻生長(zhǎng)季，土壤古菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，優(yōu)勢(shì)T-RFs長(zhǎng)度為184 bp和391 bp，相對(duì)豐度分別是23%～55% 和11%～26%。184 bp片段在處于水稻生長(zhǎng)前期的淹水期和烤田初期相對(duì)豐度較高(45%～55%)，但隨著烤田的進(jìn)行逐漸下降，在烤田末期和水稻收獲前的落干期僅占23%～30%；而391bp片段逐漸增加，其相對(duì)豐度由12%～18% 增至23%～26%，說(shuō)明在水稻生長(zhǎng)季，隨著間隙灌溉的進(jìn)行，古菌群落結(jié)構(gòu)處于動(dòng)態(tài)變化中。圖3所示為利用典型相關(guān)性分析(CCA)研究間隙灌溉和氮肥施用對(duì)土壤古菌群落結(jié)構(gòu)的影響。CCA分析表明間隙灌溉顯著影響土壤古菌群落結(jié)構(gòu)(P＜0.001)，其中淹水期和烤田前期、烤田末期、收獲前落干期的土壤古菌群落聚集于3個(gè)不同區(qū)域。而控釋肥和尿素施用對(duì)土壤古菌群落結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯影響，不施氮處理、尿素處理和控釋肥處理土壤古菌群落聚集區(qū)域沒(méi)有明顯規(guī)律。

圖2 稻季土壤古菌的群落組成Fig. 2 Archaeal community composition in the soils during the rice growing season

圖3 稻季土壤古菌群落結(jié)構(gòu)的典型性對(duì)應(yīng)分析(CCA)Fig. 3 Canonical correspondence analysis (CCA) of archaeal community composition in the soils during the rice growing season

3 討論

3.1 稻季CH4排放與土壤微生物豐度的關(guān)系

土壤微生物在稻田 CH4的產(chǎn)生和排放中發(fā)揮著重要作用。稻田 CH4排放包括 CH4產(chǎn)生、再氧化和傳輸3個(gè)過(guò)程[3]，其中前兩個(gè)過(guò)程都與產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌數(shù)量及活性密切相關(guān)[5]。陳中云等[23]研究發(fā)現(xiàn)水稻田土壤的甲烷排放量受到甲烷氧化菌、產(chǎn)甲烷菌種群數(shù)量及其活性及土壤理化性狀的影響。結(jié)合筆者2011年在本原位試驗(yàn)地所測(cè)得的稻季CH4排放數(shù)據(jù)(表2)[11]，我們發(fā)現(xiàn)稻田CH4排放量與土壤微生物豐度之間存在顯著相關(guān)性(表 3)。稻季不同生長(zhǎng)季CH4排放量與相應(yīng)階段的古菌和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量之間均存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，這與以往研究結(jié)果一致[23-25]。因此，控制農(nóng)田產(chǎn)甲烷菌可以有效減少CH4排放量。

表2 稻季CH4排放量Table 2 CH4 emission during the rice growing season

甲烷氧化菌生長(zhǎng)在“通氣-厭氣”界面，可氧化CH4，消耗大量CH4[26-27]。本研究中稻季CH4排放量與甲烷氧化菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(表 3)。以往研究表明，土壤高濃度 CH4會(huì)促進(jìn)甲烷氧化菌的生長(zhǎng)和活性[28-29]。Zhang等[6]在本試驗(yàn)地的研究表明，CH4產(chǎn)生潛勢(shì)對(duì)稻田 CH4排放量的影響較大，而 CH4氧化潛勢(shì)對(duì)其影響較小。本研究中，由于產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的增加促進(jìn) CH4產(chǎn)生，而高濃度的CH4含量同時(shí)又促進(jìn)甲烷氧化菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)甲烷菌數(shù)量增加對(duì) CH4產(chǎn)生的促進(jìn)作用強(qiáng)于甲烷氧化菌數(shù)量增加對(duì) CH4氧化的促進(jìn)作用，因此產(chǎn)甲烷菌與甲烷氧化菌的數(shù)量同時(shí)與CH4排放呈正相關(guān)關(guān)系。

表3 稻季CH4排放量與土壤微生物豐度的相關(guān)性Table 3 Correlation analysis of CH4 emissions and the abundance of soil microbial communities

3.2 間隙灌溉對(duì)稻季土壤產(chǎn)甲烷微生物豐度和結(jié)構(gòu)的影響

隨著人們節(jié)水意識(shí)的提高，各種水稻節(jié)水灌溉技術(shù)，如“間隙灌溉”、“控制灌溉”“薄淺濕曬”等灌溉模式得到了大面積的推廣應(yīng)用。前期淹水、中期烤田(通?？咎?～10 d)、后期干濕交替(約每周灌溉1 次、期間出現(xiàn)土面落干狀態(tài))至水稻收獲的間隙灌溉模式是一項(xiàng)廣泛推廣的農(nóng)業(yè)措施。大量研究表明，相對(duì)于持續(xù)淹水，稻田烤田可顯著抑制水稻生長(zhǎng)期CH4排放[6-8]，然而有關(guān)間隙灌溉模式對(duì)稻田土壤產(chǎn)甲烷微生物群落結(jié)構(gòu)和功能影響的研究較少。本研究中土壤細(xì)菌、古菌、產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的群落豐度均隨著間隙灌溉的進(jìn)行和水稻的生長(zhǎng)而處于動(dòng)態(tài)變化中。Asakawa和Hayano[30]采用MPN法發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量在整個(gè)稻麥生長(zhǎng)季保持恒定；李大明等[25]研究發(fā)現(xiàn)在水稻生長(zhǎng)旺盛期(分蘗期)產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量顯著高于其他時(shí)期；而 Ma 等[31]通過(guò)研究不同水分管理方式對(duì)稻田產(chǎn)甲烷菌數(shù)量和結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，根際土壤中古菌的數(shù)量在水稻生長(zhǎng)后期有明顯的增加，與持續(xù)淹水相比，干濕交替水分管理方式顯著降低稻田產(chǎn)甲烷菌數(shù)量，增加稻田甲烷氧化菌數(shù)量。本研究中稻季的水分管理參照當(dāng)?shù)氐咎锍Ｒ?guī)管理方式，采用前期淹水、中期烤田、后期干濕交替和末期排水落干的管理模式，為了有效控制水稻分蘗，烤田在水稻生長(zhǎng)的旺期分蘗期進(jìn)行。在淹水期，水稻正處于幼苗期，厭氧環(huán)境有利于產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)；在烤田期，雖然水稻生長(zhǎng)旺盛，但烤田增加了土壤通氣性，破壞了產(chǎn)甲烷菌的生存條件，產(chǎn)甲烷菌數(shù)量下降，達(dá)到最低值；隨著后期干濕交替的進(jìn)行，產(chǎn)甲烷菌所需厭氧環(huán)境逐漸恢復(fù)，根系分泌物的大量產(chǎn)生又為產(chǎn)甲烷菌的增加提供了充足的反應(yīng)底物，產(chǎn)甲烷菌數(shù)量逐漸增加，在水稻收獲前的落干期達(dá)到最大值。甲烷氧化菌數(shù)量隨著水稻生長(zhǎng)而逐漸增加，在收獲前的落干期達(dá)到最大值，烤田對(duì)甲烷氧化菌的數(shù)量沒(méi)有顯著影響，這可能是由于烤田期土壤銨態(tài)氮大部分轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，盡管烤田有利于甲烷氧化菌的生長(zhǎng)，但硝態(tài)氮對(duì)甲烷氧化菌有一定的脅迫作用[32]。

水稻土中的產(chǎn)甲烷古菌群落主要由甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)，甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae)，甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)，甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)和 RC-I，以及相當(dāng)一部分在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上沒(méi)有確定分類的種群[4]。本研究通過(guò)T-RFLP研究稻季土壤古菌群落組成和季節(jié)變化，結(jié)果表明，水稻生長(zhǎng)季古菌群落優(yōu)勢(shì)片段是 184bp和391bp。Ma等[31]研究發(fā)現(xiàn)，水稻生長(zhǎng)季內(nèi)，水稻土產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，且不受間歇性排水的影響。Watanabe等[33]發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在淹水狀況下的水稻種植期，還是干旱的小麥種植期，產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定。而本研究CCA分析表明間隙灌溉顯著影響整個(gè)水稻生長(zhǎng)季古菌群落結(jié)構(gòu)，其中處于水稻生長(zhǎng)前期的淹水期和烤田前期群落結(jié)構(gòu)相似，但隨著烤田的進(jìn)行和水稻的生長(zhǎng)，古菌184bp的T-RF相對(duì)豐度逐漸下降，391bp的T-RF相對(duì)豐度逐漸上升。根據(jù)已有研究中古菌 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[4]，184bp的T-RF通常代表乙酸發(fā)酵型產(chǎn)甲烷菌(Methanosarcinaceae)，391bp的 T-RF通常代表氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌(RC-I)，表明水稻生長(zhǎng)季內(nèi)，乙酸型產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度最高，隨著間隙灌溉的進(jìn)行和水稻的生長(zhǎng)，乙酸發(fā)酵型產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度逐漸增加，而氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度逐漸下降。Penning等[34]培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著土壤有機(jī)質(zhì)逐漸分解產(chǎn)生豐富的乙酸，則 CH4產(chǎn)生主要由乙酸發(fā)酵而來(lái)，隨著土壤中乙酸被大量消耗，乙酸發(fā)酵產(chǎn)甲烷途徑逐漸減弱，而H2/CO2還原產(chǎn)甲烷途徑逐漸增強(qiáng)。Zhang等[8]在本試驗(yàn)地研究間隙灌溉下稻田CH4產(chǎn)生途徑的季節(jié)變化，結(jié)果表明，隨著間隙灌溉的進(jìn)行，乙酸發(fā)酵產(chǎn)甲烷途徑由 70% 以上下降到 50% 左右。因此我們可以得到結(jié)論，水稻生長(zhǎng)季內(nèi)，乙酸發(fā)酵型產(chǎn)甲烷菌和氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度的變化決定了 CH4產(chǎn)生途徑的變化。

3.3 控釋肥施用對(duì)稻季土壤產(chǎn)甲烷微生物豐度和結(jié)構(gòu)的影響

控釋肥作為一種新型肥料，不僅可以提高肥料利用率，有效防止環(huán)境污染，而且具有提高土壤酶活性、增加土壤微生物數(shù)量、降低環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)[35]。孟慶英等[36]研究結(jié)果表明，施用肥料的各個(gè)處理土壤微生物數(shù)量均高于不施肥處理，其中控釋肥施用有利于增加土壤細(xì)菌、土壤氮素含量及玉米產(chǎn)量；羅蘭芳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，短期施用控釋氮肥稻田土壤的細(xì)菌數(shù)量明顯高于不施氮處理，周年土壤細(xì)菌明顯高于尿素處理，土壤中大多數(shù)微生物數(shù)量與土壤氮素養(yǎng)分含量呈正相關(guān)。氮肥養(yǎng)分釋放特性不同，其對(duì)土壤中微生物數(shù)量及土壤中氮素產(chǎn)生影響不同[37]。本研究表明，與不施氮處理相比，施用尿素降低稻季收獲期細(xì)菌數(shù)量，而施用控釋肥增加其數(shù)量，這可能是由于尿素施用量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致高濃度氮的脅迫作用和改變土壤pH，從而影響細(xì)菌的數(shù)量和活性，而控釋肥可調(diào)節(jié)養(yǎng)分釋放模式，滿足作物全生育期對(duì)氮的生理需求，更利于提高土壤氮素含量為微生物創(chuàng)造良好的生存環(huán)境，刺激微生物的生長(zhǎng)和活性。

氮肥施用對(duì)土壤產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的影響較為復(fù)雜。Schimel[38]研究表明氮促進(jìn)植株生長(zhǎng)，為CH4產(chǎn)生提供前體基質(zhì)，從而促進(jìn)產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)和活性；而許靜等[39]研究表明高氮肥施用在一定程度上會(huì)抑制產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)，降低其數(shù)量。本研究中，施用氮肥降低稻季古菌和產(chǎn)甲烷菌豐度，控釋肥的抑制作用小于尿素，這可能是由于尿素施用后通過(guò)硝化作用產(chǎn)生硝態(tài)氮，提升了土壤氧化還原電位，間接抑制產(chǎn)甲烷古菌的生長(zhǎng)。銨態(tài)氮肥對(duì)土壤甲烷氧化菌的影響隨NH4+和CH4濃度的不同而變化[40]，本研究中，稻季生長(zhǎng)前期，氮肥施用降低甲烷氧化菌數(shù)量，但稻季收獲期，氮肥施用增加其數(shù)量，這是由于在稻田高內(nèi)源 CH4濃度的條件下，施用銨態(tài)氮肥對(duì)稻田 CH4氧化菌開(kāi)始表現(xiàn)為抑制作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和銨態(tài)氮的逐漸消失，高濃度 CH4和銨態(tài)氮的存在促進(jìn)了甲烷氧化菌的生長(zhǎng)[41]。以上分析表明稻季施氮處理降低CH4排放量(表2)主要是由于氮肥對(duì)產(chǎn)甲烷菌生長(zhǎng)的抑制作用及其對(duì)水稻生長(zhǎng)前期甲烷氧化菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。水稻生長(zhǎng)前期，與尿素相比，施用控釋肥對(duì)產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌數(shù)量沒(méi)有明顯影響，表3顯示尿素處理和控釋肥處理 CH4排放量之間無(wú)顯著差異，這進(jìn)一步說(shuō)明稻田 CH4排放量與產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌數(shù)量的顯著相關(guān)性。

研究表明，農(nóng)業(yè)管理措施如施肥等會(huì)對(duì)土壤微生物產(chǎn)生重要的脅迫作用。長(zhǎng)期以來(lái)，囿于培養(yǎng)方法，人們對(duì)土壤微生物多樣性特別是古菌和細(xì)菌多樣性所知甚少。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者們結(jié)合DGGE和RFLP等分子標(biāo)記技術(shù)研究了長(zhǎng)期定位施肥對(duì)土壤產(chǎn)甲烷古菌和氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)的影響[42]，但尚無(wú)關(guān)于控釋肥施用對(duì)稻季古菌群落結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道。Watanabe等[33]研究發(fā)現(xiàn)土壤中的產(chǎn)甲烷古菌主要受土壤類型的影響，而受土壤施肥制度與作物種植方式的影響相對(duì)較小，原因可能與產(chǎn)甲烷古菌主要介導(dǎo)了淹水土壤中丙酸鹽的厭氧氧化有關(guān)。本研究通過(guò)采用T-RFLP手段研究氮肥施用對(duì)水稻生長(zhǎng)季土壤古菌群落結(jié)構(gòu)的影響，得到與上述研究相似的結(jié)果，雖然在水稻生長(zhǎng)季，古菌群落結(jié)構(gòu)處于動(dòng)態(tài)變化中，但控釋肥和尿素施用對(duì)土壤古菌群落結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯影響。辜運(yùn)富等[43]研究表明石灰性紫色土上種植水稻和小麥會(huì)對(duì)土壤中的古菌群落結(jié)構(gòu)造成明顯影響，不同施肥制度對(duì)土壤古菌群落結(jié)構(gòu)相似性具有明顯影響。目前有關(guān)施用無(wú)機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性的影響報(bào)道存在矛盾之處，可能與無(wú)機(jī)肥的種類、施用量和施用時(shí)間長(zhǎng)短、土壤類型和利用方式等因素有關(guān)。以往研究表明，控釋肥養(yǎng)分采用緩慢釋放的形式，改變了普通速溶肥料養(yǎng)分供應(yīng)集中的特點(diǎn)，提高養(yǎng)分利用率的同時(shí)可減少施肥量，能減輕施肥對(duì)環(huán)境的污染[44]。本研究中控釋肥施用量與尿素施用量相同，在保證作物產(chǎn)量的前提下減少控釋肥施用量會(huì)對(duì)土壤微生物群落，尤其是功能微生物，產(chǎn)生不同的影響嗎？因此，有關(guān)控釋肥施用對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)采集水稻生長(zhǎng)季田間原位試驗(yàn)新鮮土樣，采用核酸定量技術(shù)和末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)，研究間隙灌溉和控釋肥施用對(duì)稻田土壤產(chǎn)甲烷微生物群落豐度和結(jié)構(gòu)的影響，以探討間隙灌溉和控釋肥施用影響稻田 CH4排放的微生物機(jī)理。結(jié)果表明，稻季CH4排放量與古菌、產(chǎn)甲烷菌(mcrA基因)和甲烷氧化菌(pmoA基因)數(shù)量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，而與細(xì)菌數(shù)量無(wú)顯著相關(guān)性。在間隙灌溉水分管理方式下，稻田土壤產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌數(shù)量呈現(xiàn)明顯的季節(jié)變化，其中烤田抑制產(chǎn)甲烷菌生長(zhǎng)，而對(duì)甲烷氧化菌數(shù)量沒(méi)有顯著影響。與尿素相比，施用控釋肥增加了稻田土壤細(xì)菌、古菌和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量，降低了甲烷氧化菌數(shù)量。土壤古菌群落的優(yōu)勢(shì) T-RFs長(zhǎng)度為184bp和391bp，其中184bp片段的相對(duì)豐度隨著間隙灌溉的進(jìn)行逐漸降低為主，而391bp片段逐漸增加。CCA分析表明間隙灌溉顯著影響土壤古菌

群落結(jié)構(gòu)，而控釋肥施用對(duì)土壤古菌群落結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯影響。

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