魏璽 王曉慶 王猛 高明 綜述 張晟 審校

甲狀腺結節(jié)在人群中是常見的一種疾病。隨著高頻超聲的廣泛應用，甲狀腺結節(jié)的檢出率明顯增加［1］，其中大部分為良性結節(jié)，但仍然有5%～15%的結節(jié)被診斷為惡性且需要進一步臨床處理［2］。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌中最常見的病理類型，占甲狀腺癌的85%左右［3］。目前，甲狀腺結節(jié)的過度診斷不僅導致不必要的手術治療及相關醫(yī)療費用的上漲，而且存在并發(fā)癥的風險。另一方面，甲狀腺結節(jié)的漏診則導致延遲治療，若疾病出現(xiàn)進展，則需要進一步的臨床干預［4］。因此，甲狀腺結節(jié)的篩查及明確診斷尤為重要，有利于臨床醫(yī)師進一步優(yōu)化治療方案。本文擬對超聲介導下細針穿刺活檢細胞病理學，以及聯(lián)合基因檢測用于甲狀腺結節(jié)鑒別診斷的研究進展進行綜述。

1 超聲介導下甲狀腺結節(jié)細針細胞學活檢病理診斷研究進展

目前，超聲引導下細針穿刺活檢（ultrasound guid?ed fine needle aspiration biopsy，US-FNAB）是評估發(fā)現(xiàn)甲狀腺結節(jié)最可靠、最有價值的診斷手段之一［4］，也是方便、安全、有效地鑒別甲狀腺結節(jié)性質(zhì)的微創(chuàng)方法，常用作術前診斷甲狀腺乳頭狀癌的“金標準”。對于甲狀腺細胞學結果的解讀，在臨床應用最廣泛的是2007年美國國家癌癥研究討論并通過的Bethesda分類系統(tǒng)［5］，診斷結果分為六類（括號內(nèi)為惡性風險預測值）：Ⅰ：不能診斷或標本不滿意（1%～4%）；Ⅱ：良性（0～3%）；Ⅲ：意義不明確的非典型性病變或意義不明確的濾泡性病變（5%～15%）；Ⅳ：濾泡性腫瘤或懷疑濾泡性腫瘤和嗜酸性腺瘤（15%～30%）；V：可疑惡性（60%～75%）；Ⅵ：考慮惡性（97%～99%）?；诖朔诸愊到y(tǒng)，作為甲狀腺原發(fā)灶疾病診斷的有效方式，超聲引導FNA在甲狀腺癌的術前及術后評估中起著重要的作用。

在細胞學診斷過程中，依然存在無法診斷或不確定及意義不明確的非典型病變或濾泡性病變。這些診斷不確定的甲狀腺結節(jié)包含了Bethesda系統(tǒng)中Ⅲ～V類，其惡性的可能性分別是5%～10%、20%～30%和50%～75%［5］。對于這些不確定結節(jié)，Bethesda系統(tǒng)以及指南中推薦重復FNA檢查，但這些重復FNA中仍然有高達50%最終是細胞不足或不確定的結果。這些診斷不確定的甲狀腺結節(jié)結果給臨床醫(yī)生及患者帶來的問題比較棘手。若通過外科手術獲得組織病理學診斷，則會導致不同程度的并發(fā)癥及高額的醫(yī)療費用?；诖嗽?，許多科學家研究這類不確定的甲狀腺結節(jié)，并使用相關分子標記物來提高FNA診斷的敏感性及特異性。隨著甲狀腺癌研究在基因、蛋白、RNA等微觀水平上不斷深入，已發(fā)現(xiàn)多種分子標記物與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后相關，也為甲狀腺癌超聲引導FNA為代表的早期診斷手段，以及后期的預后判斷和靶向治療提供了全新的方向。

2 基因檢測在甲狀腺結節(jié)US-FNAB中應用的研究進展

隨著分子遺傳學的迅速發(fā)展，有研究表明［6-8］分子基因檢測FNA標本能夠明顯提高甲狀腺結節(jié)細胞學診斷的準確性，尤其是針對不確定結節(jié)診斷的細胞學結果，顯著提升其診斷的敏感性和特異性，有利于臨床的診治管理。目前，有結果顯示細針穿刺細胞學聯(lián)合分子基因檢測，對于分化型甲狀腺癌的診斷尤為可靠。

已有很多研究［9］表明在FNA細胞學診斷的基礎上，提取標本進行分子標記物檢測，包括RET/PTC重排、RAS、BRAF基因突變等均可強烈預示惡性結節(jié)。雖然提出很多癌基因及免疫化學標志物作為甲狀腺癌診斷和預后的指標，但是其臨床價值并未得到廣泛認可［10］。究其原因是FNA細胞學方法不確定的細胞學標本中含有少量的不典型細胞，而這些細胞中混有很多炎性細胞、良性濾泡細胞以及基質(zhì)細胞，因此后期在FNA針吸標本中發(fā)掘有用信息至關重要。而術前若對于不確定甲狀腺結節(jié)，檢測BRAF、RAS以及RET/PTC重排相關的重組分析，則為確診甲狀腺結節(jié)性質(zhì)及后期制定手術方案起到了關鍵作用［11-12］。

2.1 RET基因重組

RET原癌基因重組最常見于甲狀腺乳頭狀癌中，RET基因突變可引起甲狀腺濾泡細胞惡性轉(zhuǎn)化。這種突變是一種重組導致結構活化和增加信號下游MAPK途徑［13-14］。RET重組有多于12種類型，但其中80%是RET/PTC1和RET/PTC3。前者與分化良好的組織學分級有關，提示預后較好，后者與侵襲性的腫瘤類型相關。RET基因突變與MTC關系最密切，F(xiàn)TC及ATC中均較少發(fā)現(xiàn)，提示RET基因突變對MTC尤其對FMTC的篩查和診斷有特定意義。研究證實RET基因突變與多發(fā)性內(nèi)分泌腺腫瘤綜合征（MEN）Ⅱ型（Ⅱa和Ⅱb）關系密切，也說明了其與髓樣癌的相關性。雖然最初認為出現(xiàn)在50%甲狀腺乳頭狀癌中，后來發(fā)現(xiàn)整體患病率5%～35%，因此這種突變不適合作為腫瘤的一種獨立的篩選工具［15］。

2.2 BRAF基因突變

V-raf鼠類肉瘤濾過性病毒致癌基因同源體（vraf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF）最早在1988年于尤文肉瘤中發(fā)現(xiàn)，Raf家族中關于BRAF基因的研究較多，BRAF在細胞增殖、分化和凋亡中起到關鍵作用，也是甲狀腺癌中最常見的突變基因。BRAF突變總的患病率約45%（27.3%～87.1%），且亞洲國家顯著高于西方國家［16］。BRAFV600E突變在甲狀腺癌發(fā)生過程中，通過上調(diào)細胞分裂和增殖導致腫瘤發(fā)生，且BRAFV600E突變被證明與腺體外侵犯、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移，TNM分期及癌癥復發(fā)相關，是明確的預后不良因素［17］。研究表明，BRAF基因突變對于甲狀腺乳頭狀癌的診斷敏感性較低，特異性較高。此外，術前BRAF基因突變分析聯(lián)合超聲介導的FNA檢查結果，可以提高對于不確定甲狀腺結節(jié)良惡性診斷的準確性［18］。然而此方法仍存在不足，首先是低敏感性，研究顯示在BRAFV600E陰性的甲狀腺結節(jié)中，39.7%～70.8%結節(jié)病理為惡性，其次是BRAFV600E突變僅與甲狀腺乳頭狀癌相關，與其他病理類型甲狀腺癌不相關［19］。

2.3 RAS基因突變

RAS基因突變是甲狀腺腫瘤中第二個最常見的基因改變，主要存在于濾泡樣病變。RAS原癌基因編碼的三種不同膜相關的三磷酸鳥苷蛋白：HRAS、KRAS和NRAS。據(jù)報道［20］，RAS不同亞型的突變與不同的臨床病理結果相關。K-RAS 12/13突變與N-RAS 61或者H-RAS 61突變相比預測甲狀腺惡性結節(jié)能力較低，而其中N-RAS基因突變是最常見的RAS突變，且與甲狀腺乳頭狀癌濾泡亞型相關［20-22］，而H-RAS基因突變的惡性率最高［22］。這些突變廣泛存在于甲狀腺濾泡癌和甲狀腺乳頭狀癌濾泡亞型（40%～50%），較少出現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌經(jīng)典亞型（10%）中［23］。雖然RAS基因突變也在良性濾泡腺瘤中被發(fā)現(xiàn)，但目前尚不清楚RAS陽性的濾泡型腺瘤是否會有一定的可能發(fā)展成為惡性。研究表明［24］在結果為不確定的FNA樣本中，RAS突變對于惡性診斷的敏感性為34.3%，特異性為93.5%。較低的敏感性是由于RAS突變主要是與甲狀腺腫瘤的濾泡性生長有關，包括良性濾泡型腺瘤及甲狀腺濾泡癌，甲狀腺乳頭狀癌濾泡亞型等。因此RAS突變分析不適合作為一個獨立預測因素來鑒別甲狀腺結節(jié)的良惡性［25-26］。

3 miRNA分析在甲狀腺結節(jié)超聲介導FNA中的研究進展

miRNA是長度較短的單鏈非編碼小RNA片段，長度由19～23個核苷酸組成。miRNA認為是基因表達在轉(zhuǎn)錄后水平重要的調(diào)節(jié)因子。其控制各種細胞的發(fā)展和維護的過程，包括增殖、分化的過程，運動與細胞凋亡［27］。miRNA的表達具有組織特異性，腫瘤中miRNA與正常非腫瘤組織中的相比，在表達水平上發(fā)生了明顯改變（上調(diào)或下調(diào)），可作為腫瘤診斷，預后及預測潛力的標志物［28］。

甲狀腺被認為是miRNA表達參與腫瘤形成過程的非常適合的研究模型，因為甲狀腺濾泡細胞可形成不同生物學行為的腫瘤［29-32］，miRNA在甲狀腺的正常和腫瘤組織中的表達不同。miRNA的顯著變化不僅出現(xiàn)在不同組織來源的甲狀腺腫瘤中（如甲狀腺濾泡細胞與C細胞），甚至存在同時起源于甲狀腺濾泡細胞［33］。多項研究表明應用miRNA標志物可區(qū)分良惡性甲狀腺結節(jié)［34-36］，但僅局限在部分類型的惡性結節(jié)中，如甲狀腺乳頭狀癌［37-39］。研究表明對于FNA的細胞學標本miRNA檢測，如miR-146b、miR-221和miR-222術前診斷甲狀腺乳頭狀癌是可行的，但對于濾泡性腫瘤的準確性較低［39］。此外，miR-146b、miR-221和miR-222表達與甲狀腺惡性腫物包膜外浸潤相關［40］。miR-9和miR-21也可預測甲狀腺乳頭狀癌的復發(fā)［41］。miR-181a-2-3p和miR-99b-3p上調(diào)與miR-222下調(diào)也提示甲狀腺癌濾泡亞型有較好預后［42］。許多研究表明，濾泡型腺瘤和濾泡癌的miR?NA表達譜有很多重疊［35，43］，究其原因是miRNA表達的變化主要發(fā)生在從正常甲狀腺細胞轉(zhuǎn)變?yōu)闉V泡型腺瘤細胞的過程而不是從濾泡型腺瘤到濾泡癌的過程，因此對于濾泡性腫瘤的研究表現(xiàn)較低的準確性［43］。FNA細胞學標本的4個miRNA表達檢測（如miR-26a、miR-146b、miR-221和miR-222）上調(diào)，可用來辨別甲狀腺未分化癌和淋巴瘤［44-45］。很多血液循環(huán)中的miRNA可以作為甲狀腺腫瘤預后的標志物，循環(huán)中的miRNA作為標志物的主要作用是監(jiān)測甲狀腺腫瘤的動態(tài)。

總之，隨著分子生物學的進步，新型分子生物學技術，如mRNA和小RNA新一代測序，有望通過發(fā)現(xiàn)新的靶點及分子標記物進一步強化甲狀腺癌的精準診療。超聲介導的FNA細胞學檢查聯(lián)合分子標記物檢測對甲狀腺結節(jié)的鑒別診斷，能夠最大限度提高術前診斷的準確率，也為后期治療及預后判斷提供有效的診斷依據(jù)。

[1]Moon WJ,Baek JH,Jung SL,et al.Ultrasonography and the ultrasound-based management of thyroid nodules:consensus statement and recommendations[J].Korean J Radiol,2011,12(1):1-14.

[2]Gharib H,Papini E.Thyroid nodules:clinical importance,assessment,and treatment[J].Endocrinol Metab Clin North Am,2007,36(3):707-735.

[3]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11-30.

[4]American Thyroid Association(ATA)Guidelines Taskforce on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer,Cooper DS,Doherty GM,et al.Revised American Thyroid Association management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer[J].Thyroid,2009,19(11):1167-1214.

[5]Cibas ES,Ali SZ.The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology[J].Thyroid,2009,19(11):1159-1165.

[6]Nikiforova MN,Nikiforov YE.Molecular diagnostics and predictors in thyroid cancer[J].Thyroid,2009,19(12):1351-1361.

[7]Nikiforov YE,Yip L,Nikiforova MN.New strategies in diagnosing cancer in thyroid nodules:impact of molecular markers[J].Clin Cancer Res,2013,19(9):2283-2288.

[8]Mehta V,Nikiforov YE,Ferris RL.Use of molecular biomarkers in FNA specimens to personalize treatment for thyroid surgery[J].Head Neck,2013,35(10):1499-1506.

[9]Kim SW,Lee JI,Kim JW,et al.BRAFV600E mutation analysis in fineneedle aspiration cytology specimens for evaluation of thyroid nodule:a large series in a BRAFV600E-prevalent population[J].J Clin Endocrinol Metab,2010,95(8):3693-3700.

[10]Barut F,Onak Kandemir N,Bektas S,et al.Universal markers of thyroid malignancies:galectin-3,HBME-1,and cytokeratin-19[J].Endocr Pathol,2010,21(2):80-89.

[11]An JH,Song KH,Kim SK,et al.RAS mutations in indeterminate thyroid nodules are predictive of the follicular variant of papillary thyroid carcinoma[J].Clin Endocrinol(Oxf),2015,82(5):760-766.

[12]Hwang TS,Kim WY,Han HS,et al.Preoperative RAS mutational analysis is of great value in predicting follicular variant of papillary thyroid carcinoma[J].Biomed Res Int,2015,(2015):697068.

[13]Ohori NP,Singhal R,Nikiforova MN,et al.BRAF mutation detection in indeterminate thyroid cytology specimens:underlying cytologic,molecular,andpathologiccharacteristicsofpapillarythyroidcarcinoma[J].Cancer Cytopathol,2013,121(4):197-205.

[14]Musholt TJ,Fottner C,Weber MM,et al.Detection of papillary thyroid carcinoma by analysis of BRAF and RET/PTC1 mutations in fine-needle aspiration biopsies of thyroid nodules[J].World J Surg,2013,34(11):2595-2603.

[15]Adeniran AJ,Zhu Z,Gandhi M,et al.Correlation between genetic alterations and microscopic features,clinical manifestations,and prognostic characteristics of thyroid papillary carcinomas[J].Am J Surg Pathol,2006,30(2):216-222.

[16]Jung CK,Little MP,Lubin JH,et al.The increase in thyroid cancer incidence during the last four decades is accompanied by a high frequency of BRAF mutations and a sharp increase in RAS mutations[J].J Clin Endocrinol Metab,2014,99(2):276-285.

[17]Jemal A,Siegel R,Xu J,et al.Cancer Statistics,2010[J].CA Cancer J Clin,2010,60(5):277-300.

[18]Kim SK,Lee JH,Woo JW,et al.Prediction table and nomogram as tools for diagnosis of papillary thyroid carcinoma:combined analysis of ultrasonography,fine-needle aspiration biopsy,and BRAF V600EMutation[J].Medicine(Baltimore),2015,94(21):1-8.

[19]Hyeon J,Ahn S,Shin JH,et al.The prediction of malignant risk in the category"atypia of undetermined significance/follicularlesion of undetermined significance"of the bethesda system for reporting thyroidcytopathology using subcategorization and BRAF mutation results[J].Cancer Cytopathol,2014,122(5):368-376.

[20]Radkay LA,Chiosea SI,Seethala RR,et al.Thyroid nodules with KRAS mutations are different from nodules with NRAS and HRAS mutations with regard to cytopathologic and histopathologic outcome haracteristics[J].Cancer Cytopathol,2014,122(12):873-882.

[21]Fukahori M,Yoshida A,Hayashi H,et al.The associations between RAS mutations and clinical characteristics in follicular thyroid tumors:new insights from a single center and a large patient cohort[J].Thyroid,2012,22(7):683-689.

[22]Yoon JH,Kwon HJ,Lee HS,et al.RAS Mutations in aus/flus cytology:does it have an additional role in brafv600e mutation-negative nodules[J]?Medicine(Baltimore),2015,94(27):1084.

[23]Tavares C,Melo M,Cameselle-Teijeiro JM,et al.ENDOCRINE TUMOURS:Genetic predictors of thyroid cancer outcome[J].Eur J Endocrinol,2016,174(4):117-126.

[24]Clinkscales W,OngA,NguyenS,et al.Diagnostic valueof RASmutations in indeterminate thyroid nodules[J].Otolaryngol Head Neck Surg,2017,156(3):472-479.

[25]Howell GM,Hodak SP,Yip L.RAS mutations in thyroid cancer[J].Oncologist,2013,18(8):926-932.

[26]Gupta N,Dasyam AK,Carty SE,et al.RAS mutations in thyroid FNA specimens are highly predictive of predominantly low-risk follicularpattern cancers[J].J Clin Endocrinol Metab,2013,98(5):914-922.

[27]Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[28]Wiemer EA.The role of microRNAs in cancer:no small matter[J].Eur J Cancer,2007,43(10):1529-1544.

[29]Gao Y,Wang C,Shan Z,et al.miRNA expression in a human papillary thyroid carcinoma cell line varies with invasiveness[J].Endocr J,2010,57(1):81-86.

[30]Menon MP,Khan A.Micro-RNAs in thyroid neoplasms:molecular,diagnostic and therapeutic implications[J].J Clin Pathol,2009,62(11):978-985.

[31]Nikiforova MN,Chiosea SI,Nikiforov YE.MicroRNA expression profiles in thyroid tumors[J].Endocr Pathol,2009,20(2):85-91.

[32]Faam B,Ghaffari MA,Ghadiri A,et al.Epigenetic modifications in human thyroid cancer[J].Biomed Rep,2015,3(1):3-8.

[33]Forte S,La Rosa C,Pecce V,et al.The role of microRNAs in thyroid carcinomas[J].Anticancer Res,2015,35(4):2037-2047.

[34]Chen YT,Kitabayashi N,Zhou XK,et al.MicroRNA analysis as a potential diagnostic tool for papillary thyroid carcinoma[J].Mod Pathol,2008,21(9):1139-1146.

[35]Kitano M,Rahbari R,Patterson EE,et al.Expression profiling of difficultto-diagnose thyroid histologic subtypes shows distinct expression profiles and identify candidate diagnostic microRNAs[J].Ann Surg Oncol,2011,18(12):3443-3452.

[36]Mazeh H,Mizrahi I,Halle D,et al.Development of a microRNA-based molecular assay for the detection of papillary thyroid carcinoma in aspiration biopsy samples[J].Thyroid,2011,21(2):111-118.

[37]Mazeh H,Levy Y,Mizrahi I,et al.Differentiating benign from malignant thyroid nodules using micro ribonucleic acid amplification in residual cells obtained by fine needle aspiration biopsy[J].J Surg Res,2013,180(2):216-221.

[38]Agretti P,Ferrarini E,Rago T,et al.MicroRNA expression profile helps to distinguish benign nodules from papillary thyroid carcinomas starting from cells of fineneedle aspiration[J].Eur J Endocrinol,2012,167(3):393-400.

[39]Shen R,Liyanarachchi S,Li W,et al.MicroRNA signature in thyroid fine needle aspiration cytology applied to"atypia of undeterminedsignificance"cases[J].Thyroid,2012,22(1):9-16.

[40]Chou CK,Chen RF,Chou FF,et al.MiR-146b is highly expressed in adult papillary thyroid carcinomas with high risk features including extrathyroidal invasion and the BRAF(v600e)mutation[J].Thyroid,2010,20(5):489-494.

[41]Sondermann A,Andreghetto FM,Moulatlet AC,et al.MiR-9 and miR-21 as prognostic biomarkers for recurrence in papillary thyroid cancer[J].Clin Exp Metastasis,2015,32(6):521-530.

[42]Dettmer M,Perren A,Moch H,et al.Comprehensive microRNA expression profiling identifies novel markers in follicular variant of papillary thyroid carcinoma[J].Thyroid,2013,23(11):1383-1389.

[43]Rossing M,Borup R,Henao R,et al.Down-regulation of microRNAs controlling tumourigenic factors in follicular thyroid carcinoma[J].J Mol Endocrinol,2012,48(1):11-23.

[44]Fassina A,Cappellesso R,Simonato F,et al.A 4-microRNA signature can discriminate primary lymphomas from anaplastic carcinomas in thyroid cytology smears[J].Cancer Cytopathol,2014,122(4):274-281.

[45]Fuziwara CS,Kimura ET.MicroRNA deregulation in anaplastic thyroid cancer biology[J].Int J Endocrinol,2014,(2014):743450.