嚴延生

1 簡 介

2017－2018年全球冬春季流感流行較往年嚴重,流感疫苗的生產、研究、保護范圍及作用效果又引起人們的關注,為此,本文就有關該苗的內容進行了綜述.

流感病毒屬于正粘病毒科,分為A、B、C和D四個類別,病毒粒子直徑約為80～120 nm,為單股負鏈分節(jié)段的RNA病毒.A和B有8個節(jié)段,C和D則只有7個節(jié)段[1].A和B型流感病毒在多種鳥類中傳播并感染包括人類在內的幾種哺乳動物;C型流感病毒感染人、豬,D型流感病毒主要感染牛,目前尚不知可否引起人的感染[2].A和B型流感病毒主要引起人季節(jié)性流感,對免疫低下的人有危險,每年全球約產生300～500萬嚴重流感病例,導致250 000至500 000人死亡,而大流行則可奪走更多人的生命.WHO建議包括孕婦、6個月至5歲兒童、65歲及以上的老人、具有慢病征候者和醫(yī)務工作者主要5類人需接種流感疫苗[3].

血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)是流感病毒顆粒表面兩種主要的糖蛋白,HA與NA分子之比約為4∶1至5∶1,前者主要是促進病毒侵入機體,即病毒通過HA蛋白與宿主細胞融合后,造成感染和疾病的發(fā)生;后者則主要功能在于抑制病毒的釋放.在鳥類和哺乳動物中,目前共有18個HA和11個NA亞型.按HA抗原差異,可將甲型流感病毒分為兩大遺傳發(fā)育組:第1組(H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和 H18)和第2組(H3、H4、H7、H10、H14及 H15亞型)[4-5].幾乎所有HA和NA的組合都可在禽類中發(fā)現(xiàn),但在人類中則較為局限,主要包括 H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10;除了這些甲型流感病毒外,還有兩種B型流感病毒山形(Yamagata)和維多利亞型(Vectoria)也感染人;引起季節(jié)性流感流行的A型病毒主要是H1N1和H3N2亞型,常用的季節(jié)性流感疫苗一般是三價苗,B型的兩種流感病毒中的一種占其中的一價.如果是四價苗,也就是兩種B型流感疫苗占其中的兩價.人散發(fā)感染禽流感病毒則多見于 H2、H5、H6、H7、H9和 H10亞型,但至目前為止,還未造成跨種屬的大規(guī)模人感染流行[6].流感病毒變異很快,由于RNA聚合酶在選擇壓力下不斷發(fā)生突變,產生“抗原漂移”這一現(xiàn)象;此外在北半球使用的疫苗和南半球使用的疫苗又有所區(qū)別,所以在每個流感季節(jié)后都需要更新疫苗株,這就需要WHO統(tǒng)一指導全球的流感監(jiān)測并在此基礎上提出抗下個季節(jié)流行病毒疫苗株的組成以供生產[7].目前,全球每年能夠生產數億劑次的疫苗,但大多數流感疫苗是用雞胚制成的[8].

2 流感疫苗的種類和生產方式

目前,通過各國食藥監(jiān)部門批準可市售使用的流感疫苗主要有:雞胚苗、MDCK細胞苗、桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的HA蛋白苗和MF59乳劑苗等主要4種類別.

2.1 雞胚流感疫苗 除少數其他類別的疫苗外,流感疫苗主要用受精卵發(fā)育的雞胚來生產,其優(yōu)點在于:①目前已有足夠的生產雞胚流感疫苗的設施,每年可以生產15億劑次,可滿足全球人口每年對新季節(jié)性疫苗的需求,而其他疫苗生產技術則難以適應全球的需求[9];②由于技術方法穩(wěn)定并可大量生產,因此雞胚生產的流感疫苗是目前價格最為便宜的疫苗[10],低成本并基本可預防流感,這一點對發(fā)達國家和發(fā)展中國家都適宜.目前已發(fā)展的、在組成上有病毒顆粒的甲醛滅活苗、裂解苗和亞單位苗.滅活苗保持了完整的病毒顆粒,其預防免疫效果也最為突出;裂解苗系由完整的病毒顆粒經裂解后,暴露出各病毒組成成分;亞單位苗,主要是血凝素HA成分,免疫效果類似裂解苗,副作用較之滅活苗更小,只在兒童和65歲以上老人的人群中使用.

生產合格的雞胚苗最大的難題是對疫苗株的篩選確定.首先將選定的A型野生株與PR8(雞胚高適應株,A/Puerto Rico/8/1934[11])在同一個雞胚中生長重組,重組株含有野生株的HA及NA的兩個基因片段及PR8的其余6個片段;其次重組株在雞胚中做適應性生長;第三用WHO在雪貂中制備的抗體篩選能產生高抗原滴度的 “候選疫苗病毒”(CVVs)株,篩選確定出CVVs.WHO指導全球流感監(jiān)測并負責每年召集兩次會議(北半球在3月份,南半球在9月份),此后將CVV交付給有資質的廠家進行生產[12-13].

雖然雞胚生產的流感疫苗的工藝十分規(guī)范,但A型重組病毒株在雞胚中的適應仍然存在問題,尤其是H3N2病毒,在雞胚中常生長不好并費時[14],這就可能導致對疫苗株的篩選預測不準確的難題發(fā)生.如在2003－2004流行季節(jié)里,當時預測A/福建/411/2002株樣病毒可能將在2003－2004流行,但該株起先無法在雞胚中培養(yǎng)而用前一年的H3N2菌株[15]來代替,但這種替代并未能解決預測的A/福建/411/2002株樣病毒可能流行的問題,致使當年超過82%病例則是由A/福建/411/2002株樣病毒感染產生[16].

研究表明,重組病毒在雞胚中生長的適應性與禽類受體有關.人體上呼吸道細胞HA受體的主要成分是α-2,6連結的唾液酸,而禽類病毒的受體多是α-2,3連結的唾液酸,這可能是受體結合不良導致人流感病毒H3N2病毒在雞胚中生長不好的的主要原因[17-18].為了適應生長,HA蛋白首先要適應雞胚中的受體.而HA蛋白的結合區(qū)域位于球形頭部區(qū),其中包含以中和抗體為靶標的主要抗原位點,為了適應生長,就可能發(fā)生HA抗原性改變,而CVV的生成通常要通過不斷地檢測分離株的抗原性,由于個體中流感免疫反應的復雜性與多次暴露于不同毒株有關,因此很難準確預測特定疫苗株的抗原性是針對哪一個毒株的[19],這樣選擇的疫苗就不能很好地和正要流行的病毒匹配[20].最近幾年里,疫苗效果不佳,推測與這種原因不無關系[21].在2017－2018年度流感流行季里,研究證實了這個推斷,H3N2流感疫苗在適應過程中發(fā)生了一個氨基酸突變,導致了疫苗HA蛋白的糖基化,這使得在美國流行的H3N2流感中,疫苗只起到25%的效果[20-22].就是經過從篩選到生產這么復雜的過程,雞胚苗的保護率最多也僅有60%[23].2.2 狗腎細胞株(MDCK)流感疫苗 2012年,美國FDA宣布批準了首個非雞胚生產的流感疫苗Fluelvax○R[24],Fluelvax○R是一個基于細胞(即 MDCK)的流感疫苗生產平臺,由諾華公司的流感疫苗團隊開發(fā)(現(xiàn)由Seqirus公司生產).當然還有其他的哺乳動物細胞如人胚視網膜細胞(PER.C6),猴腎細胞(Vero),人胚腎細胞(HEK293)也陸續(xù)進入臨場試驗.Fluelvax○R生產使用,給流感疫苗生產注入了新鮮血液,它有以下4大優(yōu)點值得肯定:一是利用細胞,減少了雞胚短缺的潛在限制(雞胚苗生產依賴于大量的雞胚供應,有時會因為供應的原因而使生產時間變慢),使用細胞生產就不會出現(xiàn)雞胚供應不上的問題,疫苗病毒的生產只取決于生物反應器的容量[25-26];二是HA蛋白的糖基化對免疫原性有積極作用;使用雞胚與哺乳動物細胞,生產出的流感疫苗表現(xiàn)出截然不同的糖基化譜,相對而言,MDCK疫苗能更好匹配于流行毒株;第三,由于用的是細胞而不是雞胚生產,所以不存在對雞胚疫苗過敏的風險;第四,也許是最值得注意的是,哺乳動物細胞生產疫苗減少了HA的突變.最初,Flucelvax○R也是用雞胚篩選確定CVV,這意味著在雞胚中適應的前期問題仍有存在[14].但在2016年,美國FDA規(guī)定所有的Fluelvax○R必需完全使用基于細胞的CVV,以確保其不受雞胚適應性的影響.研究表明,這樣的規(guī)定使得在2017－2018年流感流行季節(jié)里,“以細胞為基礎的疫苗相對于以雞胚為基礎的疫苗,其疫苗的保護效果提高了約20%”[22].

雖然細胞平臺有許多優(yōu)點,但仍有不足之處,主要在于全球細胞生產流感疫苗的設施目前還沒有到位.據美國Seqirus公司稱,在2017－2018年度流感季節(jié)里,該公司大約只能向美國提供“2150萬劑次”的Flucelvax○R疫苗(包括其中含有18%的四價疫苗)[27].其次,由于細胞的生產不足,價格也比雞胚疫苗高出40%.很明顯,細胞系統(tǒng)目前還無法取代整個以雞胚為基礎的低成本疫苗生產.

2.3 桿狀病毒系統(tǒng)表達的流感疫苗 另一種可避免雞胚苗的問題系最近蛋白科學公司(Protein Science Corporation)研制的FluBlok○R疫苗[28].在基于MDCK細胞疫苗問世后一年,美國FDA批準了FluBlok○R.不同于雞胚和細胞疫苗生產,FluBlok○R利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達HA蛋白.首先利用RT-PCR或用人工序列合成的方式制備HA模板,將流行株的HA基因克隆到桿狀病毒載體中,此后將重組桿狀病毒轉染昆蟲細胞,產生純化的重組HA蛋白用于疫苗的生產.這種策略不再需要拯救流感病毒來選擇高產重組株,因此,該技術不僅生產快,還因為其不受雞胚適應問題的影響,能產生與流行病毒HA精確匹配的結果,可使流感疫苗的生產隨之流感病毒流行的變化而變化[29-30].但這種策略也存在不足之處,即FluBlok○R的價格是雞胚疫苗的2倍,這使許多病人選擇較為廉價的雞胚或其他細胞疫苗[31];其次由于季節(jié)性流感變異,FluBlok○R還存在所謂保質期的問題,其儲存時間不能超過9個月[32].由于生產設施不足,甚至無法滿足美國一個流行季所需的FluBlok○R疫苗劑量,且其成本較高及保質期較短,因此FluBlok○R還不能完全取代雞胚疫苗的生產.

2.4 特殊乳劑疫苗 美國FDA近期批準的另一種替代傳統(tǒng)的雞胚疫苗生產方法是很簡單的,也就是在傳統(tǒng)的雞胚疫苗中加入佐劑來增加疫苗抗原免疫應答的強度.這種疫苗稱為FLUAD,于2015年在美國被批準供65歲及以上人群使用,并于2016－2017流感季開始啟動使用[33].FLUAD疫苗自1990年代末以來已批準在其他國家使用,劑量超過8 500萬劑.該疫苗雖仍為雞胚生產,但它因使用MF59乳劑而有別于其他雞胚苗[34].這種乳劑主要成分為角鯊烯,是一種在人體內常用的合成膽固醇和其他類固醇的有機化合物.MF59通過誘導免疫細胞到注射部位增強免疫應答,主要在于增強對抗原的攝取和隨后的免疫反應.雖然這種疫苗目前只用于65歲以上的患者,但最近的研究已證明該疫苗在兒童中也可誘發(fā)強有力的免疫反應[35],同時研究也表明MF59的加入可以誘導非疫苗株的交叉反應.使用MF59的雞胚疫苗比不使用的免疫應答要強,也易于增加其在雞胚生長中的適應性.廣泛使用MF59唯一的問題最常見的是在注射部位可發(fā)生疼痛這樣輕微的副作用,這可能由于接種時免疫細胞聚集于注射部位的結果[33].

3 現(xiàn)正研制中的下一代季節(jié)性流感疫苗

3.1 雙HA基因雞胚苗 美國FDA目前所批準的流感疫苗常為非雞胚生產的流感疫苗,但與標準的雞胚疫苗相比,這些疫苗的使用仍然相對有限,主要原因與生產設施的受限有關.因此,改善季節(jié)性流感疫苗傳統(tǒng)的雞胚研制和生產仍有必要.但目前一些研究團隊只是簡單地避免以雞胚為基礎的疫苗研制,為了克服傳統(tǒng)流感疫苗的局限性,Harding等最近報告了以改進篩選預測CVVs為主的基因重組法,該重組疫苗可在雞胚中生長,但避免了發(fā)生雞胚適應性突變[36].其主要方法在于構建一個同時含有可表達HA和NA蛋白的重組株,其次在另一片段(原為NA表達片段)中表達第二個HA.這個方案可以使我們在同一個重組株上既表達一個適合雞胚生長的輔助HA又表達一個與流行有關的HA,這就消除了H3N2病毒最初在雞胚中難以生長而造成變異的因素[37-39].用這種雙HA系統(tǒng),研究認為其不造成HA的單適應性突變,輔助HA使重組株可以很快適應在雞胚中的生長,而克隆入與流行有關的HA產生的中和抗體可抗臨床流行株,起到很好的CVV篩選作用.與其他替代策略相比,本法可以充分地利用全球已有的雞胚疫苗生產設施[36]來生產流感疫苗.雖然這種方法仍然容易受到雞胚短缺的影響,也不適合有嚴重雞蛋過敏史的人,但該系統(tǒng)可按目前相同的標準和價格大規(guī)模生產疫苗,仍然是不失為一種很好的替代辦法.

3.2 納米粒子苗 目前正在開發(fā)的另一種替代疫苗是使用納米粒子.Novavax公司研制的納米流感疫苗平臺NanoFlu不久將進入第一期臨床研究階段.該平臺類似于桿狀病毒系統(tǒng),但以粒子為基礎,使用在細胞株中表達HA抗原[40-41];與雞胚疫苗生產不同,細胞表達的HA被純化并組裝在納米粒子中,與難以適應雞胚疫苗并可能造成變異不同的是納米粒子中的HA保留了與桿狀病毒表達HA的同樣優(yōu)點.但與FluBlok不同的是,在納米溶液中納米粒子只是作為HA蛋白的載體,研究證明這種顆粒形式的抗原通常能夠起到自我佐劑的作用而增強免疫反應[42-43].此外,基于納米粒子的策略有些類似于通用疫苗,能夠激發(fā)廣譜且普遍的抗流感免疫反應[40-41].納米粒子疫苗可產生廣泛的反應性抗病毒抗體,使得特定的納米粒子疫苗與標準的季節(jié)性流感疫苗相比,其保護的時間更長,大大提高了季節(jié)性疫苗的效果.但目前缺乏納米疫苗生產設施,就像其他非雞胚疫苗一樣,這種研制法無法滿足一個流行季節(jié)所需的劑量;此外,目前還無以納米粒子為基礎的疫苗的審批先例,這也是納米苗研制生產的重大問題.

3.3 肽苗 基于肽的疫苗是另一個疫苗研制方法.該平臺依賴于合成B和T細胞識別特定表位的流感蛋白(一般是HA,M1/M2和NP蛋白).合成后,把純化肽裝載到脂質體或病毒體中,這兩者自身既可作為佐劑又可作為遞送抗原的載體,但研究認為脂質體或病毒體可能更適合用于疫苗抗原的傳遞運送[44-45].脂質體和病毒體組成的疫苗已經進行了臨床前試驗,并證明可引發(fā)抗流感病毒感染的保護作用.肽疫苗可經人工合成,它既無雞胚供應問題及也無與雞蛋有關的過敏問題,在對特定抗原的免疫應答方面其類似于納米顆粒疫苗,顯示了潛在的更為普遍的保護作用[46].由于肽疫苗的配方非常復雜,它包括了抗原性肽、脂質體/病毒體等成份在內[44],因此優(yōu)化這些組成需費時,其成本目前也無法核算,此外用于生產這些疫苗的設施目前更是很有限.

3.4 核酸苗 另一種很有發(fā)展前景的方法是核酸疫苗.不像前面提到的任何策略,核酸疫苗不依賴于蛋白質的生產,與之相反,它只需要重組DNA或RNA分子.一般來說,核酸疫苗需攜帶表達HA的核酸,HA的核酸序列被克隆到表達質粒中,在如大腸桿菌之類的細菌細胞中大量轉錄復制后,按所需被制備成RNA或DNA疫苗.通常用注射接種方式,將核酸苗注入體內,宿主細胞吸收RNA或DNA,表達所需HA抗原.已經成功地進行了核酸苗的一期的臨床試驗[47-48].雖然DNA疫苗和RNA疫苗在研制上有一些的區(qū)別,但其共同的優(yōu)勢是這樣研制的疫苗不受毒株在雞胚中適應的影響,其所表達的抗原也能與流行株相同;此外核酸苗不像蛋白質苗那樣,容易大量快速的生產,而且傳遞也特別簡單.雖然核酸苗的優(yōu)點較多,但其挑戰(zhàn)也很大.在獸醫(yī)方面,該苗有被審批使用的先例[49],但在人醫(yī)方面還未有.此外,核酸導入細胞可以激活許多天然免疫信號通路[50],這將干擾降低疫苗的效力.

4 通用疫苗

前已述及,流感病毒的HA有18個亞型、11個NA亞型,目前在人類及動物中起碼已發(fā)現(xiàn)了幾十種流感病毒.流感病毒在人類經常發(fā)生抗原漂移而產生新的流感病毒,在全球也還存在著南北兩半球抗原特點不同的流感病毒,因此選擇一種通用的流感苗就成為人們的期望.

通用疫苗其被期望能達到的功能即是在疫苗接種后能在體內產生廣譜中和抗體.首先確定的是中和抗體與HA的莖部表位有關,其后又發(fā)現(xiàn)HA蛋白頭部也產生強烈的結合抗體,HA亞型的構成與HA蛋白頭部的抗原及受體不同有關,而HA的莖部區(qū)則很保守.此外,少數嵌合在包膜上M2e區(qū)也可產生廣譜中和抗體,而且M2e蛋白也是高度保守的,這就奠定了通用苗的研制基礎主要是HA的莖部區(qū)和第7片斷產生的M2e蛋白區(qū)這兩個抗原的保守區(qū)域[51-52].其次,如何遞送這些保守結構域,使這些保守結構域經過特殊的抗原提呈能夠在機體引起強烈的免疫反應,用融合蛋白、病毒樣顆粒和非致病性病毒等都試過對這些結構域的傳遞.第三,臨床研究發(fā)現(xiàn)早期感染流感而發(fā)生強烈T細胞免疫反應的人有更好地抗感染結果,而T細胞對保守結構域的表位也有反應,但反應并不強,研究顯示因為保守表位基本上都位于內部蛋白質結構域上,而這些內部蛋白質結構域免疫原性不強,尤以M2e蛋白最弱,所以通用疫苗的研究目前主要以HA的莖部區(qū)為免疫原;第四,目前研究則主要集中使用佐劑來提高通用疫苗產生抗感染所需的足夠強大和持久的免疫反應的能力[52-53].

5 小結和展望

流感疫苗研制,源于上世紀30年代,迄今已有70多年的歷史.最初的流感疫苗系用流行株單苗滅活苗接種,效果當然不好.60年代,美軍方用多亞型滅活苗混合,效果趨于改善,直至70年代,開始采用重組適應方法篩選CVV,疫苗保護率有明顯的提升,在WHO的指導下,全球范圍內基本上都采用雞胚疫苗的生產技術.發(fā)展至今,雖然有小部分細胞苗代替,但仍不足以供應全球使用.基于這個原因,目前還主要以生產雞胚苗為主,但因適應株的原因須要在這方面不斷改善.

在我國,流感疫苗屬于二類苗,即是自費使用的疫苗.除敏感人群外,免疫系統(tǒng)完全及強壯者則不需考慮使用.因此各國除了對65歲及以上的老年人、慢病征候者及醫(yī)務工作者有統(tǒng)一要求外,對于兒童年齡、疫苗組成及免疫程序均有不同,如在一些國家就認為裂解苗與亞單位苗免疫原性較差,需要對此類疫苗進行基礎及加強免疫的要求[54],而歐盟幾年前就沒有要求使用[55].另外冷適應減毒疫苗可能在免疫低下人群發(fā)生重組而產生新流感病毒,在我國和其他一些國家,就不考慮引進或研制,而在另一些國家,則只限定在2～7歲兒童中使用[56].

自1918年發(fā)生H1N1西班牙流感大流行以來,迄今為止全球范圍起碼已發(fā)生了4次流感大流行,隨著人類對流感大流行威脅的關注以及科學技術的不斷發(fā)展,很難想象再發(fā)生類似1918年慘絕人寰的“西班牙”流感大流行,這從2009年源自墨西哥的“豬流感”大流行可以得到回答,起碼在我國,2009年H1N1大流行疫苗的研制還是使用雞胚苗.但從下一代發(fā)展的疫苗并權衡生產設施來看,雙HA基因雞胚苗應是較為適宜,期望其盡快完成研究與審批工作.

通用疫苗是人們期盼20多年的產物,但如何提高該苗對各變異株的廣譜中和能力確實是一個大問題;從目前研究結果來看,它還不能進入實用.本文認為M2e抗原性很弱,難以引起強的免疫應答;使用佐劑也難以達到其通用抗感染的能力.只有HA2頸部區(qū)的保守抗原表位還有希望,但近年內難以有HA2頸部區(qū)通用疫苗的產生[57-58].因為有這些問題的存在,因此我們只能是關注通用疫苗的研究發(fā)展,而不是等待使用.