盧 珊，羅 云，孫桂波，孫曉波

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

1 A20的結(jié)構(gòu)與功能

鋅指蛋白A20又稱腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(TNFα-induced protein 3,TNFAIP3),是1990年研究腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞作用時(shí)發(fā)現(xiàn)的。人體中編碼A20的基因位于6號(hào)染色體，由790個(gè)氨基酸殘基組成蛋白，分子量為90 ku[2]。A20由N末端區(qū)(1-385)和C末端區(qū)(386-775)2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成，前者含有半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域OUT，靶向K63連接泛素化鏈作用受體蛋白1(receptor interacts with the protein kinase 1，RIP1)，從RIP1上去除K63連接泛素鏈，具有去泛素化酶活性；后者具有7個(gè)重復(fù)的Cys2/Cys2鋅指結(jié)構(gòu)，第4鋅指有E3泛素連接酶功能，啟動(dòng)RIP1的K48連接泛素鏈的泛素化[3]。因此，A20具有去泛素化和泛素化雙重功能。A20對(duì)NF-κB的抑制作用高度依賴于它的泛素化和去泛素化作用。

A20在全身各組織細(xì)胞均有表達(dá)，是一種誘導(dǎo)性蛋白質(zhì)，基礎(chǔ)A20水平在大多數(shù)細(xì)胞中很難檢測(cè)到，當(dāng)收到危險(xiǎn)信號(hào)時(shí)，A20能以NF-κB依賴的方式快速產(chǎn)生。A20能有效抑制TNF-α和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)引起的凋亡，以及NF-κB和激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)轉(zhuǎn)錄因子的活化[4]。A20對(duì)NF-κB信號(hào)通路起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也對(duì)體內(nèi)炎癥反應(yīng)起一定抑制作用。

2 A20的生物學(xué)特性

A20的生物學(xué)特性之一是具有細(xì)胞保護(hù)作用，能夠保護(hù)一些細(xì)胞類型免受特殊的刺激物引起的細(xì)胞死亡。早先研究表明，A20通過抑制死亡結(jié)構(gòu)域接頭蛋白(tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein，TRADD)和RIP募集到腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR1)死亡結(jié)構(gòu)域，阻止caspase-8酶原裂解，以及隨后的瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而抑制TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Onizawa等[5]近期發(fā)現(xiàn)，A20可以抑制細(xì)胞壞死，主要是通過抑制RIPK1-RIPK3復(fù)合物的形成，而不依賴于半胱天冬蛋白酶(caspase)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Won等[6]發(fā)現(xiàn)，A20通過抑制TNFR1下游凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)-氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號(hào)活化，抑制細(xì)胞凋亡。但A20的抗凋亡功能并不適用于所有的細(xì)胞系，如A20可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受TNF和Fas引起的凋亡，但不能保護(hù)A549、HepG2、HeLa細(xì)胞[2]。值得注意的是，A20的細(xì)胞保護(hù)作用及其潛在機(jī)制主要是依據(jù)A20過表達(dá)實(shí)驗(yàn)得到的，后續(xù)仍需用A20缺乏的細(xì)胞驗(yàn)證其生理上的相關(guān)性。

A20的另一功能是具有抗炎作用，過表達(dá)的A20可以明顯抑制由不同刺激物導(dǎo)致的NF-κB活性。A20可以減少NF-κB靶基因的表達(dá)，包括E選擇素、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、IL-8、核因子κB抑制因子α(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor，IκBα)、IL-6。

3 A20的調(diào)節(jié)機(jī)制

調(diào)節(jié)A20活性的重要機(jī)制就是調(diào)節(jié)A20的表達(dá)。調(diào)節(jié)A20表達(dá)有多種不同的方式，其中一種是通過磷酸化調(diào)節(jié)。當(dāng)受到TNF或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激時(shí)，A20的Ser381位點(diǎn)可被IκB激酶(IKKβ)磷酸化，進(jìn)一步增加抑制NF-κB信號(hào)通路的能力[7]。另外，越來越多的研究表明，生理狀態(tài)會(huì)影響A20的穩(wěn)定性。在高糖環(huán)境下培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞中，A20水平依賴于O-糖基化的后轉(zhuǎn)錄，后者調(diào)節(jié)A20的泛素化和降解[8]。也有研究表明，A20能夠被可逆氧化反應(yīng)激活，表明氧化應(yīng)激和活性氧可能影響細(xì)胞的生理狀態(tài)，進(jìn)而影響A20水平[9]。A20也可以通過和特殊的結(jié)合蛋白結(jié)合而發(fā)揮抗炎活性。A20結(jié)合核因子抑制蛋白(ABIN)和Tax1結(jié)合蛋白1(Tax1-binding protein 1，TAX1BP1)是A20的結(jié)合蛋白，通過結(jié)合多聚泛素來募集A20[10-11]。近年來，非編碼RNA在血管損傷中的調(diào)控機(jī)制越來越受到人們重視，一些研究表明，miRNAs也可以調(diào)節(jié)A20的表達(dá)[12]。有報(bào)道表明[13]，miR-19b、miR-29c、miR-23a可以靶向調(diào)節(jié)A20。在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，miR-23a表達(dá)減少，反而使A20表達(dá)增加，從而抑制NF-κB信號(hào)。

總之，機(jī)體通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)A20的表達(dá)和活性來抑制過度的促炎信號(hào)。理解這些機(jī)制將有助于我們更好的理解A20在組織生理學(xué)中的具體作用，幫助我們理解為什么在特定條件下可以發(fā)生炎癥的病理變化。

4 A20在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中的作用

4.1A20與血管內(nèi)皮細(xì)胞血管炎癥能引起內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，抑制內(nèi)皮凋亡是防止動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵。早先研究證實(shí)，A20具有抗炎和抗凋亡的雙重保護(hù)作用。Longo[14]的研究曾表明，在人的冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，A20過表達(dá)可以降解IκBα，從而阻斷CD40配體所誘導(dǎo)的NF-κB激活，隨之下調(diào)炎癥因子ICAM-1、VCAM-1、E選擇素的表達(dá)，進(jìn)而推斷A20可以預(yù)防修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變。A20過表達(dá)還能夠抑制caspase-8的活性，保護(hù)細(xì)胞免受死亡受體介導(dǎo)的凋亡，在TNF和Fas等致動(dòng)脈粥樣硬化刺激下，保持線粒體的完整性[15]。近期，Li等[16]的研究也表明，A20可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，主要是通過抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶(TGF activation kinase，TAK1)的磷酸化，調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)信號(hào)通路來發(fā)揮作用。

4.2A20與單核巨噬細(xì)胞單核細(xì)胞浸潤(rùn)是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要特征，單核巨噬細(xì)胞活化能夠釋放大量炎癥因子，加重炎癥反應(yīng)，從而加劇動(dòng)脈粥樣硬化。LPS可以激活單核巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生各種炎性因子，引發(fā)體內(nèi)炎癥反應(yīng)。吳麗娟等[17]研究發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)使人單核細(xì)胞中A20過表達(dá)，LPS對(duì)單核細(xì)胞的活化被大量抑制，細(xì)胞合成并分泌的TNF-α減少，從一個(gè)特定角度解釋了A20缺陷小鼠對(duì)LPS和TNF-α的敏感性異常增高的現(xiàn)象。徐丹等[18]進(jìn)一步通過陽離子脂質(zhì)體將A20基因轉(zhuǎn)染入單核細(xì)胞，A20過表達(dá)可抑制 TNF-α、IL-12的表達(dá)，而上調(diào)抗炎因子IL-10表達(dá)，并通過改善促炎因子/抗炎因子的平衡關(guān)系，從而達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的作用。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein ，ox-LDL)是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)獨(dú)立致病因素。巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL形成泡沫細(xì)胞，釋放多種促炎介質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展。Li等[19]發(fā)現(xiàn)，A20表達(dá)可以阻斷ox-LDL導(dǎo)致的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，A20減弱Fas和FasL的表達(dá)，減少Fas介導(dǎo)的凋亡，其具體機(jī)制是通過降低caspase-8活性和線粒體通路來發(fā)揮作用。

4.3A20與血管平滑肌細(xì)胞在病理狀態(tài)下，致炎黏附分子和趨化因子的表達(dá)增加，能提高平滑肌細(xì)胞的活化狀態(tài)，繼而增加平滑肌細(xì)胞的增殖，使平滑肌細(xì)胞由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型，基質(zhì)產(chǎn)物增多，導(dǎo)致內(nèi)膜增生。因此，抑制新生平滑肌細(xì)胞增殖和加速其凋亡都可以達(dá)到減輕動(dòng)脈粥樣硬化的作用。A20能加速細(xì)胞因子和Fas介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞凋亡。在人平滑肌細(xì)胞中，A20過表達(dá)能明顯抑制NF-κB引起的ICAM-1和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)表達(dá)；而且A20能明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，主要是通過上調(diào)p21和p27的表達(dá)，抑制周期依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase，CDK2)和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，最終抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，又通過逆轉(zhuǎn)ox-LDL介導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的升高，阻斷平滑肌細(xì)胞的遷移[20]。移植物動(dòng)脈硬化是同種異體移植失敗的主要原因，有報(bào)道表明[21]，血管A20過表達(dá)能明顯減少移植物動(dòng)脈硬化病變，減少移植炎癥和增加新生內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)血管內(nèi)膜，降低移植血管損傷，因此，A20能抑制免疫介導(dǎo)的血管同種異體移植物的重構(gòu)，預(yù)防移植血管動(dòng)脈粥樣硬化。

總之，A20發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用主要表現(xiàn)在以下幾方面：A20可以減少內(nèi)皮細(xì)胞活化和功能失調(diào)，減少黏附分子的表達(dá)；限制免疫細(xì)胞的滲透；減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；抑制平滑肌細(xì)胞遷移和增殖。在ApoE-/-小鼠模型中，主動(dòng)脈弓A20過表達(dá)可以改善動(dòng)脈粥樣硬化，相反地，A20單倍體不足可以加重動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。有研究表明，ApoE-/-小鼠中A20單倍體不足可以導(dǎo)致IκBα、VCAM-1、ICAM-1、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF receptor-associated factor，TRAF-2)等NF-κB靶基因mRNA水平增加，可能是通過不同的信號(hào)通路發(fā)揮作用的，包括NF-κB信號(hào)通路、IL-6可溶性信號(hào)傳導(dǎo)鏈(IL-6 soluble transducer, IL-6 ST,又名gp130)介導(dǎo)的IL-6信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)信號(hào)通路[22]。因此，A20有望成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的有效潛在靶點(diǎn)。

5 A20與藥物調(diào)節(jié)

二十碳五烯酸作為魚油中主要的n-3多不飽和脂肪酸，Huang等[23]已證明其具有抗炎特性，可以減少apoE缺乏小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變。主要機(jī)制為上調(diào)A20的表達(dá)，抑制TRAF6的泛素化和易位，從而抑制下游的TAK1和p38磷酸化，以達(dá)到調(diào)節(jié)NF-κB活性的作用，為動(dòng)脈粥樣硬化和炎癥疾病的預(yù)防提供新的認(rèn)識(shí)。靈仙新苷是從中藥威靈仙中提取的一種三萜皂苷類化合物，Han等[24]研究表明，靈仙新苷可以通過鋅指蛋白A20抑制NF-κB、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、ICAM-1、TNF-α、IL-1β等的表達(dá)，從而減輕大腦炎癥，修復(fù)血腦屏障損傷，減輕腦水腫，為與系統(tǒng)性炎癥疾病相關(guān)的中風(fēng)提供一種藥物治療。Gui等[25]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪通過抑制NF-κB信號(hào)通路來抑制炎癥免疫應(yīng)答，又進(jìn)一步通過腺病毒和慢病毒感染和免疫共沉淀等方法得出，黃芪能明顯提高A20表達(dá)，且通過抑制TRAF6 K63鏈泛素化阻斷NF-κB信號(hào)通路，這為我們更好地在細(xì)胞和分子水平上分析黃芪或者其他中草藥的有效藥用成分提供了依據(jù)。

6 結(jié)語

A20為一種具有雙重作用的泛素編輯蛋白，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和調(diào)控凋亡方面具有重要作用。而動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，越來越多的研究資料表明，A20在動(dòng)脈粥樣硬化的防治方面具有一定作用，能夠有效地抑制多種刺激因子如NF-κB、ox-LDL 等對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的損傷，但其在一些傳導(dǎo)通路中的具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。隨著研究的不斷深入，A20有望成為預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)。因此，真正了解A20對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用，找到增加其活性的方法，將會(huì)在未來的治療中開辟一條新的途徑。

[1] Mozaffarian D, Benjamin E J, Go A S, et al. Executive summary: heart disease and stroke statistics--2016 update: a report from the American Heart Association [J].Circulation, 2016,133(4): 447-54.

[2] 姚 丹, 龔開政, 張振剛.鋅指蛋白A20與心血管疾病的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版), 2014,8(13): 2494-8.

[2] Yao D, Gong K Z, Zhang Z G. Progress in zinc finger protein A20 and cardiovascular disease [J].ChinJClin(ElectronEd), 2014,8(13):2494-8.

[3] Ma A, Malynn B A. A20: linking a complex regulator of ubiquitylation to immunity and human disease [J].NatRevImmunol, 2012,12(11): 774-85.

[4] Yamaguchi N, Yamaguchi N. The seventh zinc finger motif of A20 is required for the suppression of TNF-α-induced apoptosis [J].FEBSLett, 2015,589(12): 1369-75.

[5] Onizawa M, Oshima S, Schulze-Topphoff U, et al. The ubiquitin-modifying enzyme A20 restricts ubiquitination of the kinase RIPK3 and protects cells from necroptosis [J].NatImmunol, 2015,16(6): 618-27.

[6] Won M, Park K A, Byun H S, et al. Novel anti-apoptotic mechanism of A20 through targeting ASK1 to suppress TNF-induced JNK activation[J].CellDeathDiffer, 2010,17(12): 1830-41.

[7] Hutti J E, Turk B E, Asara J M, et al. IkappaB kinase beta phosphorylates the K63 deubiquitinase A20 to cause feedback inhibition of the NF-kappaB pathway[J].MolCellBiol, 2007,27(21): 7451-61.

[8] Shrikhande G V, Scali S T, Da S C, et al. O-glycosylation regulates ubiquitination and degradation of the anti-inflammatory protein A20 to accelerate atherosclerosis in diabetic ApoE-null mice [J].PLoSOne, 2010,5(12): e14240.

[9] Lee J G, Baek K, Soetandyo N, et al. Reversible inactivation of deubiquitinases by reactive oxygen species in vitro and in cells[J].NatCommun, 2013,4: 1568.doi:10.1038/ncomms2532.

[10] Zhou J, Wu R, High A A, et al. A20-binding inhibitor of NF-?B (ABIN1) controls Toll-like receptor-mediated CCAAT/enhancer-binding protein activation and protects from inflammatory disease[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2011,108(44): E998-1006.

[11] Iha H, Peloponese J M, Verstrepen L, et al. Inflammatory cardiac valvulitis in TAX1BP1-deficient mice through selective NF-kappaB activation[J].EMBOJ, 2008,27(4): 629-41.

[12] 馬 婧, 凌 霜, 黨延啟,等.非編碼RNA在血管損傷、重塑和老化中的作用[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(1): 14-8.

[12] Ma J, Ling S, Dang Y Q, et al. Role of noncoding RNA in vascular injury, remodeling and aging [J].ChinPharmacolBull, 2016,32(1):14-8.

[13] Peng P, Li Z, Liu X. Reduced expression of miR-23a suppresses A20 in TLR-stimulated macrophages [J].Inflammation, 2015,38(5): 1787-93.

[14] Longo C R. A20 protects from CD40-CD40 ligand-mediated endothelial cell activation and apoptosis [J].Circulation, 2003,108(9): 1113-8.

[15] Daniel S. A20 protects endothelial cells from TNF-, Fas-, and NK-mediated cell death by inhibiting caspase 8 activation[J].Blood, 2004,104(8): 2376-84.

[16] Li L, Huang B, Song S, et al. A20 functions as mediator in TNF alpha-induced injury of human umbilical vein endothelial cells through TAK1-dependent MAPK/eNOS pathway[J].Oncotarget, 2017,8(39): 65230-9.

[17] 吳麗娟, 劉國棟, 陳 偉,等.鋅指蛋白A20對(duì)人單核細(xì)胞LPS應(yīng)答的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007,29(14): 1388-90.

[17] Wu L J, Liu G D, Chen W, et al. Effects of zinc finger protein A 20 on lipopolysaccharide responses in human monocytes[J].ActaAcadMedMilTert, 2007,29(14):1388-90.

[18] 徐 丹, 曲 鵬, 牛 楠,等.鋅指蛋白A20干預(yù)人單核細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-12以及IL-10表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 嶺南心血管病雜志, 2013,19(2): 226-30.

[18] Xu D, Qu P, Niu N, et al. Interference of gene transfection of A20 zinc finger protein on expression of TNF-α,IL-12 and IL-10 in human monocytes[J].SouthChinaJCardiovascDis, 2013,19(2):226-30.

[19] Li H, Wang A, Zhang R, et al. A20 inhibits oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis through negative Fas/Fas ligand-dependent activation of caspase-8 and mitochondrial pathways in murine RAW264.7 macrophages[J].JCellPhysiol, 2006,208(2): 307-18.

[20] Patel V I, Daniel S, Longo C R, et al. A20, a modulator of smooth muscle cell proliferation and apoptosis, prevents and induces regression of neointimal hyperplasia[M], 2006:1418-30.

[21] Siracuse J J, Fisher M D, Da Silva C G, et al. A20-mediated modulation of inflammatory and immune responses in aortic allografts and development of transplant arteriosclerosis[J].Transplantation, 2012,93(4): 373-82.

[22] Wolfrum S, Teupser D, Tan M, et al. The protective effect of A20 on atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice is associated with reduced expression of NF-kappaB target genes [J].ProcNatlAcadSciUSA, 2007,104(47): 18601-6.

[23] Huang C, Sheu W H, Chiang A. Docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid suppress adhesion molecule expression in human aortic endothelial cells via differential mechanisms[J].MolNutrFoodRes, 2015,59(4): 751-62.

[24] Han D, Fang W, Zhang R, et al. Clematichinenoside protects blood brain barrier against ischemic stroke superimposed on systemic inflammatory challenges through up-regulating A20[J].BrainBehavImmun, 2016,51: 56-69.doi:10.1016/j.bbi.2015.07.025.

[25] Gui J, Chen R, Xu W, et al. Remission of CVB3-induced myocarditis with Astragaloside IV treatment requires A20 (TNFAIP3) up-regulation [J].JCellMolMed, 2015,19(4): 850-64.