萬(wàn) 江 張海燕 劉義紅 李新濤 涂勝英 吳麗敏

髓母細(xì)胞瘤(MB)是一種好發(fā)于兒童的顱內(nèi)惡性腫瘤，占兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的 10%～20%，發(fā)病高峰在7歲左右，病情進(jìn)展迅速，治療棘手[1,2]。常采用外科手術(shù)切除后輔助放化療，療效不理想[3,4]。MB的病因及發(fā)病機(jī)制迄今尚不明了，可能與多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常有關(guān)，其中Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的重要途徑，腫瘤中普遍存在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵效應(yīng)物β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的異常激活[5,6]。本研究通過(guò)構(gòu)建靶向干擾β-catenin基因的shRNA的慢病毒載體，感染兒童MB細(xì)胞株DOAY，建立穩(wěn)定抑制β-catenin基因表達(dá)的細(xì)胞株，觀察β-catenin對(duì)其增殖、凋亡、侵襲和遷移等的影響。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 慢病毒載體包裝系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)System Biosciences公司，其中pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP質(zhì)粒包含綠色熒光蛋白(GFP)基因，pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G質(zhì)粒包含病毒包裝所需元件；DAOY購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DNA凝膠回收試劑盒、BamH I和EcoR I內(nèi)切酶、DNA連接試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；Opti-DMEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000脂質(zhì)體和TRIzol總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司；兔抗人β-catenin一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗和ECL顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Annexin V/PI雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Bender公司。

1.2 靶向β-catenin的shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與包裝

1.2.1 shRNA寡核苷酸鏈的設(shè)計(jì)合成 參照文獻(xiàn)[7]、根據(jù)β-catenin miRNA序列(NM-BC053065.1)設(shè)計(jì)shRNA 1、2、3和陰性對(duì)照(NC)，每條核苷酸鏈的中間添加莖環(huán)結(jié)構(gòu)TTCAAGAGA，正、反義鏈的5'端分別引入GATCC和AATTC，分別與BamH I和EcoR I酶切后的粘性末端互補(bǔ)，序列見(jiàn)表1，經(jīng)Blast比對(duì)與人類(lèi)其他基因編碼序列無(wú)同源性，委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

表1 靶向β-catenin的shRNA寡核苷酸鏈序列

1.2.2 pCDH-shRNA慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建 用BamH I和EcoR I對(duì)pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切， 將shRNA寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA并與雙酶切后的質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌，在氨芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆后委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 Lentivirus-shRNA慢病毒包裝和滴度測(cè)定 293T細(xì)胞用RM1640 [含10﹪胎牛血清(FBS)、100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素]培養(yǎng)，接種于6孔板。通過(guò)Lipofectamine 2000介導(dǎo)慢病毒載體包裝系統(tǒng)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后收集含有慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，經(jīng)0.45 μm的過(guò)濾器過(guò)濾后獲得慢病毒純化液，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定病毒滴度。

1.3 靶向β-catenin的shRNA慢病毒的篩選 ①DOAY細(xì)胞株用RM1640(含10﹪FBS、100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞生長(zhǎng)至85%融合時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板。②共分為5組(每組6孔)，Lentivirus(LV)-shRNA 1、2、3和NC組分別用包裝好的Lentivirus-shRNA 1、2、3和NC感染細(xì)胞，每孔加入100 μL病毒液，同時(shí)設(shè)置未用病毒感染的空白對(duì)照組(Blank)。6 h后更換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。③感染72 h后，在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)情況，首先在白光視野下計(jì)數(shù)細(xì)胞的總數(shù)目，再在熒光視野下計(jì)數(shù)表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)目，轉(zhuǎn)染效率=(熒光表達(dá)細(xì)胞數(shù)目/白光視野細(xì)胞總數(shù))×100%，取10個(gè)視野，計(jì)算其平均值。④感染后培養(yǎng)96 h，收集各組細(xì)胞。 ⑤RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中β-catenin mRNA表達(dá)：細(xì)胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，A260/A280比值1.8～2.0提示樣品RNA滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物系由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)和合成。β-catenin引物F：5’-GTGCTGAAGGTG-CTATCTGTCTGC-3’，

R：5’-TGAACAAGACGTTGACTTGGATCTG-3’；GAPDH引物F：5’-CATGAGAAGTAT-GACAACAGCCT-3’，R：5’-AGTCCTTCC-ACGATACCAAAGT-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad分析系統(tǒng)掃描分析，目的基因相對(duì)表達(dá)量=目的基因光密度值/GAPDH光密度值。⑥Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)：提取細(xì)胞總蛋白并用BCA法測(cè)定濃度，以80 μg總蛋白上樣，采用10%的SDS-PAGE膠、PVDF膜，β-catenin兔抗人一抗工作液(1∶100)4 ℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液(1∶100)37 ℃孵育1 h，ECL顯色，用Bio-Rad分析系統(tǒng)掃描分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白光密度值/GAPDH光密度值。

1.4 穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選 ①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DOAY細(xì)胞接種于6孔板，加入不同濃度(1、2、3、4和5 μg·mL-1)的嘌呤霉素，選擇在10～14 d內(nèi)讓全部細(xì)胞死亡的最低濃度為最佳篩選濃度。②用1.3篩選實(shí)驗(yàn)中對(duì)β-catenin抑制效果最佳的LV-shRNA感染DOAY細(xì)胞，之后將細(xì)胞接種于6孔板，孵育24 h后加入嘌呤霉素，使之達(dá)到①中最佳篩選濃度。每隔2 d更換新的含嘌呤霉素(最佳篩選濃度)的培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)10 d。收集抗性細(xì)胞，獲得穩(wěn)定抑制β-catenin表達(dá)的DOAY細(xì)胞株。以相同方法用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染LV-NC的DOAY細(xì)胞株。

1.5 干擾β-catenin對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響 分3組，LV-shRNA 組：1.4中篩選得到的穩(wěn)定抑制β-catenin表達(dá)的DOAY細(xì)胞株；LV-NC組：1.4中篩選得到的穩(wěn)定感染Lentivirus-NC的DOAY細(xì)胞株；Blank組：未感染病毒的DOAY細(xì)胞株。

1.5.1 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將細(xì)胞接種于96孔板，于接種后24、48、72、96、120 h每孔加20 μL 的MTT溶液(5 mg·μL-1)。繼續(xù)孵育4 h后，去掉原培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫振搖15 min，酶標(biāo)儀測(cè)定各組OD(570)值并繪制曲線。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于6孔板，孵育48 h后收集，按Annexin V/PI雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 使用無(wú)血清的RM1640培養(yǎng)液將細(xì)胞接種于自帶基質(zhì)膠的Transwell小室上室，下室加入RM1640+10%FBS。孵育48 h后，擦去靠近基底膜內(nèi)室的細(xì)胞，另一面細(xì)胞經(jīng)10%甲醇固定，PBS洗滌，結(jié)晶紫染色，PBS洗滌，顯微鏡下觀察細(xì)胞并記數(shù)。

1.5.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞接種于6孔板，生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，于6孔板底部沿直線劃痕，并更換為無(wú)血清的RM1640培養(yǎng)液。孵育48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，Gimesa染色，觀察細(xì)胞遷移情況。細(xì)胞相對(duì)遷移能力=0 h劃痕距離-48 h劃痕距離。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染和穩(wěn)定細(xì)胞株篩選 圖1顯示，感染72 h后，Blank組細(xì)胞未見(jiàn)GFP表達(dá)，LV-shRNA 1、 2、3和NC 組細(xì)胞感染效率分別為(91.2±3.1)%、(93.2±2.9)%、(90.6±3.2)%和(89.9±2.1)%，經(jīng)方差分析各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2A中RT-PCR檢測(cè)顯示，各LV-shRNA組β-catenin mRNA表達(dá)均低于LV-NC組(0.95±0.21)和Blank組(0.89±0.23)，LV-shRNA 1組(0.24±0.09)低于LV-shRNA 2組(0.47±0.15)和LV-shRNA 3 組(0.53±0.13)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；圖2B Western Blot顯示，各LV-shRNA組β-catenin蛋白表達(dá)均低于LV-NC組(0.89±0.19)和Blank組(0.81±0.20)，LV-shRNA 1組(0.15±0.07)低于LV-shRNA 2組(0.38±0.14)和LV-shRNA 3組(0.41±0.14)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 熒光顯微鏡觀察各組DOAY細(xì)胞綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況

圖2各組DOAY細(xì)胞中β-catenin的mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)情況，LV-shRNA1對(duì)DOAY細(xì)胞增殖的影響(C)

注 M：Marker，1、2、3、NC和B分別為L(zhǎng)V-shRNA 1、2、3、NC組和Blank組

綜合病毒感染效率和LV-shRNA干擾效率，LV-shRNA 1對(duì)β-catenin抑制效果最好，以4 μg·mL-1嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)LV-shRNA 1的DOAY細(xì)胞株。

2.2 LV-shRNA 1對(duì)DOAY細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響 ①增殖：MTT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖2C)顯示，LV-shRNA 1組第12、24、36、48、72 h時(shí)OD(570)值低于LV-NC組和Blank組(P<0.05)。②凋亡：雙變量流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖(圖3)顯示，LV-shRNA 1組細(xì)胞總凋亡率[(31.3±4.2)%]高于LV-NC組[(13.3±3.3)%]和Blank組[(17.4±3.1)%]，P<0.05。③侵襲：Transwell實(shí)驗(yàn)(圖4)顯示，LV-shRNA 1組穿膜細(xì)胞數(shù)目(23.4±8.3)少于LV-NC組(69.8±14.7)和Blank組(74.2±16.7)，P<0.05。④遷移：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(圖5)顯示，LV-shRNA 1組細(xì)胞遷移距離[(314.6±47.1)μm]小于LV-NC組 [(689.4±73.6)μm]和Blank組[(701.5±79.0)μm]，P<0.05。

圖3AnnexinV/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DOAY細(xì)胞凋亡情況

注 Q1：中晚期凋亡細(xì)胞；Q2：壞死細(xì)胞；Q3：存活細(xì)胞；Q4：早期凋亡細(xì)胞

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DOAY細(xì)胞的侵襲能力(×100)

圖5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DOAY細(xì)胞的遷移能力

3 討論

研究顯示，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控細(xì)胞增殖和分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[8]。此外，還參與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、分化和成熟，對(duì)原始神經(jīng)干細(xì)胞的分化和成熟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要[9]。β-catenin是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵效應(yīng)因子，β-catenin的異常激活可使神經(jīng)干細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞分化，從而參與MB的發(fā)生和發(fā)展[10]。當(dāng)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失活時(shí)，胞漿中的β-catenin主要與細(xì)胞膜上的E-鈣黏蛋白結(jié)合，部分與胞漿中的 APC蛋白、Axin蛋白、糖原合成酶激酶-3 (GSK-3β)和酪蛋白激酶-1(CK-1)相互作用，形成β-catenin降解復(fù)合體。磷酸化的β-catenin降解復(fù)合體泛素化，經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)降解，從而使細(xì)胞內(nèi)β-catenin含量維持在正常水平[11，12]。當(dāng)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活時(shí)，

β-catenin降解復(fù)合體解散，磷酸化與泛素化過(guò)程受阻，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin不斷蓄積，并通過(guò)核孔轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞核，作為轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)子(TCF/LEFs) 等轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，從而激活細(xì)胞周期蛋白-1(Cyclin D-1)和C-myc等癌基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[11,12]。馬俊艷等[13]證實(shí)，β-catenin在人腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)隨腫瘤分級(jí)的增加而增加，推測(cè)其可能與腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度有關(guān)。另有研究[14]發(fā)現(xiàn)， β-catenin 在MB組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常組織(66.7%vs10.0%，P<0.05)，推測(cè)其可能參與MB的發(fā)生和發(fā)展。因而，深入探索β-catenin與MB的關(guān)系，從分子生物學(xué)水平尋求特異性治療靶點(diǎn)，將為MB的防治提供新的思路。

RNA干擾技術(shù)(RNAi)是近年來(lái)廣泛用于調(diào)控生物基因表達(dá)與功能的技術(shù)，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄或體內(nèi)表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)誘導(dǎo)序列特異的目的基因沉默，該技術(shù)目前已成為研究基因功能和實(shí)現(xiàn)基因治療的熱點(diǎn)。如何將siRNA完整地送入靶細(xì)胞是目前制約RNAi技術(shù)廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。目前常用的載體主要有質(zhì)粒和病毒，不同的表達(dá)載體在合成過(guò)程、轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染效果方面各有優(yōu)缺點(diǎn)。質(zhì)粒載體的制備較簡(jiǎn)單，但是導(dǎo)入效率低，且無(wú)法長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。病毒載體主要有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒等，其中慢病毒載體既能轉(zhuǎn)染分裂期細(xì)胞又能轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞，能夠?qū)iRNA整合至靶細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)，而且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、免疫反應(yīng)小[15]。在本次實(shí)驗(yàn)中我們構(gòu)建了小發(fā)卡RNA(shRNA)，以克服siRNA半衰期短和無(wú)法持久表達(dá)等缺點(diǎn)，進(jìn)一步加工成shRNA的慢病毒載體，從而將shRNA高效導(dǎo)入細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)。在shRNA慢病毒載體加工的過(guò)程中，對(duì)于靶基因位點(diǎn)的選擇十分關(guān)鍵，因此對(duì)shRNA編碼序列的選擇尤為重要。應(yīng)盡量避免5'和3'非編碼區(qū)和起始密碼子區(qū)等調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域，在本研究中我們選擇了編碼區(qū)起始密碼子下游433、769、1 181和2 348共4個(gè)位點(diǎn)作為干擾靶點(diǎn)，有效避免了某一位點(diǎn)不能干擾β-catenin表達(dá)的情況，同時(shí)還設(shè)置了陰性對(duì)照序列，從而排除了轉(zhuǎn)染序列本身對(duì)β-catenin表達(dá)的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， LV-shRNA 1對(duì)β-catenin抑制效果最好，通過(guò)嘌呤霉素篩選，獲得了穩(wěn)定抑制β-catenin表達(dá)的DOAY細(xì)胞株。細(xì)胞接觸生長(zhǎng)抑制性喪失是惡性腫瘤的重要特點(diǎn)，本研究觀察了抑制β-catenin表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LV-shRNA 1組第12、24、36、48、72 h時(shí)的OD值減小，細(xì)胞總凋亡率升高，說(shuō)明抑制β-catenin表達(dá)能夠顯著抑制DOAY細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。MB腫瘤細(xì)胞有沿腦脊液產(chǎn)生播散性種植的傾向，本研究進(jìn)一步觀察了抑制β-catenin表達(dá)對(duì)DOAY細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LV-shRNA 1組穿膜細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞遷移距離縮短，說(shuō)明抑制β-catenin表達(dá)減弱了腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力。其原因可能為：抑制β-catenin表達(dá)，一方面阻礙Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游Cyclin D1和C-myc等癌基因的表達(dá)；另一方面增加了腫瘤細(xì)胞間的黏附作用，使癌細(xì)胞浸潤(rùn)性和分散性生長(zhǎng)受阻。

綜上所述，穩(wěn)定抑制β-catenin表達(dá)可抑制DOAY細(xì)胞的增殖，降低其侵襲和遷移能力，促進(jìn)其凋亡，β-catenin有潛力成為治療MB的新靶點(diǎn)。

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