董文靜 李 明 董 武

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

狼毒(Steller Chamaejasme)在中藥中屬于二級毒性藥物而禁用，有瑞香科狼毒和大戟科狼毒。但是狼毒是蒙醫(yī)上常見的有毒抗腫瘤蒙藥[1]。狼毒能夠治療水腫腹脹、痰、食、蟲積、心腹疼痛、慢性氣管炎、咳嗽和氣喘等癥狀，以及治療淋巴結(jié)、皮膚、骨和副睪等部位的結(jié)核、疥癬和痔瘺等疾病。狼毒有很好的抗癌作用，但也具有一定的毒性，家畜誤食后多表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、四肢無力和全身痙攣等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時虛脫，甚至驚厥死亡，其中孕畜接觸會導(dǎo)致流產(chǎn)，人接觸時則會引起過敏性皮炎[2]。

隨著人們的生活水平的提高，危害人類健康的癌癥的發(fā)病率也不斷增加，黑色素瘤是較常見的惡性腫瘤，近年來已經(jīng)成為發(fā)病率增長最快的腫瘤之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，全球每年有132,000的人患有黑褐素瘤，而且預(yù)計還會持續(xù)增長[3]。黑色素瘤的發(fā)病率較高，并且在黑色素瘤第四期快速轉(zhuǎn)移，手術(shù)效果不良，切除手術(shù)治療應(yīng)該慎重選擇[4]。因此迫切需要尋找一種有效藥物來治療黑色素瘤。

有研究發(fā)現(xiàn)狼毒大戟提取液對小鼠體內(nèi)惡性黑色素瘤B16細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用,能顯著減緩腫瘤生長速度，狼毒能下調(diào)小鼠體內(nèi)惡性黑色素瘤B16中Bcl-2/Bax凋亡蛋白的表達(dá)，預(yù)示凋亡細(xì)胞增加而讓腫瘤增長減緩[5]。Catherine M. Scahil等[6]研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚的kdm2aa基因的缺失能夠?qū)е赂哳l率的黑色素瘤，并且黑色素瘤是一種發(fā)生于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，臨床研究發(fā)現(xiàn)在晚期黑色素瘤患者中發(fā)生了BRAF(V600E)的突變[7]，約50%的晚期黑色素瘤患者中有 BRAF( V600E) 突變，在一些研究中其突變率甚至高于 60%[8]。

1 狼毒化學(xué)成分

1.1 瑞香狼毒的化學(xué)成分 瑞香狼毒的化學(xué)成分復(fù)雜，60年代，我國學(xué)者就研究了狼毒的成分，而1982年Masaiake Niwa使用甲醇從瑞香狼毒中分離出瑞香烷型，即二萜成分,具有顯著的抗癌活性[9]。瑞香狼毒中的主要化學(xué)成分有二萜類、雙二氫黃酮類、香豆素類、木脂素和苯丙烯醇昔類等化合物。趙亮[10]通過液相色譜與質(zhì)譜(GC-MS)研究瑞香狼毒提取液發(fā)現(xiàn)，其中化學(xué)成分含有黃酮類化合物，傘形花內(nèi)酯及西瑞香素等香豆素類成分。其中黃酮類化合物含量較高，包括狼毒色原酮、狼毒素、異狼毒素、新狼毒素A、新狼毒素B和狼毒素C等雙二氫黃酮類衍生物。

1.2 大戟科狼毒化學(xué)成分 大戟科狼毒有月腺大戟和狼毒大戟兩類。熊爽[11]從月腺大戟根中分離得到了7種單體，分別是β-香樹脂醇乙酸酯(β-amyrinacetat e)，24-亞甲基環(huán)阿 爾廷醇(24-methylene cycloartanol)，3,3′-二乙?；?4，4′-二甲氧基-2，2′，6，6′-四羥基二苯甲烷(3，3′-diacetyl-4,4′-dimethoxy-2，2′，6，6′tetrahy-droxy-dipheny-lmethane)，巖大戟內(nèi)酯B(jolkinolide B),狼毒乙素(2，4-dihydroxy6-methoxy-3-methy-1-acetoph-enone),月腺大戟甲素(ebractedatanolide A)和β-谷甾醇(β-sitosterol)。鄧彬等[12]從月腺大戟(Euphorbia ebracteolata Hayata)植物根部分離得到8個化合物,分別是巨大戟二萜-3-肉豆蔻酸酯、巨大戟二萜-3-棕櫚酸酯、9,19-環(huán)阿爾廷-23E-稀-3β,25-二醇、24-亞甲基環(huán)阿爾廷烷-3,28-二醇、β-香樹酯醇乙酸酯、狼毒乙素、2,4-二羥基-6-甲氧基-3-醛基苯乙酮和月腺大戟素A。其中化合物巨大戟二萜-3-肉豆蔻酸酯、巨大戟二萜-3-棕櫚酸酯、9,19-環(huán)阿爾廷-23E-稀-3β,25-二醇、24-亞甲基環(huán)阿爾廷烷-3,28-二醇均為首次從該植物中分離得到。而狼毒大戟化學(xué)成分主要為二萜、三萜、鞣質(zhì)、甾醇、蒽醌類等化合物。李青松等[13]用乙醇冷浸提取方法萃取，從狼毒大戟的乙酸乙酯部位得到狼毒乙素、2，4-羥基-6-甲氧基苯乙酮、東莨菪亭、東莨菪苷、二十四烷酸、丁香酸、正丁醇部位得到蔗糖。其中從狼毒大戟中首次分離得到東莨菪苷、二十四烷酸，丁香酸，正丁醇部位得到蔗糖。孫增玉等[14]在狼毒大戟的氯仿部位分離得到7個化合物，分別為23(Z)-環(huán)阿爾廷-23-稀-3β,25-二醇、22(E)-環(huán)阿爾廷-22-稀-3β,25-二醇、Jolkinolide B、2,4-二羥基-6-甲氧基-3-醛基苯乙酮、β-香樹脂醇乙酸酯、Antiquorin、二十四亞甲基環(huán)阿爾廷醇，其中二十四亞甲基環(huán)阿爾廷醇為首次從綠玉樹中分離得到。

2 狼毒抗腫瘤機(jī)理

段昕等[15]研究發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒總黃酮提取物明顯抑制人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的增殖，并且隨著濃度的增加細(xì)胞的抑制率也增強(qiáng)。總黃酮提取物可誘導(dǎo)A549細(xì)胞細(xì)胞凋亡 ,并將細(xì)胞阻滯在G1 期。王蒙等[16]研究發(fā)現(xiàn)，狼毒大戟中松香烷型二萜內(nèi)酯類化合物能夠抑制肝癌HepG-2、乳腺癌MCF-7、宮頸癌Hela、胃癌SGC-7901、BGC-823、MGC-80細(xì)胞的增殖。其中松香烷型二萜內(nèi)酯類化合物jolkinolideB、17-hydroxyjolkinolide B對肝癌細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，jolkinolide A-、jolkinolideB、17-hy droxyjolki nolide B對乳腺癌細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，jolkinolideB ，對胃癌BGC-823、MGC-803細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，17-hydroxyjolkinolide B對胃癌SGC-7901、MGC-803細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用。jolkinolideB、17-hydroxyjolkinolide B對宮頸癌細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用。王莉萍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，狼毒提取液能夠下調(diào)抗細(xì)胞凋亡Bcl-2蛋白和上調(diào)促細(xì)胞凋亡Bax蛋白的表達(dá)、降低 Bcl-2 /Bax 蛋白比率，可能是狼毒提取液誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制惡性黑色素瘤 B16 細(xì)胞生長關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)。王園園等[18]通過體內(nèi)和體外實驗發(fā)現(xiàn)狼毒大戟提取液能夠抑制小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞B16生長和轉(zhuǎn)移，并且誘導(dǎo)小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞B16凋亡。通過上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)并下調(diào)p-Akt蛋白的表達(dá)，降低、p-Akt、MMP-2及P70S6K1及基因含量，調(diào)控PI3K/Akt信號通路活化，抑制小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞B16的生長和轉(zhuǎn)移。通過腹腔注射狼毒大戟提取液發(fā)現(xiàn)可顯著抑制小鼠細(xì)胞移植瘤生長及降低肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率，可上調(diào)B16小鼠移植瘤中的PTEN表達(dá)并下調(diào)p-Akt表達(dá)。最近周昕欣等[19-20]，通過抑制Bcl-2mRNA表達(dá)，增加Caspase3和Caspase9m RNA表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而達(dá)到抑制癌細(xì)胞增長。由此可見狼毒提取液的腫瘤抑制作用有可能是通過激活細(xì)胞凋亡路徑或者活化PI3K/Akt信號通路。

3 黑色素瘤模型以及治療前沿

3.1 小鼠黑色素瘤模型的制作以及治療 小鼠作為黑色素瘤模型被廣泛應(yīng)用，更加便于對黑色素瘤的治療研究。Perez-Torres, A.等[21]在母鼠側(cè)尾靜脈中轉(zhuǎn)移2105 數(shù)量的B16-f0黑素瘤細(xì)胞，1周后在皮下注射GK1肽，在外周血液中的INF顯著減少，淋巴細(xì)胞與對照組相比也有顯著的降低。延遲了腫瘤的生長，并增加了腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部壞死。通過進(jìn)一步的研究來闡明GK1肽對黑素瘤的確切作用機(jī)制，以及它們最終在人類身上的應(yīng)用。

3.2 斑馬魚黑色素瘤模型的制作以及治療 斑馬魚(Danio rerio)已經(jīng)被確立為癌癥研究最重要的模型生物之一[22]，如皮膚癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和肺癌等[23-27]。斑馬魚黑色素瘤模型的發(fā)展，使我們能夠更好地了解腫瘤的病理機(jī)制，并有可能進(jìn)行毒物篩選和藥物開發(fā)。KDM2A是一種與轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)的組蛋白，但是它對器官和疾病的作用卻很少有人知道。Kdm2aa在調(diào)節(jié)正常的mRNA水平和致癌作用方面，扮演著復(fù)雜的角色，當(dāng)斑馬魚體內(nèi)缺失kdm2aa序列會導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄被阻斷，有更高頻率黑色素瘤誘發(fā)。研究表明kdm2aa突變體是黑素瘤的第一個單基因淘汰模型[6]。眾所周知，腫瘤能夠誘導(dǎo)血管的生成，腫瘤血管生成多寡也預(yù)示癌癥治療結(jié)果的指標(biāo)。斑馬魚腫瘤異種移植,在研究腫瘤血管生成方面是一個新興工具，通過斑馬魚腫瘤模型來快速、簡單、定量的來量化腫瘤血管生成[27]。Le X.等[28]將斑馬魚mitfa啟動子與人類致癌HRASG12V耦合制作黑色素瘤斑馬魚模型。通過某些基因敲除技術(shù)，以及給斑馬魚體內(nèi)注射移植黑色素瘤細(xì)胞，制作斑馬魚黑色素瘤模型，來評價藥物的治療作用，得到非常成功的模型。

如今治療黑色素瘤的方式主要通過手術(shù)切除，治療藥物比較單一，8種FDA批準(zhǔn)的藥物在我國也均未上市[29]。通過小鼠和斑馬魚黑色素模型，蒙藥狼毒提取物對黑色素瘤有良好的治療效果，但有關(guān)具體成分，治療機(jī)制還有必要進(jìn)一步研究。我們使用人黑色素瘤細(xì)胞A2058細(xì)胞系，探討醋炮制狼毒提取液對黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用，發(fā)現(xiàn)提取液能夠顯著殺死黑色素瘤細(xì)胞，使用斑馬魚胚胎作為實驗動物模型，發(fā)現(xiàn)不同炮制狼毒提取液(酸奶、訶子、醋、酒精和牛奶)能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)斑馬魚鰭細(xì)胞凋亡，高濃度可引起尾部組織的組織缺失[30]。使用斑馬魚胚胎作為模型，向斑馬魚胚胎注射人黑色素瘤細(xì)胞，然后使用狼毒提取液進(jìn)行處理，以探討有關(guān)狼毒提取液的作用效果以及作用機(jī)制。

狼毒有抑制黑色素瘤生長的作用，但其成分，作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。斑馬魚胚胎作為黑色素瘤模型，具有潛在的應(yīng)用價值，可以評價狼毒以及其他抗腫瘤藥物，具有廉價、敏感、容易觀察等眾多優(yōu)點，建議在此方向有更多深入研究。

[1]張順辰，要曉靜.中藥抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].中國處方藥，2015，13(5):19 .

[2]黃祖杰，周淑清.草地重要有毒植物---狼毒[J].四川草原，1993,(4):24-27

[3]Shain AH, Bastian BC. From melanocytes to melanomas [J]. Nature reviews Cancer. 2016; 16(6):345-58.

[4]Faries MB, Mozzillo N, Kashani-Sabet M, et al. Long-Term Survival after Complete Surgical Resection and Adjuvant Immunot herapy for Distant Melanoma Metastases[J]. Annals of surgical onco logy. 2017.

[5]王莉平,王義善,張國營,等.狼毒對荷瘤小鼠體內(nèi)惡性黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用及其分子機(jī)制研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(11):2677-2680.

[6]Scahill CM, Digby Z, Sealy IM. Loss of the chromatin modifier Kdm2aa causes BrafV600E-independent spontaneous melanoma in zebrafish[J]. 2017;13 (8):e1 006959.

[7]劉兆國,范方田,韋忠紅,等.BRAF突變的黑色素瘤耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J/OL].中國藥理學(xué)通報,2013,29(10):1349-1351.

[8]Davies H，Bignell G R，Cox C，et al．Mutations of the BRAF gene in human cancer[J].Nature，2002，417( 6892) : 949-54．

[9]Niwa M,Liu G Q,Tatematsu H,et al.Camaechromone,a novel rearran ged biflavanoid from Stellera chamaejasmeL[J].TetrahedronLet t,1984,25(34):38.

[10]趙亮.液質(zhì)聯(lián)用在中藥狼毒化學(xué)成分研究中的應(yīng)用[D].第二軍醫(yī)大學(xué),2007.

[11]熊爽.月腺大戟化學(xué)成分的研究[D].吉林大學(xué),2009.

[12]鄧彬,穆淑珍,郝小江.月腺大戟的化學(xué)成分(英文)[J].中國天然藥物,2010,8(03):183-185.

[13]李青松，吳起成.狼毒大戟的化學(xué)成分研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2014,33(10)：1319-1320.

[14]孫增玉，張秋梅.狼毒大戟的化學(xué)成分研究[J].遼寧中醫(yī)藥雜志，2014,41(01)：141-143.

[15]段昕,賈春芳.瑞香狼毒總黃酮提取物對肺癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,33(03):308-310.

[16]王蒙,李靜,魏晴,等.狼毒大戟中松香烷型二萜內(nèi)酯的抗腫瘤活性研究[J].中國藥師,2015,18(08):1260-1262.

[17]王莉平,王義善,張國營,等.狼毒對惡性黑色素瘤細(xì)胞生長的影響及其分子作用機(jī)制的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(05):1133-1135.

[18]王園園.狼毒大戟通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路抑制惡性黑色素瘤生長及轉(zhuǎn)移的機(jī)制探討[D].濱州醫(yī)學(xué)院,2013.

[19]周昕欣.加味四君子湯治療惡性黑色素細(xì)胞瘤作用及機(jī)制的研究[D].遼寧中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[20]李靈毅,駱曼. MiR-194對惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制[J/OL].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2017,(21):31-36.

[21]Perez-Torres A,Vera-Aguilera J, Sahaza JH, et al. Hematological Effects, Serum, and Pulmonary Cytokine Profil es in a Melanoma Mouse Model Treated with GK 1[J].Cancer biotherapy & radiopharm aceuticals. 2015;30(6): 247-54.

[22]Kaufman C.K.,Mosimann C.,Fan Z.P.,et al. A zebrafish melanoma model reveals emergence of neural crest identity during melano ma initiateon[J].Sci ence. 201 6;351.

[23]Liu C.J., Xie L., Cui C., et al. Beneficial roles of melanoma cell adhesion molecule in spinal cord transection recovery in adult zebrafish [J]. Neuroche m.2016;139:1 87-196.

[24]Drabsch Y., He S., Zhang L., et al.Transforming gro wth factor-beta signalling controls human breast cancer met astasis in a zebrafish xenograft model[J].B reast Cancer Re s.2013;15:R106.

[25]Zhang B.,Shimada Y.,Kuroyanagi J.,et al.Quantitative phenotyp ing-based in vivo chemical screening in a zebrafish model of leukemia stem cell xenotran splantation[J].PLoS ONE.2014;9:e8 5439.

[26]YangX.J., CuiW., GuA., etal. A novel zebrafish xenoranspla ntation model for study of glioma stem cell invasion[J]. PLoS ONE. 2013;8:e61801

[27]Moshal KS, Ferri-Lagneau KF, Haider J, et al.Discriminating different cancer cells using a zebrafish in vivo assay[J].Cancers. 2011;3(4):4102-4113.

[28]Le X., Pugach E.K., Hettmer S.,et al. A novel chemical screen ing strategy in zebrafish identifies common pathw ays in embryo genesis and rhabdomyos arcoma development[J].Developmen t.2013;140:2354-2364.

[29]王慜,袁斯明.惡性黑色素瘤生物治療研究進(jìn)展[J].中國腫瘤,2017,26(07):555-560.

[30]Dong.WJ, Zong.JC, DongWu, et al. Comparing early life stage e ffect in zebrafish of Extraction methods for stellera chamae jasme,Anbalplant used in Mongolia medicine [M].SOT.55th?AnnualMeeting?and?ToxExpo,March13-17,2016. New Orleans, Louisiana. USA