張晶晶 石亞楠

心力衰竭(heart failure, HF)是各種心臟疾病的終末階段, 目前仍有較高的致死率。既往多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在體外能夠刺激活化的人的PBMC、鼠的脾臟細(xì)胞和分離純化的CD4+ T細(xì)胞產(chǎn)生CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞［1］。陶恩學(xué)［2］認(rèn)為人類MSCs可以通過(guò)上調(diào)通CD4+CD25+Treg細(xì)胞而改變患者的免疫系統(tǒng)從而改善心功能。所以本研究通過(guò)觀察hUC-MSCs對(duì)HF患者PBMC增殖能力的影響,探討hUC-MSCs對(duì)HF的免疫調(diào)節(jié)作用, 為hUC-MSCs治療HF提供新的免疫學(xué)理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料 臍帶來(lái)源：經(jīng)產(chǎn)婦同意后按照醫(yī)院規(guī)定取自河南省人民醫(yī)院產(chǎn)科足月健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦。人外周血來(lái)源：經(jīng)患者同意后按醫(yī)院規(guī)定取自河南省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科二住院9例HF患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：①確診為HF≥3個(gè)月, HF診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2014》；②美國(guó)紐約心臟病學(xué)會(huì)(NYHA)分級(jí)為Ⅱ～Ⅳ級(jí)；③射血分?jǐn)?shù)＜40%。

1.2方法與步驟

1.2.1人臍帶源MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 無(wú)菌條件下取臍帶標(biāo)本, 分離出華通氏膠組織后用PBS反復(fù)沖洗后剪成大小約1 mm3小碎塊, 置于T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng), 培養(yǎng)至第3代后將細(xì)胞消化離心成濃度為≥1×106/ml單細(xì)胞懸液, 流式細(xì)胞儀檢測(cè)hUC-MSCs特異性表面抗原。

1.2.2hUC-MSCs生長(zhǎng)曲線測(cè)定 取第3代hUC-MSCs制成濃度為1×104/ml細(xì)胞懸液, 向各孔中加入MTT重新置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h, 后吸去MTT, 在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔細(xì)胞的吸光度值A(chǔ), 連續(xù)檢測(cè)9 d后以天數(shù)為橫坐標(biāo),細(xì)胞的吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo), 繪制出hUC-MSCs生長(zhǎng)曲線。

1.2.3hUC-MSCs對(duì)PHA作用下HF患者PBMC增殖能力的影響

1.2.3.1實(shí)驗(yàn)分組 A組：PBMC+PHA；B組：PBMC+PHA+2×105個(gè)/ml hUC-MSCs；C組：PBMC+PHA+2×104個(gè)/ml hUC-MSCs；D 組：PBMC+PHA+2×103個(gè)/ml hUC-MSCs；E組：2×105個(gè) /ml hUC-MSCs；F組：2×104個(gè)/ml hUC-MSCs；G組：2×103個(gè) /ml hUC-MSCs。

1.2.3.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程 第3代hUC-MSCs培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,PBMC(密度梯度離心法分離出HF患者PBMC)以2×105個(gè)/ml接種于絲裂霉素C處理的hUC-MSCs上, 加入PHA以刺激PBMC增殖, 培養(yǎng)72 h后, 加入MTT繼續(xù)孵育4 h, 在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于570 nm處測(cè)量各孔細(xì)胞的吸光度值A(chǔ), 計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率=［對(duì)照空白PBMC的A值-(實(shí)驗(yàn)孔A值-相同hUC-MSCs濃度空白對(duì)照孔A值)］/對(duì)照空白PBMC的A值×100%。

1.2.4hUC-MSCs培養(yǎng)上清對(duì)PHA作用下的HF患者PBMC增殖能力的影響

1.2.4.1實(shí)驗(yàn)分組 A組：RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%FBS)培養(yǎng)組；B組：hUC-MSCs培養(yǎng)上清+RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)組(1：1)；C 組：hUC-MSCs培養(yǎng)上清 (含10%FBS)培養(yǎng)組。

1.2.4.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程 ①條件培養(yǎng)基配制：將1.5×106個(gè)第3代hUC-MSCs細(xì)胞接種于T75培養(yǎng)瓶中, 加入15 ml含10%FBS的低糖DMEM完全培養(yǎng)基, 待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。②hUC-MSCs培養(yǎng)上清對(duì)PHA作用下的HF患者PBMC增殖能力的影響：按實(shí)驗(yàn)分組重懸PBMC, 加入PHA以刺激PBMC增殖培養(yǎng)72 h后, 每孔加入MTT繼續(xù)孵育4 h, 在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于570 nm處測(cè)量各孔細(xì)胞的吸光度值A(chǔ), 計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率=(對(duì)照正常培養(yǎng)基培養(yǎng)PBMC的A值-條件培養(yǎng)基培養(yǎng)PBMC的A值)/對(duì)照正常培養(yǎng)PBMC的A值×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 多組間比較采用單因素方差分析, 兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1hUC-MSCs免疫表型鑒定 流式鑒定結(jié)果顯示CD29、CD44為陽(yáng)性, CD34、CD45為陰性。

2.2hUC-MSCs生長(zhǎng)曲線 MTT檢測(cè)法的結(jié)果顯示第3代hUC-MSCs生長(zhǎng)情況基本為：第1～2天細(xì)胞處于潛伏期。第3～6天開始細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 呈明顯的增殖狀況, 且生長(zhǎng)迅速。第6～7天后細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期。

2.3hUC-MSCs對(duì)PHA激活的HF患者PBMC增殖能力的影響 多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)hUC-MSCs對(duì)PHA作用下PBMC增殖抑制的結(jié)果顯示hUC-MSCs對(duì)PHA作用下PBMC增殖呈抑制作用, 且此作用呈劑量依賴性, B組、C組、D組增殖抑制率分別為(74.92±1.17)%、(51.56±4.36)%、(25.24±2.24)%, 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.4hUC-MSCs培養(yǎng)上清對(duì)PHA激活的HF患者PBMC增殖的影響 多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)hUC-MSCs條件培養(yǎng)上清對(duì)PHA作用下PBMC增殖抑制作用呈劑量依賴性, B組、C組增殖抑制率分別為(25.82±2.26)%、(39.52±4.12)%, 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3　討論

目前許多研究顯示, MSCs移植可緩解HF患者臨床癥狀, 改善其心功能［3-6］。本實(shí)驗(yàn)中選取hUC-MSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 首先研究了hUC-MSCs對(duì)于HF患者PBMC增殖能力的影響, 本實(shí)驗(yàn)中首先采取直接接觸法培養(yǎng)細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)hUCMSCs可呈劑量依賴性抑制PHA激活的HF患者PBMC增殖, 當(dāng)hUC-MSCs與PBMC以1：1相互作用時(shí), 抑制率高達(dá)(74.92±1.17)%, 提示細(xì)胞與細(xì)胞間直接接觸在hUC-MSCs對(duì)于HF患者的免疫抑制過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用, 隨后采用“未激活”的hUC-MSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)PHA刺激下的HF患者的PBMC, 發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基能夠抑制PBMC的增殖, 抑制率為(39.52±4.12)%, 雖然其抑制增殖能力較MSCs-PBMC直接接觸途徑差, 但仍說(shuō)明hUC-MSCs具有固有免疫分泌能力抑制HF患者PBMC增殖反應(yīng), 這與陶恩學(xué)［2］的研究是一致的, 具體可能是通過(guò)上調(diào)CD4+CD25 Treg細(xì)胞。有研究表明慢性HF患者存在免疫調(diào)節(jié)功能受損, 正是通過(guò)測(cè)定CD4+CD25 Treg細(xì)胞水平得出的結(jié)論［3］。

綜上所述, hUC-MSCs呈劑量依賴性抑制PHA刺激下HF患者PBMC增殖, hUC-MSCs條件培養(yǎng)基同樣可抑制此過(guò)程, 但抑制程度較輕, 仍提示hUC-MSCs具有固有免疫分泌能力參與此抑制過(guò)程, 為hUC-MSCs對(duì)HF患者的免疫治療提供了新的理論依據(jù)。

［1］ 何偉剛.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與負(fù)向免疫調(diào)控及免疫耐受.國(guó)際腫瘤學(xué)雜志, 2006, 33(5)：324-328.

［2］ 陶恩學(xué).骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)鼠心力衰竭CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞的影響.濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2014(5)：334-336.

［3］ 胡澤平, 王邦寧, 李嘉嘉.慢性心力衰竭患者外周血CD4+CD25+ CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的變化.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) , 2010, 45(1)：98-101.

［4］ 張玉琳, 王靜文, 于紀(jì)棉.人臍帶和骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞增殖能力的影響.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床, 2014(4)：433-435.

［5］ 陳璇.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清的免疫抑制作用研究.廣東藥學(xué)院, 2014.

［6］ 田甜.人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心力衰竭患者CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響.鄭州大學(xué), 2016.