鄭智唯，趙 云，劉朝奇

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

近年，超聲靶向破壞微泡(ultrasound targeted microbubble destruction， UTMD)介導(dǎo)的基因遞送具有安全性高、重復(fù)性好和組織靶向高的優(yōu)點(diǎn)，在糖尿病治療中已經(jīng)取得很大進(jìn)步，并有望用于臨床。本文就UTMD技術(shù)及其在糖尿病基因治療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 糖尿病的基因治療

糖尿病是因胰島素分泌缺陷、生物作用受損，或二者協(xié)同引起，并以高血糖為特征的代謝性疾病，現(xiàn)已經(jīng)成為繼心腦血管疾病、癌癥后威脅人類生命的第三大非傳染性疾病。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟( International Diabetes Federation, IDF )2011年調(diào)查結(jié)果顯示，全世界糖尿病患者己達(dá)3.66億，預(yù)計(jì)2030年將上升至5.52億[1]?，F(xiàn)階段對(duì)糖尿病的研究已取得了一系列進(jìn)展。目前認(rèn)為注射胰島素是治療糖尿病的有效方法[2]。然而，注射外源性胰島素及其類似物存在需多次注射、胰島素?zé)o法自身按生理需求分泌及需密切監(jiān)控等問(wèn)題，故基因治療受到逐漸關(guān)注。

針對(duì)因胰島素缺乏導(dǎo)致的1型糖尿病的主要基因治療策略如下：①直接導(dǎo)入胰島素的替代基因，其首要原則是利用胰島素原的cDNA替代缺乏的胰島β細(xì)胞；由于以腺病毒為載體，其免疫原性縮短了基因的表達(dá)時(shí)間[3]，故其臨床應(yīng)用有限。②刺激β細(xì)胞再生。移植胰島是治療1型糖尿病的有效方法，但胰島源稀缺及人體對(duì)異體器官的免疫排斥反應(yīng)一直是器官移植的難題。研究[4]發(fā)現(xiàn)，胰十二指腸同源異型盒基因1(PDX-1)蛋白是胰島素基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子，在β細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的控制下，PDX-1過(guò)度表達(dá)有助于刺激胰島細(xì)胞增殖。Xu等[5]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充L-精氨酸可以通過(guò)激活蛋白激酶B(AKT)和PDX-1來(lái)改善糖尿病大鼠后代的胰島素敏感性和β細(xì)胞功能。Samson等[6]利用PDX-1促使內(nèi)分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u細(xì)胞的能力來(lái)取代胰島移植治療1型糖尿病。③改善胰島β細(xì)胞免疫應(yīng)答，可治療因免疫耐受缺失引起的胰島β細(xì)胞受損導(dǎo)致的1型糖尿病。理論上基因疫苗可從根源上預(yù)防糖尿病的發(fā)生、發(fā)展，但其所引起的免疫應(yīng)答在某些情況下可致病，即可能發(fā)生嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)[7]。④提高胰島β細(xì)胞對(duì)血糖濃度的敏感性，可治療胰島素抵抗導(dǎo)致的2型糖尿病。胰高血糖素樣肽1(GLP-1)是胰高血糖素原基因翻譯后加工修飾的L細(xì)胞分泌的一種腸降血糖素，能誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)葡萄糖依賴的胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，降低血糖水平[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，胰腺α細(xì)胞衍生的胰高血糖素相關(guān)肽為β細(xì)胞適應(yīng)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)所必需?，F(xiàn)階段GLP-1基因治療主要是以腺病毒為載體的基因遞送及電穿孔法，受限于其免疫原性和有創(chuàng)性及短半衰期，用于臨床治療依然存在困難。

糖尿病導(dǎo)致的一系列并發(fā)癥，如糖尿病性視網(wǎng)膜病變[10]、糖尿病心臟病、糖尿病腎病等的基因治療也受到廣泛關(guān)注。研究[11]顯示，通過(guò)局部維持腎素、血管緊張素系統(tǒng)之間的平衡，可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其他糖尿病性微血管并發(fā)癥，為治療和預(yù)防糖尿病提供了新的思路。尋找特異的作用靶點(diǎn)，有效的治療基因，合理的投遞系統(tǒng)是目前基因治療面臨的首要任務(wù)。

2 UTMD技術(shù)的應(yīng)用研究

超聲微泡造影劑的出現(xiàn)與發(fā)展開(kāi)辟了超聲無(wú)創(chuàng)診斷和治療的新領(lǐng)域。超聲微泡是一種生物可降解外殼包裹不同氣體形成的球狀物質(zhì)，根據(jù)外殼材料的不同和包裹氣體的差異，前后經(jīng)歷了4代的更新和發(fā)展，其穩(wěn)定性不斷增加，粒徑不斷降低，生物相容性越來(lái)越好。隨著研究的深入，超聲微泡造影劑不僅是一種超聲顯像對(duì)比劑運(yùn)用于臨床診斷，而且可作為藥物、基因的載體用于疾病治療。

近年來(lái)，靶向超聲微泡以其精確的靶向性、高效的治療作用、良好的臨床應(yīng)用前景[12]而成為現(xiàn)階段研究的熱門。UTMD是指攜帶藥物或基因的超聲微泡造影劑到達(dá)特定組織時(shí)，利用低頻率和高機(jī)械指數(shù)的間歇性超聲擊破微泡，將微泡攜帶的藥物或目的基因釋放出來(lái)，達(dá)到對(duì)病變部位進(jìn)行靶向治療的目的[13-14]。研究[15]表明，UTMD介導(dǎo)基因傳輸主要與其產(chǎn)生的空化效應(yīng)有關(guān)。微泡在超聲波作用下產(chǎn)生振動(dòng)，使細(xì)胞膜通透性增加，甚至產(chǎn)生可逆性小孔，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)基因或其他大分子物質(zhì)的攝取，為靶向基因治療提供了基礎(chǔ)。與病毒載體相比，超聲微泡具備的低免疫原性、可重復(fù)性和靶向性的特點(diǎn)，且UTMD可保護(hù)基因片段不被核酸酶降解和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，能在增加藥物、基因傳輸，提高局部攝取的同時(shí)降低機(jī)體攝入總量，減輕全身毒副作用。

UTMD介導(dǎo)的基因治療是超聲醫(yī)學(xué)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，在心血管、腫瘤等研究領(lǐng)域已經(jīng)取得一些成果。Zhang等[16]利用UTMD聯(lián)合陽(yáng)離子脂質(zhì)(CMBs)微泡將shPHD2基因轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)和缺血性心肌組織，發(fā)現(xiàn)UTMD聯(lián)合CMBs可提高質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)UTMD轉(zhuǎn)染shPHD2可有效下調(diào)PHD2基因，激活參與低氧反應(yīng)途徑的下游血管生成基因的表達(dá)，增強(qiáng)新血管生成，減少心肌細(xì)胞凋亡，從而改善大鼠心肌梗死模型的心室功能。UTMD介導(dǎo)的基因治療在宮頸癌、肝癌、前列腺癌等治療方面均獲顯著效果；聯(lián)合聚焦超聲，通過(guò)開(kāi)放血腦屏障，在治療腦腫瘤方面也取得了顯著成果[17]。UTMD可通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加腫瘤對(duì)放射線的敏感度，從而增強(qiáng)放射治療的療效，是肝細(xì)胞癌放療的有效輔助手段[18]。關(guān)于超聲輻照最佳條件的研究也取得了一些成果。Ling等[19]研究顯示，與0.5 W/cm2或?qū)φ战M相比，1.5 W/cm2和1 W/cm2組的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與1.0 W/cm2組相比，1.5 W/cm2組的白細(xì)胞介素1β表達(dá)增加了2倍，而0.5 W/cm2組則無(wú)明顯變化。Li等[20]認(rèn)為在目的基因達(dá)到最高表達(dá)的同時(shí)，須注意超聲強(qiáng)度對(duì)機(jī)體有無(wú)影響，以便確定最佳條件超聲輻照條件，使UTMD真正成為一種高效安全的基因治療手段。

3 UTMD在糖尿病的基因治療中的應(yīng)用

Xing等[21]通過(guò)UTMD治療胰腺腫瘤，即將載有目的基因的超聲微泡造影劑通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)胰腺組織，在一定強(qiáng)度超聲照射下破裂，將基因定向遞送到靶組織。Chen等[22]利用UTMD將RIP-人胰島素和RIP-己糖激酶I質(zhì)粒遞送至成年大鼠的胰島，前者使人C肽明顯增加、血糖水平降低，后者使胰島己糖激酶Ⅰ蛋白表達(dá)明顯增加、血液中胰島素含量增加、葡萄糖水平降低，提示UTMD可無(wú)創(chuàng)地將基因遞送至胰島，調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能。Chen等[23]對(duì)鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病模型狒狒進(jìn)行研究，運(yùn)用超聲靶向微泡破壞技術(shù)遞送cyclinD2、CDK4和GLP-1基因的復(fù)合物，成功誘導(dǎo)了胰島再生和β細(xì)胞質(zhì)量的恢復(fù)。人血管素樣蛋白8(ANGPTL8)可促進(jìn)胰腺β增殖并干擾小鼠三酰甘油代謝，但其引起的嚴(yán)重高甘油三酯血癥限制了其臨床應(yīng)用。近年研究[24]表明，UTMD 介導(dǎo)的ANGPTL8基因遞送可促進(jìn)成年和老齡β細(xì)胞增殖，擴(kuò)大β細(xì)胞團(tuán)，改善葡萄糖耐量。UTMD治療后空腹血胰島素水平升高，但未引起嚴(yán)重的高甘油三酯血癥，提示故UTMD可優(yōu)化現(xiàn)有治療方法，具有臨床治療意義。

田新橋等[25]通過(guò)對(duì)大鼠腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液，成功構(gòu)建了糖尿病心肌病大鼠模型，并運(yùn)用超聲破壞經(jīng)尾靜脈注射的攜aFGF微泡造影劑進(jìn)行干預(yù)治療，結(jié)果顯示超聲微泡靶向遞送aFGF可以增加心肌微血管數(shù)量，降低心肌膠原含量，具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，有效改善大鼠左心室舒縮功能。Wu等[26]實(shí)驗(yàn)證實(shí)UTMD可提高腎組織通透性，并且具有可恢復(fù)性。超聲破壞載SDF-1微泡靶向釋放SDF-1可以提高腎臟SDF-1濃度水平，促進(jìn)移植的外源性間充質(zhì)干細(xì)胞腎向歸巢能力，有效延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。雖然UTMD介導(dǎo)的基因表達(dá)為一過(guò)性，但基因表達(dá)結(jié)束所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)卻持久存在，為基因治療人類糖尿病奠定了基礎(chǔ)。

4 問(wèn)題與展望

超聲微泡介導(dǎo)的基因遞送在糖尿病的基因治療中展現(xiàn)出了巨大潛力，較病毒載體安全、高效，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了一系列研究成果，但在用于臨床治療之前，還存在一系列難題亟待解決：①尋找新的有效治療基因，不僅要研究單個(gè)靶基因，且要根據(jù)糖尿病形成調(diào)控基因異常表達(dá)的相關(guān)信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)更多有效的基因。②尋找保證超聲微泡載體質(zhì)量和提高轉(zhuǎn)染效率策略。UTMD介導(dǎo)的以超聲微泡為載體的基因轉(zhuǎn)染效率僅40%左右，故優(yōu)化超聲微泡造影劑制備工藝，在降低粒徑的同時(shí)提高穩(wěn)定性，制備出高質(zhì)量的超聲微泡以及探索合適的超聲輻照條件，對(duì)于提高轉(zhuǎn)染效率具有重要意義。③UTMD介導(dǎo)的基因治療安全性和倫理性仍有待觀察。為降低微泡造影劑和基因用量，減少不良反應(yīng)，避免資源浪費(fèi)，應(yīng)進(jìn)一步深入研究結(jié)合特異性配體的靶向超聲微泡造影劑。

總之，基因治療為治療糖尿病及其并發(fā)癥提供了新的思路，UTMD又為基因治療提供了有效的方法，相信UTMD介導(dǎo)的糖尿病基因治療將會(huì)成為有效的臨床方法。

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