趙本宣 趙 晟 李汝偉 劉 強(qiáng) 吳常文①

(1. 浙江海洋大學(xué) 舟山 316022; 2. 國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 舟山 316022)

大洋海域更具生存優(yōu)勢(shì), 這意味著AAPB的豐度和多樣性會(huì)隨環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)豐富程度的提高而降低, 反之亦然。而Goericke(2002)等在南加利福尼亞沿岸的富營(yíng)養(yǎng)、中營(yíng)養(yǎng)和貧營(yíng)養(yǎng)水域的對(duì)比研究卻得出與Kolber等人相反的結(jié)論。有人在泥炭沼澤湖泊中研究發(fā)現(xiàn), 在 pH為 6.7—7.6之間時(shí), AAPB的豐度最高(Lew et al, 2016)。因此, 目前AAPB在初級(jí)生產(chǎn)力中的地位還不能夠完全明確, 而且影響AAPB分布格局及其在海洋生物生產(chǎn)和物質(zhì)循環(huán)中生態(tài)地位的機(jī)制或許要比預(yù)期的更加復(fù)雜(胡耀華, 2006), 只有從季節(jié)、年度尺度上對(duì)全球多個(gè)典型海區(qū)的廣泛的自然生態(tài)學(xué)調(diào)查, 獲取更充分、更具代表性的第一手?jǐn)?shù)據(jù),才能全面、準(zhǔn)確地評(píng)估AAPB在海洋中的生態(tài)地位。

基于基因組和其它單基因位點(diǎn)的證據(jù)表明,AAPB和厭氧光合細(xì)菌一樣也含有細(xì)菌葉綠素, 它們是按功能分類的一類屬于變形菌門的細(xì)菌(Yurkov et al, 1998a, b; Bryant et al, 2006)。早期發(fā)現(xiàn)的大部分AAPB都來(lái)源于海洋環(huán)境, 在進(jìn)化上都屬于α-Proteobacteria, 而 唯 一 屬 于 β-Proteobacteria的AAPB來(lái)自于淡水環(huán)境(Suyama et al, 1999), 基于環(huán)境序列的分析表明海洋未可培養(yǎng)細(xì)菌中還存在著類似 β-Proteobacteria 的 AAPB (Béjà et al, 2002)。而最近的研究表明在近岸海洋表層微生物群落中γ-Proteobacteria也占有相當(dāng)?shù)谋戎?Hu et al, 2006;Cho et al, 2007)?；诳膳囵B(yǎng)和非培養(yǎng)的研究表明AAPB具有屬于α、β、γ分支的廣泛的遺傳多樣性, 這些研究都擴(kuò)展了AAPB的多樣性(Salka et al, 2008)。由于海洋環(huán)境中絕大多數(shù)細(xì)菌都是未可培養(yǎng)的, 必然還會(huì)存在許多稀有的、目前還不為人知的AAPB種類。前人研究表明, 基于 16S rRNA的基因序列與pufM基因的序列分析結(jié)果所得到的AAPB系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不完全一致, 這說(shuō)明光合作用的超級(jí)操縱子的側(cè)向遷移產(chǎn)生了高度多樣化的 AAPB 群落(Nagashima et al, 1997; Yurkov et al, 1998a, b)。像 16S rRNA基因, pufM基因存在于所有的AAPB中, 具有保守區(qū)和可變區(qū), 使其成為一個(gè)很好的用于量化的豐度和評(píng)估 AAPB 的遺傳多樣性的分子標(biāo)記(Achenbach et al, 2001; Allgaier et al, 2003)。由編碼光合反應(yīng)中心M亞基的pufM基因所設(shè)計(jì)出來(lái)的引物被廣泛地用來(lái)擴(kuò)增來(lái)自不同環(huán)境的樣品, 作為研究AAPB基因多樣性的最常用的方法(Yutin et al, 2005)。

對(duì)整個(gè)大西洋和太平洋的觀測(cè)證據(jù)表明, AAPB的豐度和多樣性沿環(huán)境梯度而改變。例如, 沿海和咸水似乎具有獨(dú)特的AAPB分支, 而在開(kāi)放的海洋中卻未發(fā)現(xiàn)(Yutin et al, 2007)。同樣, 具有更高生產(chǎn)力的水域, 正如高葉綠素 a濃度所指示的, AAPB多樣性比貧營(yíng)養(yǎng)水域要低(Jiao et al, 2007)。相反, 在一些主要的出?？诙ǖ牟蓸游恢米杂缮钆c顆粒附著AAPB之間不存在顯著差異, 但采樣點(diǎn)之間卻存在遺傳多樣性的顯著差異(Cottrell et al, 2010)。來(lái)自波羅的海不同位置的細(xì)菌樣本間存在 AAPB實(shí)質(zhì)性的遺傳變異, 包括兩個(gè)淡水和咸水分支(Masín et al, 2006;Salka et al, 2008), 進(jìn)一步表明AAPB的遺傳多樣性,并且這種多樣性具有與環(huán)境變量相關(guān)的生物地理和潛在的系統(tǒng)地理格局。已有的結(jié)果表明, 盡管環(huán)境變化可能很重要, 但也可能是特有的AAPB與原有島嶼生物地理學(xué)的一些假設(shè)一致(Losos, 1967), 即使沒(méi)有明顯限制它們懸浮分散在海洋中, 這表明地理的距離可能在這些微生物種群的生態(tài)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。而AAPB群體遺傳多樣性也與環(huán)境變量和位置相關(guān), 表明種群數(shù)量和遺傳多樣性是通過(guò)環(huán)境變量和特有機(jī)制的組合進(jìn)行調(diào)節(jié)的(Ritchie et al, 2012)。

舟山群島海域是東海地區(qū)集旅游、港口、工業(yè)、漁業(yè)、養(yǎng)殖區(qū)等于一體的重要海域。根據(jù)舟山市海洋功能區(qū)劃, 結(jié)合島礁分布和行政區(qū)劃, 在基本涵蓋舟山所有功能海域的基礎(chǔ)上, 我們選擇了 8個(gè)典型站位。本文針對(duì)這8個(gè)典型站位的表層海水樣品, 基于高通量 DNA測(cè)序的方法, 利用編碼光合反應(yīng)復(fù)合中心小亞基的pufM基因構(gòu)建文庫(kù), 對(duì)AAPB分布及其系統(tǒng)發(fā)育多樣性進(jìn)行分析, 旨在初步探討舟山群島海域AAPB的多樣性情況, 為今后舟山群島AAPB生態(tài)學(xué)角色及其在碳循環(huán)中的貢獻(xiàn)奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及預(yù)處理

于2016年4月在舟山群島海域選擇8個(gè)代表性站位, 采樣點(diǎn)的選擇依據(jù)舟山市海洋功能區(qū)劃和行政區(qū)劃相結(jié)合的原則, 采樣站位為東極島(DJ)(122.69°°E, 30.19°N)、岱山(DS)(122.11°E,30.27°N)、沈家門(SJM)(122.32°E, 29.94°N)、枸杞島(GQ)(122.81°E, 30.72°N)、金塘島(JT)(121.85°E,30.07°N)、六橫島(LH)(122.11°E, 29.79°N)、桃花島(TH)(122.30°E, 29.81°N)、朱家尖(ZJJ)(122.41°E,29.92°N), 見(jiàn)圖 1。采集表層(0.5m)海水樣品各2L裝入預(yù)先滅過(guò)菌的聚乙烯采樣瓶中, 先用真空抽濾裝置經(jīng) 3μm 孔徑濾膜過(guò)濾去除大顆粒雜質(zhì), 再用0.22μm 孔徑濾膜過(guò)濾, 然后將濾膜取出, 放入已滅菌的含有石英砂的5mL離心管中, 于液氮中保存, 用于細(xì)菌DNA提取。

圖1 調(diào)查海區(qū)及采樣站位(東海舟山群島海域)Fig.1 Location of the study area and sampling stations in the Zhoushan Archipelago, the East China Sea注: 東極島(DJ), 枸杞島(GQ), 金塘島(JT), 六橫島(LH), 沈家門(SJM), 桃花島(TH), 朱家尖(ZJJ), 岱山(DS)。樣品采集于2016年4月8—30日

1.2 環(huán)境參數(shù)測(cè)定

在水樣采集的同時(shí), 利用攜帶的便攜式 HQ-30D溶氧儀測(cè)定溶解氧和溫度, 鹽度計(jì)和 pH計(jì)分別測(cè)定鹽度和 pH, 總磷使用便攜多參數(shù)水質(zhì)分析儀(型號(hào):5B-2H)進(jìn)行測(cè)定, 其它一些水質(zhì)參數(shù), 如 COD、氨氮、硫酸鹽、磷酸鹽、硅酸鹽、亞硝酸鹽和硝酸鹽等使用 Smartchem-200全自動(dòng)間斷式化學(xué)分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3 DNA的提取及檢測(cè)

將保存濾膜的 5mL離心管從液氮中取出, 在無(wú)菌的條件下, 剪碎, 加入1mL提取緩沖液, 水樣中細(xì)菌DNA具體提取步驟參照美國(guó)MOBIO公司強(qiáng)力水樣DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū), 并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 AAPB pufM基因PCR擴(kuò)增

采樣針對(duì)不產(chǎn)氧光合細(xì)菌 pufM 基因擴(kuò)增引物(Achenbach et al, 2001; Béjà et al, 2002) pufM-557-f(5′-TACGGSAACCTGTWCTAC-3′) 和 pufM-750-r(5′-CCATSGTCCAGCGCCAG AA-3′), 對(duì)樣品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度約為193bp。PCR反應(yīng)體系為95℃預(yù)變性4min, 95℃變性30s, 58℃退火 30s, 72℃延伸 30s, 循環(huán) 35次, 72℃延伸 5min。20μL反應(yīng)混合液, 包括 2μL DNA, 正反引物各 0.7μL,10μL的PCR mastermix (TaKaRa), 用水補(bǔ)齊。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5% (W/V)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

1.5 樣品的高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析流程

將樣品的 PCR產(chǎn)物, 送至上海翰宇生物科技有限公司在Illumina MiSeqTM平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。為了提高分析結(jié)果的質(zhì)量, 在序列充足的同時(shí), 也要保證序列的質(zhì)量, 因此, 分析前要先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理, 得到優(yōu)質(zhì)序列。然后對(duì)優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行OTU聚類分析?；贠TU聚類分析結(jié)果, 可以進(jìn)行Alpha多樣性分析, 根據(jù) OTU的物種分類結(jié)果, 可以進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。將OTU和分類學(xué)信息結(jié)合在一起進(jìn)行 Beta多樣性分析。在提供了環(huán)境因子的情況下, 可以進(jìn)行多樣性統(tǒng)計(jì)分析。

數(shù)據(jù)預(yù)處理, 使用Mothur v.1.32.1 (Schloss et al,2009) (http://www.mothur.org/wiki/Calculators)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理, 得到優(yōu)質(zhì)序列, 并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用QIIME (Caporaso et al, 2010)聚類生成OTU, 相似性設(shè)為97%, 即任意兩條reads的相似度均達(dá)到97%以上,將該序列聚類為一個(gè)OTU。OTU代表序列與NCBI nr數(shù)據(jù)庫(kù)BlastX比對(duì), 得到每個(gè)OTU的分類學(xué)信息。

本研究中所有的原始數(shù)據(jù)全部上傳到 NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRP080714), 登錄號(hào)為ID: SRP080714。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 環(huán)境參數(shù)

現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行定位, 采集表層海水, 采樣深度為0.5m, 溶解氧(DO)、鹽度、pH、溫度現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定, 其它水質(zhì)參數(shù), 如 COD、總磷、溶解無(wú)機(jī)氮(DIN)等帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果如表1所示。從結(jié)果可以看出, 水溫為13.8—17.2; ℃溶解氧(DO)變化不大,為10.00—11.85; pH范圍在7.65—7.92; 鹽度變化較大, 20—33, 金塘最低, 東極最高; COD 含量都符合一類海水的標(biāo)準(zhǔn); 無(wú)機(jī)氮含量桃花島最高, 為0.438mg/L, 總磷枸杞島最低, 只有0.008mg/L。

表1 采樣點(diǎn)環(huán)境參數(shù)Tab.1 The environmental parameters of each sampling station

2.2 OTU聚類和Alpha多樣性

經(jīng)過(guò)預(yù)處理的原始測(cè)序數(shù)據(jù), 一共得到 192633條序列, 我們進(jìn)行了 OTU聚類分析, 相似性設(shè)為97%, 可以看到, 所有的數(shù)據(jù)最后一共分成 4051個(gè)OTU, 各站點(diǎn) OTU聚類結(jié)果分別是 DJ 490個(gè), GQ 670個(gè), JT 1123個(gè), LH 883個(gè), SJM 1526個(gè), TH 1204個(gè), ZJJ 691 個(gè)(表 2)。

進(jìn)行 Alpha多樣性分析, Alpha多樣性指數(shù)(estimator), 包括: 豐度評(píng)估指數(shù)(ACE指數(shù)和Chao 1指數(shù))和多樣性評(píng)估指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage)。從ACE指數(shù)和Chao 1指數(shù)的結(jié)果可以看出, 各采樣站點(diǎn)微生物豐富度排序是: SJM ＞ ZJJ＞ TH ＞ JT ＞ LH ＞ GQ ＞ DJ, 而從 Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)來(lái)看, 各站點(diǎn)微生物多樣性從高到低依次是: SJM ＞ LH ＞ JT ＞ TH ＞ ZJJ ＞ DJ ＞ GQ。從Coverage可以看出, 測(cè)序深度已經(jīng)足夠, 覆蓋度較高,文庫(kù)可用于評(píng)估AAPB多樣性。從稀釋性曲線(圖2)來(lái)看當(dāng)測(cè)序量超過(guò) 25000讀長(zhǎng)時(shí), 仍然有新的 OTU被發(fā)現(xiàn), 但是整個(gè)曲線已經(jīng)趨于平緩, 說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理, 更多的數(shù)據(jù)量對(duì)發(fā)現(xiàn)新 OTU的邊際貢獻(xiàn)很小, 從圖中也可以看出相同序列數(shù)時(shí), SJM、TH和JT的OTU數(shù)比其它三個(gè)位點(diǎn)要高, DJ最低, 說(shuō)明SJM、TH和JT的微生物豐富度要高于其它三個(gè)位點(diǎn), DJ的微生物豐富度最低。

表2 樣品OTUs(cutoff=0.03)聚類和Alpha多樣性指數(shù)情況Tab.2 The OTUs and the estimators of each sample (cutoff=0.03)

圖2 稀釋性曲線(cutoff=0.03)Fig.2 The rarefaction curve (cutoff=0.03)注: 橫軸為從某個(gè)樣品中隨機(jī)抽取的測(cè)序條數(shù), 縱軸為基于該測(cè)序條數(shù)能構(gòu)建的OTU數(shù)量。每條曲線代表一個(gè)樣品, 用不同顏色標(biāo)記。東極島(DJ), 枸杞島 (GQ), 金塘島 (JT), 六橫島 (LH), 沈家門 (SJM), 桃花島 (TH), 朱家尖 (ZJJ)

2.3 AAPB群落組成

根據(jù) OTU聚類分析的結(jié)果, 各采樣站點(diǎn)樣品中AAPB群落結(jié)果組成基本相似, 大部分序列都屬于未明確分類的細(xì)菌, 明確分類的門主要包括:Planctomycetes浮霉菌門, Proteobacteria變形菌門,Firmicutes厚壁菌門。AAPB在門水平上的組成分布與前人報(bào)道的結(jié)果相似(陳晨, 2014), 但是有關(guān)Planctomycetes的發(fā)現(xiàn)還不是很多。其中,Proteobacteria占已明確分類的細(xì)菌類群的絕對(duì)優(yōu)勢(shì),各站點(diǎn)中序列數(shù)目分別是DJ 150個(gè), GQ 43個(gè), JT 230個(gè), LH 819個(gè), SJM 195個(gè), TH 89個(gè), ZJJ 86個(gè), 最多的是LH, 其次是JT, 最少的是GQ。Firmicutes只在JT和 ZJJ發(fā)現(xiàn)了, Planctomycetes僅在 ZJJ檢測(cè)到 1條序列。在明確分類的各細(xì)菌門中, 屬于Proteobacteria的AAPB占到總體的97%。

各站點(diǎn)聚類分析結(jié)果中未明確分類的 AAPB占大多數(shù), 一共發(fā)現(xiàn)了 32個(gè)明確分類的屬, 明確分類的屬分類水平的分布情況見(jiàn)圖 3, 其中占優(yōu)勢(shì)的菌屬分別為 Roseobacter、Sphingopyxis、Loktanella、Sphingomonas、Methylobacterium 和 Escherichia, 其中前三個(gè)是所有站點(diǎn)共有的屬。其它還包括Skermanella、Brevundimonas、Thalassobium、Bacillus、Isosphaera、Ahrensia、Maritimibacter、Rhodobacter、Sulfitobacter、Elioraea、Erythrobacter、Blastomonas、Citromicrobium、Novosphingobium、Limnohabitans、Rubrivivax、Methyloversatilis、Desulfocapsa、Thiohalocapsa、Thiorhodococcus、Klebsiella、Amphritea、Cellvibrio、Pseudomonas和 Cycloclasticus。有些屬只在某一個(gè)位點(diǎn)或其中幾個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn), 例如,Isosphaera、 Maritimibacter、 Desulfocapsa、Thiorhodococcus、Klebsiella和 Amphritea只存在于ZJJ, Ahrensia、Blastomonas和Methyloversatilis僅在JT發(fā)現(xiàn)。Sulfitobacter和Elioraea是LH特有的兩個(gè)屬, 而 Novosphingobium 是 TH 的 特 有 屬,Limnohabitans和Rubrivivax也僅在SJM檢測(cè)到?？偟膩?lái)說(shuō), 各位點(diǎn)明確分類的 AAPB豐度大小順序是LH＞JT＞SJM＞DJ＞TH＞ZJJ＞GQ。

表3 門水平分類結(jié)果Tab.3 The taxonomy in phylum for AAPB in each station

2.4 AAPB群落相似性分析

從屬水平的樣品間聚類關(guān)系樹(shù)(圖 4)可以看出,各采樣位點(diǎn)之間的群落結(jié)構(gòu)相似性, 其中LH和SJM相似性較高, DJ和GQ相似性最高, 然后TH和DJ、GQ兩個(gè)比較相似, ZJJ又和DJ、GQ和TH相似性較高, JT和其它位點(diǎn)相似性是最低的。Heatmap圖可以很直觀的反映各位點(diǎn)在 AAPB屬水平上群落組成的相似性和差異性(圖 5)。橫軸代表各采樣位點(diǎn), 縱軸代表AAPB各屬, 在JT站點(diǎn), Bacillus和Erythrobacter豐度較高, 而 Roseobacter豐度相對(duì)較低, TH站點(diǎn),Sphingopyxis、Loktanella和 Roseobacter具有較高豐度, GQ主要是未明確分類的一些屬?？梢园l(fā)現(xiàn), 單獨(dú)分析某一個(gè)屬的時(shí)候, 各站點(diǎn)差別仍然很明顯, 比如:Roseobacter相對(duì)豐度最高的是LH, DJ和ZJJ相對(duì)豐度比較高的都是 Escherichia, 在 DJ和 SJM,Methylobacterium的豐度相對(duì)較高, Bacillus在JT和ZJJ的分布則相對(duì)較多。同樣又印證了LH和SJM具有較高相似性, ZJJ、DJ、GQ和TH相似性比較近, 而JT與其它位點(diǎn)差異性是最大的。

圖4 樣品間聚類關(guān)系樹(shù)(屬水平)Fig.4 The tree of clustering for all samples at genus level注: 下角的圖例為距離標(biāo)尺, 分支距離越長(zhǎng), 差異關(guān)系越遠(yuǎn)。東極島(DJ), 枸杞島(GQ), 金塘島(JT), 六橫島(LH), 沈家門(SJM), 桃花島(TH), 朱家尖(ZJJ)

RDA用于探究的AAPB豐度和環(huán)境變量之間的關(guān)系。不難發(fā)現(xiàn), 溶解氧(DO)和 pH對(duì)于除Roseobacter和Escherichia之外的AAPB各屬細(xì)菌均呈正相關(guān)性關(guān)系, 而其它的環(huán)境變量如 COD、總磷(TP)、溫度(T)、無(wú)機(jī)氮(DIN)和鹽度(salinity)對(duì)Roseobacter和Escherichia呈正相關(guān)性關(guān)系。溶解氧(DO)、總磷(TP)和 pH射線較長(zhǎng), 說(shuō)明這三種因素對(duì)相應(yīng)的AAPB影響較大, 相關(guān)性比較明顯(圖6)。

3 討論與結(jié)論

本研究的目的是確定在舟山群島海域不同海洋功能區(qū)表層海水之間 AAPB群落組成的異同并進(jìn)一步探究AAPB與環(huán)境因子之間的關(guān)系。我們推測(cè)舟山群島 AAPB的組成類型將有可能既表現(xiàn)出特有性又具有世界大同主義的細(xì)菌群落的格局。

圖5 AAPB屬水平的Heatmap圖Fig.5 The Heatmap of AAPB in the sampling stations at genus level注: 每小格代表其所在樣品中某個(gè)物種的相對(duì)豐度, 顏色對(duì)應(yīng)的是最上面的色階, 不同顏色代表物種所占比例, 從綠到紅, 代表該樣本橫坐標(biāo)的豐度越高。東極島(DJ), 枸杞島(GQ), 金塘島(JT), 六橫島(LH), 沈家門(SJM), 桃花島(TH), 朱家尖(ZJJ)

圖6 AAPB與環(huán)境參數(shù)之間關(guān)系的RDA分析Fig.6 Ordination plot of redundancy analysis (RDA) for AAPBs with hydrochemical data (environmental variables)注: 溫度(T), 溶解氧(DO), 鹽度(salinity), 化學(xué)需氧量(COD)無(wú)機(jī)氮(DIN)總磷(TP)。東極島(DJ), 枸杞島(GQ), 金塘島(JT), 六橫島(LH),沈家門(SJM), 桃花島(TH), 朱家尖(ZJJ)

所有的測(cè)序結(jié)果按照 97%的相似值, 一共歸為4051個(gè) OTU中, 每個(gè)采樣站點(diǎn)的 OTU數(shù)不等, 為490—1526個(gè)。其中, 有28個(gè)OTU是所有站點(diǎn)共有的, 并且所含序列數(shù)占總測(cè)序條數(shù)的70%?；贠TU聚類分析的結(jié)果, 我們計(jì)算了每個(gè)樣品的α多樣性指數(shù)(表 2)。 7個(gè)站點(diǎn)獨(dú)有的 OTU數(shù)目分別是 DJ 10個(gè)、GQ 14個(gè)、JT 14個(gè)、LH 17個(gè)、SJM 33個(gè)、TH 24個(gè)、ZJJ 28個(gè)。Chao 1和ACE指數(shù)通常用來(lái)計(jì)算豐富度情況, 而Shannon和Simpson指數(shù), 被用來(lái)估計(jì)多樣性。結(jié)果表明, 多樣性是排名為: SJM ＞ LH ＞JT ＞ TH ＞ ZJJ ＞ DJ ＞ GQ, 而豐富度排名為: SJM ＞ZJJ ＞ TH ＞ JT ＞ LH ＞ GQ ＞ DJ。在各種樣品中 OTU的變化中也觀察到類似的趨勢(shì)。稀釋性曲線很好地展示了各樣品測(cè)序的情況, 此外結(jié)合Alpha多樣性指數(shù),可以得出結(jié)論: SJM微生物豐富度和多樣性都是最高的, LH、JT和TH也都比較高, 而DJ和GQ微生物豐富度和多樣性最低(圖2)。

與以往的研究相比(Zhang et al, 2007; Yutin et al,2009; Zeng et al, 2016; Zhang et al, 2016),α-Proteobacteria, γ-Proteobacteria 為優(yōu)勢(shì)類群, 而我們的樣本中細(xì)菌群落是由 α-Proteobacteria,γ-Proteobacteria, β-Proteobacteria, δ-Proteobacteria,Bacilli和 Planctomycetia 為主(圖 4)。α-Proteobacteria已經(jīng)被廣泛研究(Alexandre et al, 2008), 它們?cè)诔喑钡臅r(shí)候有明顯的增殖活動(dòng), 在沿岸和大洋環(huán)境中為主流群體(Gl?ckner et al, 1999; Pinhassi et al, 2000;Eilers et al, 2001; Alonso-Sáez et al, 2007)。近年來(lái), 赤潮在DJ和GQ發(fā)生的頻率比以往更高, 可能與它們相對(duì)豐度降低有關(guān), 特別是當(dāng)與γ-Proteobacteria相比較的時(shí)候(Teira et al, 2007)。另一方面, 曾經(jīng)有幾個(gè)α-Proteobacteria豐度增大的情況, 例如 Roseobacterlike細(xì)菌豐度隨著正烷烴的增加而增大(McKew et al,2007)。雖然一些報(bào)告已經(jīng)描述過(guò)從烴污染海洋環(huán)境中分離 α-Proteobacteria的分類, 但還是難以確認(rèn)這些微生物是否能夠降解或利用烴。一項(xiàng)對(duì)印度尼西亞海水中烴類降解菌的研究顯示, 屬于Sphingomonadales和 Rhodobacterales的不同的海洋α-Proteobacteria屬的細(xì)菌參與了脂肪族和低分子量芳烴的降解過(guò)程(Harwati et al, 2007)。值得注意的是, 在波羅的海北部夏季分層條件下, 當(dāng)細(xì)菌的生長(zhǎng)受養(yǎng)分可利用性的限制時(shí), Sphingomonas屬種類占浮游細(xì)菌的主導(dǎo)地位(Pinhassi et al, 2000)。巧合的是這兩種類型的細(xì)菌在各采樣位點(diǎn)均被發(fā)現(xiàn)并鑒定出, 而最高是 LH, 其原因可能是因?yàn)樗挥谂c許多有機(jī)污染物的污水區(qū)域。

一些結(jié)果表明, 屬于Rhodobacteraceae的AAPB在沿岸海域具有非常重要的影響。類似的結(jié)果, 在貧營(yíng)養(yǎng)的西太平洋(Zheng et al, 2015)和極地沿海地區(qū)(Zeng et al, 2016)也有發(fā)現(xiàn), 這表明AAPB更喜歡高透光的表層海水。屬于 Rhodobacteraceae科的Loktanella和Roseobacter兩個(gè)屬的 AAPB在所有的采樣站點(diǎn)中都處于優(yōu)勢(shì)地位, 而在細(xì)菌屬的分類水平上, ZJJ和JT比其它樣本具有更高的多樣性(圖3)。Roseobacter進(jìn)化枝在海水中的廣泛分布已經(jīng)通過(guò)多種分子技術(shù)得到證實(shí)(Schmidt et al, 1991; González et al, 1997; Lanoil et al, 2000), 這些生物體是海洋浮游細(xì)菌的一個(gè)重要組成部分(Giovannoni, 2000)。目前,仍然缺乏足夠的知識(shí)去了解這一群體在海洋環(huán)境中的作用和功能。因此, 需要全面的研究以提高我們對(duì)α-Proteobacteria在海洋環(huán)境中的烴降解生態(tài)位的理解。

在JT和SJM也被發(fā)現(xiàn)了β-Proteobacterial群體(約占 3%), 然而很少有在除了淡水環(huán)境和河口以外其它環(huán)境中發(fā)現(xiàn) β-Proteobacterial-like AAPB序列的報(bào)道(Ritchie et al, 2012)。Bouvier等(2002)在兩個(gè)河口發(fā)現(xiàn)了沿著鹽度梯度變化的細(xì)菌群落組成, 發(fā)現(xiàn)鹽度是β-Proteobacteria額外的控制因素。而伽瑪變形菌的成員被認(rèn)為是海洋表層水中的重要的代表細(xì)菌,這也就意味著它們能夠快速生長(zhǎng)并能迅速降解海洋中更容易被降解的有機(jī)成分(Pinhassi et al, 2003;Poretsky et al, 2005)。與以往的研究一致, 它們?cè)诖笪餮蟆⒉_的海和北太平洋(Hu et al, 2006; Masín et al,2006; Boeuf et al, 2013)中占主導(dǎo)地位。在高緯度(＞60°N, ＞60°S)和極地水域缺乏伽馬變形細(xì)菌的情況相對(duì)于全球性的分布趨勢(shì)是一個(gè)例外, 表明其成員無(wú)法在冰冷的海水環(huán)境中發(fā)展壯大(Koh et al, 2011;Boeuf et al, 2013)。依賴培養(yǎng)的和非培養(yǎng)的研究表明,AAPB多樣性體現(xiàn)在擁有許多α-, β-和γ-Proteobacteria的成員(Jeanthon et al, 2011)。然而δ-Proteobacteria綱的Desulfocapsa屬在ZJJ的發(fā)現(xiàn), 實(shí)屬罕見(jiàn)。在先前的研究報(bào)道中, 在石油污染潮下帶沉積物中曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)過(guò)它的存在(Acosta-González et al, 2013)。在AAPB的相關(guān)研究中, 至今幾乎很少有涉及到δ-Proteobacteria綱細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)。究其原因, 這可能與環(huán)境有關(guān), ZJJ屬于捕撈區(qū), 基于Azam等(1994, 2007)提出了海洋微食物環(huán)的概念, 捕撈區(qū)必定具有高豐度的浮游生物, 從而相應(yīng)地微生物種類和豐度也會(huì)更多。

基于非培養(yǎng)的分子技術(shù), 如熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH), 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性圖譜技術(shù)(Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP)和 puf操縱子大量的插入克隆分析, 拓展了我們對(duì)AAPB多樣性和豐度的認(rèn)識(shí)(Grüntzig et al, 2002; Cottrell et al,2006)。與傳統(tǒng)的基于分離培養(yǎng)的數(shù)據(jù)相比, 在不同類型的功能區(qū), AAPB 含有 α-, β-, δ-和 γ類的變形菌, 并支持 AAPB多樣性遠(yuǎn)不止兩個(gè)容易被培養(yǎng)的Erythrobacter和Roseobacter屬這一觀點(diǎn)。盡管已經(jīng)有許多關(guān)于 AAPB在不同的地理位置和營(yíng)養(yǎng)條件下的群落結(jié)構(gòu)的研究(Zeng et al, 2009; Lehours et al,2010), 但尚未發(fā)現(xiàn)有沿著各種類型海洋功能區(qū)的AAPB分布的研究。我們探索了AAPB在不同功能區(qū)域表層海水的分布, 利用基于 pufM基因的高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)。共得到 32個(gè)明確分類的屬和 7個(gè)屬于Proteobacteria綱未分類的屬(圖3), 而大多數(shù)OTU屬于未明確分類的AAPB的分支。這些屬分別被劃分為16科、15目、6綱和3門。在結(jié)果中, 豐度和多樣性相對(duì)較高的是變形桿菌, 其中也包含了大多數(shù)綱、目和科, 其次是厚壁菌門和浮霉菌門(表3)。尤其是屬于δ-Proteobacteria的 pufM 基因的發(fā)現(xiàn), 使我們確信AAPB多樣性的復(fù)雜程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出目前所了解的情況。

溫度是促進(jìn) AAPB生長(zhǎng)的一個(gè)重要環(huán)境因素(Masín et al, 2006; Ferrera et al, 2014; Koblí?ek, 2015;Lew et al, 2015)。巴倫支海的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)強(qiáng)烈的線性相關(guān)性, 在溫度最高時(shí) AAPB的豐富度和多樣性最高(Lehours et al, 2015)。然而, 在極度貧營(yíng)養(yǎng)的寒冷的高山湖泊, 電導(dǎo)率、pH值、硝酸鹽含量是影響AAPB群落結(jié)構(gòu)分布和生長(zhǎng)的主要因素(Koblí?ek, 2015)。在我們的研究中, Roseobacter屬在LH的豐度最高, 這可能表明溫度是某些Roseobacter屬細(xì)菌生長(zhǎng)的至關(guān)重要條件。AAPB的豐度與pH值在我們研究的范圍內(nèi)呈正相關(guān), pH值顯著影響阿加西斯泥炭地冰川湖細(xì)菌群落的組成和紐約阿迪朗達(dá)克公園物種多樣性和豐富度(Frischer et al, 2008, Lin et al, 2012)。AAPB的豐度也可能直接或間接地受到其它因素(如水化學(xué)性質(zhì)和pH值)的影響。水的pH值也可能會(huì)顯著改變?cè)锖椭彩承愿∮蝿?dòng)物的組成。已有研究證明,AAPB經(jīng)常處在激烈的被捕食的壓力下, 植食性浮游動(dòng)物群落的改變可能也會(huì)嚴(yán)重影響 AAPB的數(shù)量(Ferrera et al, 2011)。另一個(gè)關(guān)鍵的環(huán)境因素是鹽度,它對(duì)海洋微生物的生長(zhǎng)也有至關(guān)重要的影響。據(jù)報(bào)道,在特拉華河口和北冰洋西部的 AAPB受到環(huán)境鹽度變化影響(Waidner et al, 2008; Boeuf et al, 2013), 但這種影響關(guān)系在本研究中未發(fā)現(xiàn)。雖然鹽度變化很大(表 1), 在這些變化下的背后可能生存著許多具有相應(yīng)生理耐受性的AAPB種群?？赡艿脑蚴? 不同鹽度的水域之間, 光線充足時(shí), 光合異養(yǎng)可能在溫暖、高鹽度的水和寒冷、低鹽度的水中具有不同的生理作用。除了溫度以外, 不同的鹽度也導(dǎo)致 ZJJ的 pufM多樣性高于JT和LH。

Zohary和Robarts得出結(jié)論認(rèn)為, 冬季在地中海東部, 磷是細(xì)菌和浮游植物大面積生長(zhǎng)的最主要的限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(Zohary et al, 1998)。同樣, 在夏天的地中海西北面水域, 磷的限制性作用也很常見(jiàn)(Zweifel et al, 1993, Sala et al, 2002)。此外, AAPB是一類快速生長(zhǎng)代謝活躍的生物, 它們極大地促進(jìn)了溶解氧的補(bǔ)充。我們可以得出結(jié)論認(rèn)為, DO是影響許多細(xì)菌屬分布的一個(gè)重要因素(圖 6)。另外, 從采樣站點(diǎn)pufM基因的OTU分類結(jié)果表明, AAPB特有分支與特定環(huán)境條件有關(guān)。這些結(jié)果表明觀察到的AAPB豐度的變化往往也會(huì)伴隨著種群的遺傳多樣性變化(圖 5)。從屬的分布情況來(lái)看, Isosphaera、Maritimibacter、Desulfocapsa、Thiorhodococcus、Klebsiella和 Amphritea這幾個(gè)屬只在朱家尖(ZJJ)被發(fā)現(xiàn), Ahrensia、Blastomonas和 Methyloversatilis僅屬于金塘島(JT), Sulfitobacter和 Elioraea只在六橫島(LH)存在, 而Novosphingobium也僅在桃花島被發(fā)現(xiàn)(TH), Limnohabitans和 Rubrivivax只存在于沈家門(SJM)(表4)。它們的生理適應(yīng)和代謝靈活的本性表明了光能異養(yǎng)為其提供了選擇性的優(yōu)勢(shì)。所有的物理和化學(xué)因素都可能在構(gòu)建 AAPB種群結(jié)構(gòu)時(shí)起到單獨(dú)或協(xié)同作用。數(shù)據(jù)表明, 不同的AAPB群體被各種復(fù)雜的環(huán)境因素所控制, 這或許可以解釋為什么目前很難準(zhǔn)確預(yù)測(cè)水生環(huán)境總AAPB分布的問(wèn)題。

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