黃涵檉， 張 祝， 張希洲△， 劉可云， 黃德斌

(1三峽大學(xué)人民醫(yī)院， 宜昌市第一人民醫(yī)院， 湖北 宜昌 443000； 2湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 湖北 恩施 445000)

2型糖尿病合并高血壓多為原發(fā)性多基因遺傳病，近40%患者合并有高風(fēng)險因素(high risk factor，HRF)，如高血壓、肥胖(obesity，OB)、血脂血糖(blood lipids and blood glucose，BL-BG)升高、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)和肝細胞脂肪變性(he-patocellular steatosis，HCS)等，是當(dāng)今世界高發(fā)病率和高死亡率的主要原因[1]。研究表明，脂代謝異常降低了組織細胞對胰島素的敏感性，反饋性促進胰島素分泌而導(dǎo)致長期高胰島素血癥[2]，一方面促進蛋白非酶糖化產(chǎn)物滯集于血漿、組織和腎小球基膜，損傷血管和腎小球內(nèi)皮與基膜；另一方面過度激活蛋白激酶C，加快血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)和內(nèi)皮素(endothelin，ET)的表達，促進血管收縮，導(dǎo)致血壓升高，并通過血管平滑肌增殖、纖維黏連蛋白和膽固醇沉積而加速AS[3-4]。糖尿病一旦發(fā)生，其治療就成為一個長期的醫(yī)學(xué)問題。目前，臨床上控制高血糖、高血脂、高血壓和延緩AS的最佳措施是多藥組合，但由于多藥合用不良反應(yīng)疊加的限制，治療藥物很難用于阻止 2 型糖尿病HRF的發(fā)展[5]。目前HRF狀態(tài)下阻止其發(fā)展而不良反應(yīng)少的有效藥物尚屬一空白。為探究相關(guān)藥物，我們研究了萊菔子主要成分芥子堿硫氰酸鈉(sinapine thiocyanate，ST)可有效阻止BL-BG升高、減弱胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、延緩AS和減輕HCS的相關(guān)機制。

材 料 和 方 法

1 藥品、試劑與儀器

ST(純度≥98%)購于上海遠慕生物科技有限公司；高脂高糖飼料(基礎(chǔ)飼料+15%豬油+20%蔗糖+1.2% 膽固醇+0.2%膽酸鈉)購于北京博泰宏達生物技術(shù)有限公司；羅格列酮(rosiglitazone，RT)購于北京嘉林藥業(yè)股份有限公司；抗3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, HMGR)、低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor, LDLR)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)、硬脂酰輔酶A脫飽和酶1(stearoyl-coenzyme A desaturase 1, SCD-1)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1a(carnitine palmitoyltransferase 1a, CPT-1a)、?；o酶A氧化酶1(acyl-coenzyme A oxidase 1, ACOX-1)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(sterol regulatory element-binding protein 2, SREBP-2)抗體購于武漢艾美捷科技有限公司。

AU-2700自動生化分析儀(Olympus)；ELx800酶標(biāo)儀(BioTek)； Axio Lab.A1顯微鏡(Carl Zeiss Jena)；CM3050低溫恒溫器(Leica)；ACCU-CHEK羅康血糖儀與血糖試紙(北京豐瑞祥合醫(yī)療器械有限公司)；ABI 7300 RT-PCR系統(tǒng)和Trans-Blot Cell電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)。

2 方法

2.1動物分組 SPF級雄性8周齡ApoE-/-小鼠60只(18～20 g；北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證編號為No.11400700189994)，置于恒溫(22±4) ℃光暗交替(12 h/12 h)環(huán)境中適應(yīng)1周，后隨機分成對照組(control group，CG)、生理鹽水組(saline group，SG)、羅格列酮組(rosiglitazone group，RG)和ST治療組，后者再分別分成ST低劑量組(ST-L)、中劑量組(ST-M)和高劑量組(ST-H)，每組10只，每籠5只。在標(biāo)準(zhǔn)實驗條件下，恒溫(22±4) ℃，光暗交替(12 h/12 h)環(huán)境中每天自由進食和飲水。整個研究過程中，實驗動物的護理與使用均在湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會的指導(dǎo)下進行。

2.2動物飼養(yǎng)與給藥 除CG小鼠給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)外，其它所有動物均以高脂高糖飼料飼養(yǎng)12周制備動脈粥樣硬化模型；同時，CG和SG小鼠分別每天以等體積生理鹽水灌胃1次，RG小鼠每天以羅格列酮灌胃1次(1.33 mg/kg)，ST各組小鼠每天分別以10 mg/kg、30 mg/kg和90 mg/kg ST灌胃1次[5]。所有藥物均用生理鹽水稀釋成溶液或混懸液(每次體積為20 mL/kg)。

2.3IR模型的誘導(dǎo)[6]飼養(yǎng)至最后3周，CG小鼠每天腹腔注射等體積生理鹽水，其它所有動物每天腹腔注射地塞米松 0.8 mg/kg，誘導(dǎo)小鼠IR模型。

2.4血樣收集與標(biāo)本采集 第12周結(jié)束時禁食12 h(不禁水)，以10%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉小鼠，心臟穿刺收集血液于EDTA試管中，離心15 min(4 ℃，3 000 r/min)分離血清，吸取血清分裝凍存于-80 ℃冰箱。剪開肋骨，以1×PBS心臟灌注3 min(4 mL/min)，分離出主動脈(去除脂肪與結(jié)締組織)和肝臟，稱量肝臟重量(liver weight，LW)，計算肝臟系數(shù)(liver coefficient，LC)，LC與空腹體重(fasting weight，F(xiàn)W)相關(guān)性計算公式如下[4]：LC(%)=LW/FW×100%。分別取升主動脈中段和肝右前葉上段以10%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，10倍鏡下觀察；另取一部分肝臟勻漿離心，分離出上清液置于-80 ℃冰箱冷凍保存。分離切取雙側(cè)股四頭肌中段0.4 g，用于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路相關(guān)蛋白表達水平的測定。

2.5體重、血糖及血脂代謝相關(guān)指標(biāo)水平的測定 在飼養(yǎng)的12周中，每周的最后1 d 禁食12 h后，秤量FW并計算每天每只小鼠的飼料消耗量(feed consumption，F(xiàn)C)，斷尾采集血樣檢測空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)水平。第12周結(jié)束時用ELISA試劑盒和全自動生化儀檢測FPG、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)Ins)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)及脂蛋白膽固醇等代謝相關(guān)指標(biāo)的水平，并計算穩(wěn)態(tài)模型評估的胰島素抵抗指數(shù)(homeostatic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)[4]：HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FIns(mU/L)/22.5。

2.6肝脂質(zhì)(liver lipids，LL)的測量與組織學(xué)分析 取肝組織樣品0.2 g，放入氯仿與甲醇的混合液(2∶1)中，溶于Triton X-100中，按上述步驟測量肝甘油三酯(liver triglyceride，L-TG)和肝總膽固醇(liver total cholesterol，L-TC)含量。將固定良好的肝樣品進行石蠟包埋切片(5 μm)，HE染色，10倍鏡下觀察攝片。

2.7肝脂質(zhì)代謝與骨骼肌MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達的測定 用Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達。取骨骼肌0.1 g，加入1 mL細胞裂解液后行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，PVDF膜室溫封閉，置于相應(yīng) I 抗中，搖動過夜(4 ℃)洗膜，置于 II 抗中(辣根過氧化物酶標(biāo)記)，室溫反應(yīng)2 h后用化學(xué)發(fā)光法檢測。目的蛋白相對含量以目的蛋白與β-actin的比值表示。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，多個樣本間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ST對各組小鼠FC、FW和FPG的影響

CG的FC呈現(xiàn)緩慢持續(xù)增長；第5周以前，RG的FC顯著少于SG(P<0.05)；第9周后，所有高脂飼料組的FC均呈快速增加，其中ST-H組顯著高于ST-M組，ST-M組顯著高于SG和ST-L(P<0.05)，SG-L與RG間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。飼養(yǎng)期間，CG的FW呈現(xiàn)緩慢持續(xù)增長；10周后，其它各組的FW呈現(xiàn)快速增長，均顯著高于CG(P<0.05)，其中ST各組呈現(xiàn)劑量依賴性慢于RG而快于CG(P<0.05)，見表2。CG的FPG無顯著升高，顯著低于其它各組(P<0.05)；飼養(yǎng)3周后，所有高脂飼料組的FPG呈現(xiàn)緩慢持續(xù)升高；10周以后，所有高脂飼料組的FPG呈現(xiàn)快速升高，其中，ST各組呈現(xiàn)劑量依賴性低于SG而高于RG(P<0.05)，見表3。

表1 ST對各組小鼠FC的影響

*P<0.05vsST-M；#P<0.05vsST-L；△P<0.05vsCG；▲P<0.05vsSG.

表2 ST對各組小鼠FW的影響

*P<0.05vsST-M；#P<0.05vsST-L；△P<0.05vsCG；▲P<0.05vsSG.

表3 ST對各組小鼠FPG的影響

*P<0.05vsST-M；#P<0.05vsST-L；△P<0.05vsCG；▲P<0.05vsSG.

2 ST對各組小鼠血脂、血糖及胰島素的影響

第12周處死動物后，血脂檢測結(jié)果顯示，高脂飼料各組小鼠的血脂水平明顯升高，其中ST-H組與CG的血脂各項指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，SG和RG的高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)顯著低于CG、ST-M組和ST-H組(P<0.05)，ST呈劑量依賴性延緩血脂水平的升高，增加HDL-C，見表4。第12周處死動物后，F(xiàn)PG和FIns檢測及HOMA-IR的計算結(jié)果顯示，CG各項指標(biāo)顯著低于SG(P<0.05)，表明IR模型復(fù)制成功；ST各組呈劑量依賴性降低FPG、FIns和HOMA-IR，但顯著弱于RG(P<0.05)，見表5。

表4 ST對各組小鼠血脂的影響

*P<0.05vsST-M;#P<0.05vsST-L;△P<0.05vsCG;▲P<0.05vsSG.

表5ST對各組小鼠血糖和胰島素的影響

Table 5. The effect of ST on FPG and FIns in the mice of each group (Mean±SEM.n=10)

GroupFPG(mmol/L)FIns(mU/L)HOMA-IRCG5.23±0.2123.03±2.145.38±0.16SG18.45±1.57△124.64±11.86△102.22±9.13△RG9.72±1.92△▲125.02±14.14△54.02±3.24△▲ST-L17.81±2.71△98.29±11.76△77.81±5.08△▲ST-M15.77±2.15#△▲69.56±12.81#△▲48.76±4.17#△▲ST-H11.29±1.35*▲35.02±3.04△▲17.57±2.51*▲

*P<0.05vsST-M;#P<0.05vsST-L;△P<0.05vsCG;▲P<0.05vsSG.

3 ST對各組小鼠LW、LC、LL、TNF-α與肝組織學(xué)的影響

第12周處死動物后，結(jié)果顯示，ST-H的肝臟相關(guān)指標(biāo)與CG相當(dāng)，顯著低于SG和RG(P<0.05)，ST呈劑量依賴性減輕LW和降低LC，減少T-TG和L-TC(P<0.05)，表明高脂飼料促進了脂肪肝的形成，ST抑制脂肪肝的形成；結(jié)果還顯示，高脂飼料各組TNF-α顯著高于CG(P<0.05)，表明高脂飼料可能導(dǎo)致肝功能損傷；ST呈現(xiàn)劑量依賴性降低TNF-α(P<0.05)，見表6。

肝臟大體觀察可見，CG組的肝臟外觀紅褐色，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)軟，彈性良好，切面無明顯油膩感；SG和RG的肝臟呈土黃色，包膜緊張，邊緣圓鈍，明顯腫大，質(zhì)硬，彈性差，切面油膩感明顯；ST各組呈劑量依賴性明顯優(yōu)于SG和RG。肝臟病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，光鏡下CG的肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞形態(tài)正常，大小均一，肝索排列整齊；SG和RG的肝小葉變形，肝索排列紊亂，肝細胞形態(tài)變形，大小不均勻，中央靜脈周圍大量肝細胞氣球樣大小泡混合型HCS，炎性細胞浸潤顯著，凋亡肝細胞多；ST-M組的肝小葉少有變形，肝索排列尚可，肝細胞形態(tài)偶有變形，大小基本均勻，中央靜脈周圍小泡型HCS，少見炎性細胞浸潤和肝細胞凋亡；ST-H組未見明顯HCS，未見炎性細胞浸潤和肝細胞凋亡，與CG組相當(dāng)，見圖1。

表6 ST對各組小鼠LW、LC、LL及TNF-α的影響

*P<0.05vsST-M;#P<0.05vsST-L;△P<0.05vsCG;▲P<0.05vsSG.

Figure 1. The effect of ST on HCS in the mice of each group (HE staining, ×200).

圖1ST對各組小鼠HCS的影響

4 ST對各組小鼠AS的影響

鏡下可見，CG小鼠的主動脈管壁未見脂質(zhì)斑塊，SG管壁明顯增厚毛糙，管腔變形變窄，僵硬，典型的AS已經(jīng)形成；RG與ST-L組相當(dāng)，均有大量泡沫細胞和脂質(zhì)斑塊，管壁有增厚，管腔稍變形變窄，AS病變趨于形成；ST-M組的主動脈內(nèi)膜下出現(xiàn)堆積的泡沫細胞和脂質(zhì)斑塊，表現(xiàn)為早期AS病變；ST-H組的主動脈內(nèi)膜有少量泡沫細胞和少許脂質(zhì)斑塊，早期AS趨于形成，見圖2。

Figure 2. The effect of ST on AS in the mice of each group (HE staining, ×10).

圖2ST對各組小鼠AS的影響

5 ST對各組小鼠肝脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達的影響

第12周處死動物后，檢測結(jié)果顯示SG和RG的HMGR、FAS和CPT-1a蛋白表達均顯著高于CG組，而SCD-1則低于CG(P<0.05)，ACOX-1和SREBP-2的水平與CG相當(dāng)(P>0.05)；ST呈現(xiàn)劑量依賴性抑制HMGR、FAS和CPT-1a蛋白的表達，而增強LDLR、SCD-1、ACOX-1和SREBP-2蛋白的表達(P<0.05)，見圖3A。

6 ST對各組小鼠骨骼肌MAPK信號通路的影響

第12周處死動物后，Western blot檢測結(jié)果顯示，JNK蛋白的表達水平各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；SG的ERK蛋白表達與ST-L組和ST-M組相當(dāng)(P>0.05)，顯著低于CG、RG和ST-H組(P<0.05)；SG的p-ERK、p38、p-p38和p-JNK蛋白水平顯著高于CG、RG和ST-H組，顯示出ST 呈劑量依賴性地降低相關(guān)蛋白水平(P<0.05)，見圖3B。

討 論

目前，對于糖尿病與肥胖合并HRF的最佳防治措施是多藥組合，由于受到多藥組合不良反應(yīng)疊加的限制，治療藥物一般很難用于高血壓和糖尿病的HRF預(yù)防[5]。ApoE-/-小鼠具有脂質(zhì)代謝紊亂和IR遺傳背景，高脂飼養(yǎng)和糖皮質(zhì)激素可穩(wěn)定誘導(dǎo)其脂質(zhì)代謝紊亂和IR[6]。為探究高血壓、糖尿病HRF的不良反應(yīng)少的防治性藥物，我們研究證實，萊菔子主要成分ST能顯著減緩高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠體重增加、BL-BG升高，延緩AS與IR進程，并能抑制脂肪肝形成和肝細胞凋亡。

根據(jù)本研究結(jié)果，我們認為其作用機制為：一方面，ST通過抑制TNF-α的產(chǎn)生，減輕肝細胞的損傷，延緩AS和HCS進程。研究證實，OB與肝內(nèi)脂質(zhì)異常代謝和骨骼肌脂質(zhì)轉(zhuǎn)運酶異常表達密切相關(guān)[7]。有報道表明，鉤藤總堿與ST配伍能調(diào)控TNF-α導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細胞變化[5]。肝細胞是維持和調(diào)控脂質(zhì)代謝的主要場所，肝細胞受損可影響脂質(zhì)代謝和調(diào)控，形成病理性肥胖狀態(tài)[3，7]。另有報道，慢性低度炎癥與OB誘發(fā)的IR類似，器官長期低度炎癥而減弱器官對胰島素的敏感性，形成IR[4, 7]。由于脂肪細胞可分泌較多炎性因子TNF-α，活化胰島素靶細胞炎性通路JNK和IKKβ等，激活下游AP-1和NF-κB而促進TNF-α和IL-6 表達，加重慢性低度炎癥，促進血管內(nèi)皮細胞和肝細胞的損傷[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在第12周，高脂飼料各組的TNF-α顯著高于CG，ST呈現(xiàn)劑量依賴性降低TNF-α，表明高脂飼料可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞和肝細胞周圍長期慢性低度炎癥而受損，ST能抑制TNF-α的產(chǎn)生，保護血管內(nèi)皮細胞和肝細胞，維持其正常代謝，延緩AS和HCS進程。

Figure 3. The representitive images of Western blot for determining the protein levels of lipid metabolism-related proteins in the liver (A) and the signaling pathway of MAPK-related molecules in the skeletal muscle (B). Mean±SEM.n=10.*P<0.05vsST-M；#P<0.05vsST-T；△P<0.05vsCG；▲P<0.05vsSG.

圖3肝脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白和骨骼肌MAPK信號通路相關(guān)蛋白檢測的Westernblot結(jié)果

另一方面，ST通過調(diào)控肝細胞相關(guān)信號通路蛋白表達，維持其正常脂質(zhì)代謝，從而削弱HRF。HMGR是肝細胞合成膽固醇的關(guān)鍵限速酶，抑制HMGR可上調(diào)肝細胞膜LDLR而加快膽固醇(cholesterol，Ch)的攝取，降低血Ch，使VLDL生成減少和促進VLDL殘粒(難轉(zhuǎn)化成VLDL)或β-VLDL異化而降低血LDL[8]。Fas是結(jié)合死亡受體TNFRSF6/Fas的細胞凋亡分子，介導(dǎo)T細胞毒性[9]。肝內(nèi)T細胞活化可誘導(dǎo)Fas和FasL表達，觸發(fā)靶細胞程序性凋亡[7]。同時，活化的相鄰T淋巴細胞Fas與FasL也可彼此殺傷[8]。SCD-1是脂肪細胞分泌的瘦素信號靶基因，能使硬脂酰輔酶A與棕櫚酰輔酶A去飽和，維持體重，減少進食和加快能量消耗[8]。高脂飲食可下調(diào)SCD-1表達，降低肝細胞FFA去飽和力而沉積[9]。油酰輔酶A(SCD-1產(chǎn)物)可促進肝細胞神經(jīng)酰胺合成，增加脂肪沉積和升高肝重指數(shù)[9]。CPT-1是脂肪酸-氧化限速酶，若表達上調(diào)，脂肪酸氧化減慢，血糖降低，HCS減輕[10]。?；o酶A氧化酶是脂肪細胞內(nèi)與脂肪酸的氧化有關(guān)的起始酶，可降低TC，延緩OB、IR和HCS進程[5，9]。肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的SREBP-2是細胞TC代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，當(dāng)Ch缺乏時，SREBP-2激活，干擾TC外源性吸收，增加TC逆轉(zhuǎn)運和內(nèi)源性TC轉(zhuǎn)化為膽汁酸，而降低血TC[10]。本研究證實，SG和RG的FAS、SCD-1和CPT-1a蛋白表達均顯著強于CG，而HMGR低于CG；ST呈劑量依賴性增加HMGR、ACOX-1和SREBP-2蛋白表達而抑制LDLR、FAS、SCD-1和CPT-1a蛋白表達(P<0.05)。提示ST以上述多信號路徑的調(diào)控形式維持正常肝脂質(zhì)代謝，減緩HRF的發(fā)生。

此外，ST還通過調(diào)控骨骼肌MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達，阻止IR進程。IR和OB與骨骼肌胰島素抵抗密切相關(guān)[2]，骨骼肌是代謝能量物質(zhì)(糖、脂等)的重要場所，可處置70%～90%葡萄糖，與血脂、血糖、IR、AS及HCS密切相關(guān)[7, 11]。MAPK在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用，其級聯(lián)反應(yīng)激活酶有ERK、JNK及p38[11]。其中ERK是表面受體傳導(dǎo)信號給細胞核的關(guān)鍵路徑，可由生長因子激活，并介導(dǎo)NF-κB、AP-1、c-Fos和c-Jun轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等，JNK和p38可由游離脂肪酸激活而參與應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)[9，12]。有研究證實，2型糖尿病患者脂肪細胞p-p38、p-ERK及p-JNK的蛋白水平均高于正常人[13]。本研究提示，高脂飼料喂養(yǎng)小鼠骨骼肌MAPK信號通路調(diào)控與CG的差異存在統(tǒng)計學(xué)顯著性。SG的p-ERK、p38、p-p38和p-JNK蛋白水平顯著高于CG、RG和ST-H組，顯示出ST呈劑量依賴性抑制其磷酸化，提示ST調(diào)控骨骼肌IR的機制是在抑制p38磷酸化，降低游離脂肪酸對骨骼肌刺激。

總之，十字花科植物蘿卜(RaphanussativusL.)種子萊菔子主要成分之一的ST具有來源廣、成本低、不良反應(yīng)很少的特點。大量研究表明ST有降血壓作用，本研究進一步證實其具有預(yù)防性阻止血脂血糖升高、延緩IR、AS和HCS等作用，其機制與調(diào)控肝脂質(zhì)代謝和骨骼肌MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達有關(guān)。提示ST在糖尿病、高血壓的前期亞健康狀態(tài)時HRF(BL-BG、IR、AS和HCS)預(yù)防性治療方面顯示出良好的應(yīng)用前景。

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