閆 峻，馮 碩，吳 韜，LIU Rong-hua，TSAO Rong

(1.核工業(yè)北京地質(zhì)研究院，北京 100029；2.加拿大農(nóng)業(yè)部圭爾夫食品研究中心，安大略 圭爾夫 N1G5C9)

亞麻子是亞麻科植物亞麻(Linumusitatissimum, L.)的種子，主產(chǎn)于中國、加拿大、阿根廷和美國等地。在我國，亞麻子以內(nèi)蒙、寧夏、新疆等地為主產(chǎn)區(qū)，是主要經(jīng)濟(jì)作物之一，也是高寒地區(qū)的主要油料作物之一[1]。研究表明，亞麻子中主要含有木酚素類[2]、多酚類[3]、黃酮類[3]、不飽和脂肪酸類、糖類、環(huán)肽類以及氨基酸類化合物[4-5]，現(xiàn)已廣泛用于保健品及功能性食品的生產(chǎn)[6-7]。

質(zhì)譜法是分析化合物結(jié)構(gòu)的重要手段之一，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC/MS2)可以同時完成成分分離和結(jié)構(gòu)鑒定，是研究中藥及天然產(chǎn)物復(fù)雜體系化學(xué)成分最有效的手段之一[8]。

現(xiàn)代研究表明，自由基會損傷機(jī)體，與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。傳統(tǒng)的合成抗氧化劑雖然抗氧化能力較強(qiáng)，但是長期服用會產(chǎn)生一定的毒性，甚至可能致畸和致癌。尋找有效清除自由基的中藥或天然產(chǎn)物對于人類健康具有十分重要的意義[9]。目前，常用的抗氧化活性物質(zhì)的體外評價方法主要包括鐵離子還原能力法(FRAP)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除法(DPPH)、氧自由基吸收能力法(ORAC)、電子自旋共振法(ESR)、紫外檢測法(UV)和質(zhì)譜法(MS)等[10]。其中FRAP法和ORAC法具有操作簡單、速度快、重復(fù)性好等特點[11]。

本研究擬在恒定溫度、濕度和光照的條件下使亞麻子發(fā)芽，以獲得不同發(fā)芽時間的樣品。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對亞麻子芽的化學(xué)成分進(jìn)行研究，利用紫外分光光度法對亞麻子發(fā)芽前(0天)和發(fā)芽后(1、2、4、6、8天)樣品的總黃酮和總多酚類成分進(jìn)行定量分析，并采用鐵離子還原能力法(FRAP)、自由基清除能力法(DPPH)和氧自由基吸收能力法(ORAC)對亞麻子發(fā)芽前和發(fā)芽后樣品的抗氧化活性進(jìn)行評價，希望為開發(fā)以亞麻子作為原料的保健品以及功能性食品提供可靠的理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；Finnigan LCQTM離子阱質(zhì)譜儀：美國Finnigan公司產(chǎn)品；自動酶標(biāo)儀：美國Varian公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

亞麻子：由加拿大農(nóng)業(yè)部圭爾夫食品研究中心Krista Power研究員課題組提供，并經(jīng)Tsao Rong研究員鑒定；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,4,6-三吡啶基三嗪、抗壞血酸、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色滿-2-羧基、熒光素鈉鹽、2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽：美國Sigma公司產(chǎn)品；甲醇、乙酸(色譜純)：美國Fisher公司產(chǎn)品；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 樣品制備

精密稱取2 g干燥亞麻子，在水中浸泡過夜，棄去水，將浸泡過的亞麻子放置在鋪有紗布的托盤上，并用紗布覆蓋，在25 ℃和80%濕度條件下使其發(fā)芽，每12 h加5 mL水以保持亞麻子濕潤。分別在第0、1、2、4、6和8天取樣品，并測量不同發(fā)芽時間樣品的長度。將樣品冷凍干燥，測量不同發(fā)芽時間樣品的質(zhì)量。將冷凍干燥后的樣品粉碎，在室溫下用80%甲醇振搖提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮并干燥。將干燥后的浸膏置于10 mL容量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 Phenomenex ODS C18柱(4.6 mm×150 mm×3 μm)；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動相為0.2%乙酸(A)-甲醇(B)；線性梯度洗脫程序：0～40 min(20%～60%B)，40～50 min(60%～100%B)，50～52.5 min(100%～20%B)，52.5～60 min(20%B)；流速0.75 mL/min；檢測波長280 nm。

1.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)；正、負(fù)離子檢測模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～2 000；毛細(xì)管溫度290 ℃；噴霧電壓4.5 kV；殼氣(N2)流速1.2 L/min；輔助氣(N2)流速1.5 L/min。

1.5 紫外分光光度法測定總黃酮和總多酚

1.5.1總黃酮的含量測定 采用Jia等[12]方法對亞麻子不同發(fā)芽時間樣品的總黃酮含量進(jìn)行測定。取兒茶素為對照品，分別配制成0.010、0.040、0.060、0.080和0.100 g/L的溶液，將待測樣品配制成干重濃度為25 g/L的溶液。將1 mL對照品或樣品溶液分別加入15 mL離心管中，向各離心管中分別加入4 mL蒸餾水、0.3 mL 5% NaNO2溶液，靜置5 min后，加入0.3 mL 10% AlCl3溶液，靜置1 min，加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液，最后加入2.4 mL蒸餾水，渦旋振蕩。分別取200 μL各離心管中的溶液加入96孔板中，用自動酶標(biāo)儀在510 nm波長下測定各孔的吸光度值，每個樣品或?qū)φ掌菲叫袦y定3次。測量結(jié)果以每克亞麻子干重相當(dāng)于兒茶素的質(zhì)量 (catechin equivalent per gram of dry weight, CAE)來表示。

1.5.2總多酚的含量測定 采用Tsao等[13]方法對亞麻子不同發(fā)芽時間樣品中的總多酚含量進(jìn)行測定。取沒食子酸為對照品，分別配制成0.000、0.040、0.100、0.300和0.500 g/L溶液，將待測樣品配制成干重濃度為100 g/L溶液。分別取25 μL對照品或樣品溶液加入96孔板中，然后在每孔中加入125 μL 10% Folin-Ciocalteu Reagent (FCR)試劑，靜置10 min，加入125 μL 7.5% Na2CO3溶液，靜置30 min，用自動酶標(biāo)儀在765 nm波長下測定各孔的吸光度值，每個樣品或?qū)φ掌菲叫袦y定3次。測量結(jié)果以每克亞麻子干重相當(dāng)于沒食子酸的質(zhì)量(gallic acid equivalent per gram of dry weight, GAE)來表示。

1.6 抗氧化活性評價

1.6.1鐵離子還原能力法(FRAP) 分別用80%甲醇配制成干重濃度20 g/L的亞麻子不同發(fā)芽時間樣品溶液，待測。取抗壞血酸(Vc)為對照品，分別配制成1 000、500、250、125和62.5 μmol/L的溶液作為對照品溶液。

將300 mmol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH 3.6)，10 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)溶液(溶解于40 mmol/L的HCl中)和20 mmol/L FeCl3溶液以10∶1∶1(V/V/V)混合，配制成FRAP試劑，隨用隨配，并避光保存。取10 μL對照品溶液或待測樣品溶液加入96孔板中，然后迅速加入300 μL FRAP試劑，37 ℃下測定各孔的吸光度值。每個對照品溶液和待測樣品溶液平行測定3次。FRAP法的測量結(jié)果以每克亞麻子干重相當(dāng)于微摩爾Vc的抗氧化能力 (Vc equivalent per gram of dry weight, VcE)來表示。

1.6.2自由基清除能力法(DPPH) 將亞麻子不同發(fā)芽時間樣品分別用80%甲醇配制成干重濃度為20 g/L的溶液，待測。

將1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)用甲醇配制成濃度為65 μmol/L的溶液，隨用隨配，并避光保存。將20 μL甲醇和100 μL DPPH溶液混合作為A0，20 μL待測樣品溶液和100 μL DPPH溶液混合作為Ai，20 μL待測樣品溶液和100 μL甲醇作為Aj。將以上3種混合溶液避光放置30 min，用自動酶標(biāo)儀在515 nm波長下分別測定其吸光度值，每個樣品平行測定3次，其計算公式為：SA%=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%。DPPH法的測量結(jié)果用清除率(%)表示。

1.6.3氧自由基吸收能力法(ORAC) 分別用80%甲醇配制成干重濃度5 g/L的亞麻子不同發(fā)芽時間樣品溶液，待測。取6-羥基-2,5,7,8-四甲基色滿-2-羧基(trolox)對照品，分別配制成100、50、25、12.5和6.25 μmol/L的溶液作為對照品溶液。

取25 μL對照品或待測樣品溶液，加入96孔培養(yǎng)板中，隨后每孔加入150 μL 8.68×10-5mmol/L的熒光素鈉鹽，在37 ℃下靜置30 min后，每孔加入25 μL 153 mmol/L的2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽，用自動酶標(biāo)儀測定1 h內(nèi)曲線下的峰面積(AUC)，每個trolox對照品溶液和待測樣品溶液平行測定3次。ORAC法的測量結(jié)果以每克亞麻子干重相當(dāng)于微摩爾trolox的抗氧化能力 (trolox equivalent per gram of dry weight, TE)來表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞麻子發(fā)芽過程中的長度和質(zhì)量變化

在亞麻子發(fā)芽過程中，第0、1、2、4、6和8天的發(fā)芽圖片示于圖1，不同發(fā)芽時間亞麻子芽的長度和冷凍干燥后的質(zhì)量列于表1。由表1可知，隨著發(fā)芽時間的增加，亞麻子芽的長度逐漸增加，發(fā)芽后亞麻子的質(zhì)量逐漸減小。因為在亞麻子發(fā)芽過程中，消耗種子內(nèi)部能量使其萌發(fā)，沒有加入外部能量，所以隨著發(fā)芽時間的增加，亞麻子的質(zhì)量逐漸減小[14]。

圖1 發(fā)芽前(a)和發(fā)芽1天(b)，2天(c)，4天(d)，6天(e)，8天(f)的亞麻子芽Fig.1 Flaxseeds sprouts before germination (a) and after germination for 1 day (b), 2 days (c), 4 days (d), 6 days (e)and 8 days (f)

2.2 亞麻子芽樣品化學(xué)成分的LC/MS2分析

亞麻子不同發(fā)芽時間(0、1、2、4、6和8天)樣品的高效液相色譜圖示于圖2。由圖2可知，亞麻子發(fā)芽后的樣品出現(xiàn)了許多新的色譜峰，說明亞麻子在發(fā)芽過程中新產(chǎn)生了部分化合物，且隨著發(fā)芽時間的增加，新的色譜峰峰面積逐漸增加，說明新產(chǎn)生的化合物含量隨著發(fā)芽時間的增加而逐漸增加。

采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，以亞麻子發(fā)芽后第8天的樣品為代表，對亞麻子發(fā)芽后樣品的化學(xué)成分進(jìn)行分析，共鑒別出12個化合物，各化合物的LC/MS2數(shù)據(jù)列于表2。

表1 不同發(fā)芽時間亞麻子芽的長度、質(zhì)量和發(fā)芽率Table 1 Lenth, weight and percentage of germination for flaxseed sprouts during germination

圖2 發(fā)芽前(a)和發(fā)芽1天(b)，2天(c)，4天(d)，6天(e)，8天(f)的亞麻子芽樣品HPLC譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of flaxseed before germination (a) and after germination for 1 day (b), 2 days (c), 4 days (d), 6 days (e) and 8 days (f)

序號No保留時間tR/min紫外波長UV/nmm/z(+)m/z(-)質(zhì)譜數(shù)據(jù)MS2化合物Compounds1218-365365：203[M+Na-glc]+，蔗糖[15]185[M+Na-glc-H2O]+2248246，273152-鳥嘌呤?3288260136-腺嘌呤?4335252284284：152[M+H-rib]+鳥苷?5359257268268：136[M+H-rib]+腺苷?61770256，328593593：503[M-H-CH2OHCHOHCHO]-，葡萄糖基芹菜素[16]473[M-H-CH2OH(CHOH)2CHO]-，383[M-H-glc-CHO]-，353[M-H-glc-CH2OHCHO]-72020274，328563563：545[M-H-H2O]-，異夏佛塔苷[17]503[M-H-CH2OHCHO]-，473[M-H-CH2OHCHOHCHO]-，443[M-H-CH2OH(CHOH)2CHO]-，413[M-H-CH2OH(CHOH)3CHO]-，383[M-H-glc]-，353[M-H-glc-CHO]-82094274，328563563：545[M-H-H2O]-，夏佛塔苷[17]503[M-H-CH2OHCHO]-，473[M-H-CH2OHCHOHCHO]-，443[M-H-CH2OH(CHOH)2CHO]-，413[M-H-CH2OH(CHOH)3CHO]-，383[M-H-glc]-，353[M-H-glc-CHO]-92261269，349447447：357[M-H-CH2OHCHOHCHO]-，異葒草苷[16]327[M-H-CH2OH(CHOH)2CHO]-102441271，338431431：341[M-H-CH2OHCHOHCHO]-，牡荊素[17]311[M-H-CH2OH(CHOH)2CHO]-112547272，328563563：503[M-H-CH2OHCHO]-，Apigenin?6?C?glu?8?C?pent[17]473[M-H-CH2OHCHOHCHO]-，443[M-H-CH2OH(CHOH)2CHO]-，383[M-H-glc]-，353[M-H-glc-CHO]-122664269，336431431：341[M-H-CH2OHCHOHCHO]-，異牡荊素[18?19]311[M-H-CH2OH(CHOH)2CHO]-

注：*表示化合物與相對應(yīng)的對照品具有相同的保留時間、質(zhì)荷比和MS2譜

2.3 亞麻子發(fā)芽過程中總黃酮和總多酚類化合物的定量分析

2.3.1線性關(guān)系考察 將0.010、0.040、0.060、0.080和0.100 g/L的兒茶素對照品溶液，按照1.5.1節(jié)的方法，以吸光度(A)對濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得到兒茶素對照品的線性回歸方程為：A=2.395 2C+0.039 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。

將0.00、0.04、0.10、0.30和0.50 g/L的沒食子酸對照品溶液，按照1.5.2節(jié)的方法，以吸光度(A)對濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得到?jīng)]食子酸對照品的線性回歸方程為：A=6.820 5C+0.146 9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2。

2.3.2亞麻子發(fā)芽過程中總黃酮和總多酚類成分的含量 亞麻子不同發(fā)芽時間樣品中總黃酮和總多酚類成分的含量測定結(jié)果列于表3。在亞麻子發(fā)芽過程中，發(fā)芽第1天的樣品中總黃酮和總多酚類成分的含量低于發(fā)芽前樣品中的含量，但隨著發(fā)芽時間的增加，樣品中總黃酮和總多酚類成分的含量逐漸增加。

2.4 亞麻子發(fā)芽過程中抗氧化活性的評價

將1 000、500、250、125和62.5 μmol/L的Vc對照品溶液，以吸光度(A)對濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得到Vc對照品的線性回歸方程為：A=0.001 51C-0.041 9，相關(guān)系數(shù)r=0.997 5。

按照1.6.2節(jié)的方法，分別用自動酶標(biāo)儀測定A0、Ai和Aj，并計算各樣品對DPPH自由基的清除率，以清除率(%)表述樣品的抗氧化活性。

表3 亞麻子發(fā)芽過程中總黃酮和總多酚類成分的含量Table 3 Contents of TFC and TPC in flaxseed during germination

將100、50、25、12.5和6.25 μmol/L的trolox對照品溶液，以吸光度(A)對曲線下的峰面積(AUC)進(jìn)行線性回歸，得到trolox對照品的線性回歸方程為：A=0.308(AUC)-0.777，相關(guān)系數(shù)r=0.995 0。

亞麻子不同發(fā)芽時間樣品的抗氧化活性測定結(jié)果列于表4。由表4可知，在亞麻子發(fā)芽過程中，發(fā)芽第1天的樣品的抗氧化活性低于發(fā)芽前樣品，但隨著發(fā)芽時間的增加，樣品的抗氧化活性逐漸增強(qiáng)。

表4 亞麻子發(fā)芽過程中的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of flaxseed during germination

3 結(jié)論

利用高效液相色譜-二級質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS2)技術(shù)對亞麻子芽的化學(xué)成分進(jìn)行研究，結(jié)果表明，相比于發(fā)芽前，亞麻子發(fā)芽后新產(chǎn)生了12個化合物，包括糖類、核苷類、核酸類和黃酮類成分。利用紫外分光光度法對亞麻子發(fā)芽前后的總黃酮和總多酚類成分進(jìn)行定量分析，并采用鐵離子還原能力法(FRAP)、自由基清除能力法(DPPH)和氧自由基吸收能力法(ORAC)對亞麻子發(fā)芽后的抗氧化活性進(jìn)行評價。結(jié)果表明，亞麻子在發(fā)芽第1天總黃酮和總多酚類成分的含量較發(fā)芽前降低，抗氧化活性下降，發(fā)芽第2天到第8天總黃酮和總多酚類成分的含量逐漸增多，抗氧化活性也逐漸增強(qiáng)。研究表明，黃酮類成分和多酚類成分具有一定的抗氧化活性，也是天然抗氧化劑的主要成分[20-21]?？寡趸钚缘难芯拷Y(jié)果與總黃酮和總多酚含量的測定結(jié)果呈正相關(guān)，說明亞麻子芽中的黃酮類和多酚類成分可能為其抗氧化活性的主要有效成分，與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致。發(fā)芽是提高亞麻子抗氧化能力的一種有效方法。本研究可為亞麻子作為保健品以及功能性食品的原料提供可靠的理論依據(jù)。

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