馬麗莎，李麗春，謝文平，單 奇，劉書貴，尹 怡，戴曉欣，鄭光明

(中國水產(chǎn)科學研究院，珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)種質資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(廣州)， 廣東 廣州 510380)

雌激素是一類新型環(huán)境激素類污染物，普遍存在于我國自然水體中[1-3]，其激素效應是其他常見內分泌干擾物的10 000～100 000倍[4]，能促發(fā)多種癌癥[5]，對人體健康具有嚴重的潛在威脅。由于雌激素可通過水生生物富集，危害生態(tài)安全和人類健康，因此養(yǎng)殖水域的生態(tài)安全問題已成為社會關注的焦點。

目前，關于水環(huán)境中雌激素檢測報道多集中于海水、江河及城市污水[6-8]，尚未見養(yǎng)殖水體的報道。養(yǎng)殖水體的基質成分與上述水體差異較大，如藻類較多、水質粘性大、腐殖酸含量高等。雌酮(E1)、β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)是自然雌激素，炔雌醇甲醚(mestranol)、乙炔雌二醇(EE2)、己烯雌酚(DES)是人工合成的雌激素，它們都是口服避孕藥、畜牧養(yǎng)殖用藥的主要成分，也是水環(huán)境中安全隱患風險較高的雌激素。為加強我國水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境安全管理，建立上述6種雌激素在養(yǎng)殖水域中的檢測方法勢在必行。

雌激素的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜法(GC/MS)及高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)[9-14]等。HPLC法具有一定的普遍性，但其檢出限較高； HPLC-MS/MS法與GC/MS法均具有較高的選擇性和靈敏度，但液質很難排除基質干擾[15]，且儀器價格昂貴；GC/MS法無基質效應且儀器價格適中，實驗室普及率較高，但樣品需衍生化，操作繁瑣、耗時長，使其實際應用受到一定限制。近年來，通過分子極化和離子導電兩個效應在短時間內完成樣品加熱的技術，在樣品提取、消解、衍生等諸多領域得到了廣泛應用[16-21]。

為改進GC/MS法衍生化的操作繁瑣，本工作擬采用微波輔助技術與GC/MS法結合分析養(yǎng)殖水體中的6種雌激素殘留，希望為養(yǎng)殖水體中痕量雌激素類物質的實時監(jiān)測和批量分析提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有電子電離源，HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；旋轉蒸發(fā)儀：日本Eyela公司產(chǎn)品；GAST無油隔膜真空泵及12通道半自動固相萃取裝置：美國嘉仕達公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷：均為色譜純，美國Tedia公司產(chǎn)品；Supelclean ENVI-18 SPE小柱(500 mg/6 mL)：德國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；Oasis HLB 固相萃取柱(500 mg/6 mL)：美國Waters公司產(chǎn)品；G70F 20CN1L-DG(S0)家用微波爐：廣東格蘭仕集團有限公司產(chǎn)品。

雌酮(E1)、雌三醇(E3)、炔雌醇甲醚(mestranol)、乙炔雌二醇(EE2)、β-雌二醇(E2)、己烯雌酚(DES)標準品：均為德國Dr.Ehrenstorfor公司產(chǎn)品；β-雌二醇-D2標準品(E2-D2)：美國Sigma公司產(chǎn)品；己烯雌酚-D8標準品(DES-D8)：加拿大Toronto公司產(chǎn)品。

衍生化試劑：N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯硅烷(TMCS)(99∶1，V/V)，德國r-Biopham公司產(chǎn)品；N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)：美國Regis公司產(chǎn)品。

1.2 標準儲備液及標準工作液的配制

準確稱取適量的雌激素標準品，分別用甲醇溶解并稀釋，配制成濃度均為100 mg/L的單個標準儲備液，于-20 ℃保存。準確移取適量的單個標準儲備液，用甲醇稀釋、定容，配制成6種激素濃度均為1 mg/L的混合標準工作液，于-20 ℃保存。

準確稱取適量的內標，分別用甲醇溶解并稀釋，配制成濃度均為100 mg/L的內標標準儲備液，于-20 ℃保存。準確移取適量的單個內標標準儲備液，用甲醇稀釋、定容，配制成己烯雌酚-D8和雌二醇-D2濃度均為1 mg/L的混合內標工作液，于-20 ℃保存。

1.3 水樣的采集與預處理

采集的水樣保存于棕色瓶中，用HCl調至pH 4以避免微生物降解，保護水樣，置于4 ℃冰箱中保存。

取5 000 mL實際水樣，經(jīng)0.45 μm纖維素膜過濾。取1 000 mL水樣濾液，加入50 μL 1 mg/L的內標工作溶液，混合均勻。采用Supelclean ENVI-18 SPE固相萃取小柱，依次用12 mL甲醇、12 mL超純水活化平衡后上樣，控制過柱流速為3 mL/min。先用12 mL超純水淋洗SPE小柱，再用10 mL正己烷淋洗SPE小柱，速度為3 mL/min，棄去淋洗液。真空干燥30 min后，用18 mL正己烷-二氯甲烷溶液(1∶1，V/V)以1 mL/min的流速分3次洗脫。收集洗脫液，于50 ℃下氮氣吹干，向吹干的殘留物中加入100 μL乙酸乙酯溶液，蓋塞并渦旋混合20 s，再加入100 μL MSTFA衍生化試劑，蓋塞并渦旋混合1 min，于700 W功率下微波衍生4 min，冷卻至室溫，待GC/MS分析。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 色譜柱：HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：高純氦氣，純度大于99.999%，流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；采用脈沖不分流進樣，脈沖壓力207 kPa，持續(xù)時間0.9 min，分流出口開啟時間1 min，進樣體積1 μL；升溫程序：初始柱溫50 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至220 ℃，保持27 min，以20 ℃/min升至250 ℃，保持20 min。

1.4.2質譜條件 離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，溶劑延遲10 min，選擇離子監(jiān)測模式(SIM)。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的選擇

在m/z50～550范圍內進行全掃描，確定各組分的保留時間和特征離子。為降低干擾、提高靈敏度，采用選擇離子監(jiān)測模式，每個化合物選擇1個定量離子、3個定性離子。6種雌激素的保留時間、定性與定量離子及內標物列于表1。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

實驗發(fā)現(xiàn)，采用普通進樣方式分析樣品中雌激素時，其重現(xiàn)性較差。這可能是由于雌激素為弱極性物質，其分子中的羥基易受進樣系統(tǒng)的吸附而損失；且雌激素高溫易分解，較高的進樣口溫度可能導致目標化合物的部分降解。而脈沖不分流進樣方式通過瞬間提高進樣口壓力的方式，減少了樣品在進樣口的停留時間，降低了目標化合物被吸附和分解的風險，可確保進樣量的精確度，以保證雌激素峰組分的重現(xiàn)性，提高靈敏度、改善峰形，更適于痕量、易分解化合物的殘留分析。通過實驗比較發(fā)現(xiàn)，脈沖不分流進樣所得的目標化合物重現(xiàn)性、靈敏度均比普通不分流進樣的好，峰形也更尖銳。因此，本實驗選擇脈沖不分流進樣模式。

表1 6種雌激素的保留時間、定性離子、定量離子與內標物Table 1 Retention times, qualitative ions, quantitative ions and internal standards of 6 estrogens

選擇合適的脈沖壓力是獲得目標峰最佳靈敏度、準確性及重現(xiàn)性的關鍵：脈沖壓力過小對改善目標峰靈敏度、重現(xiàn)性的作用不大；過大會引起進樣口隔墊過早損壞，導致進樣口漏氣，且隔墊碎渣掉入襯管易污染襯管，導致雜峰多，干擾目標物的測定，使重現(xiàn)性變差。實驗發(fā)現(xiàn)，目標物靈敏度、重現(xiàn)性均隨脈沖壓力的增大而增大，但當脈沖壓力大于207 kPa時，進樣口隔墊受損過快。因此，經(jīng)綜合考慮，本實驗選擇脈沖壓力為207 kPa。

2.3 SPE萃取條件的優(yōu)化

2.3.1SPE小柱的選擇 雌酮、雌三醇、炔雌醇甲醚、乙炔雌二醇、β-雌二醇、己烯雌酚均為疏水親脂性化合物。Oasis HLB小柱由親脂性的二乙烯苯和親水性的N-乙烯基吡咯烷酮混合而成，可保留親水和親脂兩方面的化合物，被廣泛應用于飲用水、河流等自然水體中雌激素的殘留分析[1-5]。但實驗發(fā)現(xiàn)，HLB小柱應用于養(yǎng)殖水體中雌激素的殘留分析時，其回收率不穩(wěn)定，在50%～200%之間，相對標準偏差RSD>30%，且背景干擾大。鑒于雌激素是弱極性化合物，本實驗選用Supelclean ENVI-18 SPE小柱萃取養(yǎng)殖水體中的雌激素，獲得了較高的回收率88.5%～106%，相對標準偏差為0.29%～11.9%，且背景干擾小。分析原因，養(yǎng)殖水體受漁業(yè)活動影響較大，水體中的藻類、N、P等親水性雜質含量普遍較高，而這些親水性雜質可競爭HLB小柱上的活性位點，影響雌激素在小柱上的富集，導致其回收率不穩(wěn)定。ENVI-18 SPE小柱主要通過目標物的碳氫鍵同硅膠表面的官能團產(chǎn)生非極性的范德華力來保留目標物，非常適用于水樣中弱極性有機物的富集和純化，其碳含量高達17%，可對弱極性化合物產(chǎn)生更大的鍵合能力，有利于增強小柱對化合物的吸附能力，提高小柱的回收率和穩(wěn)定性。綜上所述，本實驗選擇ENVI-18 SPE小柱富集樣品中的雌激素組分。

圖1 不同洗脫溶劑對6種雌激素回收率的影響Fig.1 Effects of elution solvent on the recoveries of 6 estrogens

2.3.2洗脫劑和淋洗溶劑的選擇 洗脫劑是決定回收率高低的關鍵因素。本實驗比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷-二氯甲烷溶液(1∶1，V/V)4種不同極性溶劑的洗脫效果，結果示于圖1。使用甲醇時，EE2與 mestranol的回收率過低，僅有50%左右；而使用乙腈時，EE2與 mestranol的回收率又過高，達170%以上。因此，甲醇、乙腈均不適于作為雌激素的洗脫溶液。使用乙酸乙酯和正己烷-二氯甲烷溶液作為洗脫劑時，各雌激素的回收率均在100%左右，可滿足實驗要求，但乙酸乙酯的洗脫液顏色略呈黃色，圖譜基線沒有正己烷-二氯甲烷溶液的平整，雜峰也較多。因此，本實驗選擇正己烷-二氯甲烷溶液(1∶1，V/V)作為洗脫溶劑。

另外，由于養(yǎng)殖水樣基質復雜，有必要在洗脫之前對ENVI-18 SPE小柱進行淋洗。本實驗先用12 mL超純水淋洗SPE小柱，除去富集在小柱上的親水性雜質，再用10 mL脂溶性強的正己烷淋洗SPE小柱，除去小柱上色素等非極性雜質，最后用正己烷-二氯甲烷(1∶1，V/V)溶液洗脫，從而獲得比較理想的色譜圖。

2.4 衍生條件的優(yōu)化

2.4.1衍生化方法的確定 傳統(tǒng)的雌激素衍生方法是烘箱加熱或水浴加熱，均是由外部熱源通過熱輻射由表及里進行傳導式加熱，衍生反應時間長、衍生效率低且能耗高，極大地限制了GC/MS法的應用。微波輔助衍生技術通過分子極化和離子導電兩個效應對物質直接加熱，消除了一般加熱過程中由于電熱板、空氣、容器壁的熱傳導和熱輻射造成的熱量損失，具有較高的傳熱效率。本實驗采用該技術加速雌激素的衍生化反應，與傳統(tǒng)加熱法的衍生效果對比圖示于圖2?？梢?，微波輔助衍生法所得6種雌激素衍生物的峰面積均大于烘箱加熱法，增強了GC/MS法檢測雌激素的靈敏度，微波衍生法的衍生化效率比烘箱加熱法的提高了50%左右，雌激素的衍生化時間從烘箱加熱的90 min縮短到4 min。

圖2 不同衍生方式對衍生效果的影響Fig.2 Effects of different derivatize methods

2.4.2衍生化試劑的選擇 分別選用MSTFA與BSTFA-TMCS(99∶1，V/V)兩種常用的硅烷化試劑與雌激素分子的羥基進行硅烷化反應。結果表明，MSTFA可與6種雌激素發(fā)生較好的衍生化反應，而BSTFA-TMCS雖能與E1、E2、E3、DES的羥基進行硅烷化反應，但不與mestranol、EE2發(fā)生反應。根據(jù)化合物的結構進行分析，推測其原因為mestranol、EE2分子的脂族羥基碳鏈上連有其他基團，BSTFA分子較大，不能與mestranol、EE2的反應基團有效結合，而MSTFA分子較小，不受空間位阻效應的影響，能與之結合，得到硅烷化產(chǎn)物。因此，本實驗選用MSTFA為衍生化試劑。此外，極性溶劑能更好地吸收微波，可增強衍生反應效率。本實驗考察了乙腈、乙酸乙酯和正己烷對雌激素衍生效率的影響，結果表明，當乙酸乙酯作為衍生溶劑時，雌激素的衍生效率最高且穩(wěn)定性更好。因此，選用乙酸乙酯作為雌激素的衍生溶劑。

2.4.3微波衍生化方法的優(yōu)化 微波衍生技術是利用微波加熱的特性對樣品中的目標化合物進行衍生反應。該方法優(yōu)化的關鍵因素是衍生化反應時間：反應時間過短，對待測物的衍生反應不徹底；反應時間過長，衍生產(chǎn)物在微波輻照下會發(fā)生降解，且基體中的許多雜質被衍生而生成更多的副產(chǎn)物，產(chǎn)生大量干擾。本實驗在微波700 W時，比較了衍生化時間分別為2、3、4、5 min時，MSTFA的衍生化效率，結果示于圖3?？梢姡S著衍生化反應時間的增加，雌激素衍生化效率逐步提高，在4 min時達最大值，之后開始下降。為防止目標化合物降解，保障其最佳的衍生化效率，本實驗選擇的衍生化條件為700 W衍生4 min。

圖3 不同衍生時間對衍生效果的影響Fig.3 Effects of different derivatize times

2.5 線性關系、方法的檢出限

配制質量濃度分別為1、2、5、25、50、125、250、500 μg/L的8個水平的混合標準工作溶液，取100 μL標準溶液，加入50 μL混合內標使用液，氮氣吹干，之后分別加入100 μL乙酸乙酯溶液及100 μL MSTFA衍生化試劑進行衍生化。在選定的色譜條件和質譜參數(shù)下分析，以目標物的定量離子峰面積和相應內標物的定量離子峰面積之比(y)為縱坐標，以目標物濃度(x，μg/L)為橫坐標，進行線性回歸分析，以信噪比(S/N)為3，結合回收率計算方法檢出限。結果表明，雌激素DES在2～500 μg/L，E2在1～500 μg/L，E1、E3、EE2、mestranol在5～500 μg/L范圍內均呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)(R2)均大于0.999 3。6 種化合物的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)和檢出限列于表2。

表2 6種雌激素的線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及3個添加水平的回收率和相對標準偏差(n=6)Table 2 Linear equations, correation coefficients (R2), limits of detection (LODs), recoveries and relative standard deviations (RSDs) of 6 estrogens in water for aquaculture spiked at three leves (n=6)

2.6 回收率與精密度

取1 L經(jīng)0.45 μm濾膜過濾的養(yǎng)殖用水，用上述方法測出目標化合物含量，作為空白對照組。然后對同一水樣進行3個不同濃度的加標實驗，加標量分別為0.01、0.05、0.1 μg/L，測定目標化合物含量?？鄢瞻缀坑嬎惴椒ɑ厥章?，結果列于表2。6種雌激素的平均回收率為88.5%～106%，相對標準偏差為0.29%～11.9%，均小于15%。因此，所建立的方法具有較好的準確度和精密度，可滿足分析要求，所得的加標回收色譜圖示于圖4。

2.7 實際樣品的檢測

將本實驗建立的方法用于20份池塘養(yǎng)殖水體中雌激素殘留檢測，在其中3份池塘養(yǎng)殖水體中檢出己烯雌酚殘留，含量分別為0.65、0.80和2.8 ng/L，其余雌激素組分無檢出。己烯雌酚作為人造求偶素，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用作生長促進劑。 由此可見，漁業(yè)行為對養(yǎng)殖水體雌激素含量有影響，養(yǎng)殖水體環(huán)境中的雌激素可能由漁業(yè)生產(chǎn)者因盲目追求高產(chǎn)量低成本，不恰當使用求偶素、排卵素等藥物而引起。

3 結論

建立了微波輔助衍生-氣相色譜-質譜法檢測養(yǎng)殖水體中6種痕量雌激素，該方法利用微波加熱的特性衍生樣品中的目標化合物，改進了傳統(tǒng)GC/MS法在樣品前處理中衍生化操作繁瑣、耗時長的不足，使衍生化時間從烘箱加熱的90 min縮短到4 min，提高了樣品前處理的效率，具有高效、快速、靈敏度高、特異性強、節(jié)能環(huán)保的優(yōu)點，可滿足養(yǎng)殖水體中痕量雌激素類物質實時監(jiān)測的需要，適用于養(yǎng)殖水體中雌激素類化合物的批量分析。

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圖4 選擇離子監(jiān)測模式下，養(yǎng)殖用水的加標回收色譜圖Fig.4 Selective ion monitor (SIM) chromatograms of water for aquaculture spiked with estrogens

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