表皮干細胞的特點及應(yīng)用于皮膚軟組織創(chuàng)面修復(fù)的實驗研究進展*

尹詩璐 綜述 秦澤蓮 審校

(北京大學(xué)第三醫(yī)院成形外科，北京 100191)

意外傷害造成的復(fù)雜大面積創(chuàng)面以及各種疾病導(dǎo)致的慢性難愈性創(chuàng)面往往難以修復(fù)。自體皮片或皮瓣移植是目前整形外科常用的修復(fù)方法，然而供皮區(qū)所形成的新的創(chuàng)面往往帶來一定的功能及形態(tài)損傷。隨著微創(chuàng)外科理念的廣泛深入，如何通過最小的創(chuàng)傷達到最佳修復(fù)效果成為各外科專業(yè)的研究重點及難點。表皮干細胞研究為大面積皮膚創(chuàng)面的微創(chuàng)修復(fù)提供了新的啟示。提取自皮膚組織的特異性干細胞，具有自我增殖及分化形成多種皮膚細胞成分的能力，在皮膚軟組織創(chuàng)面愈合及再生中發(fā)揮重要作用[1,2]。本文對表皮干細胞的特點及其在皮膚軟組織創(chuàng)面修復(fù)中的實驗研究進展進行綜述。

1 表皮干細胞的特點

1.1 表皮干細胞的形態(tài)及分布

表皮干細胞來源于外胚層，形態(tài)呈鵝卵石形，胞體透亮且排列緊密，主要分布于皮膚基底層及毛囊隆突部位，并且隨個體年齡和部位不同而有所差異。作為慢周期細胞，表皮干細胞的增殖分化受到壁龕(niche)及細胞內(nèi)信號通路的影響。壁龕是表皮干細胞賴以生存的外部微環(huán)境，主要有三種，分別位于表皮細胞基底層、毛囊隆突部位及皮脂腺基底部[3]。不同的壁龕對表皮干細胞的生理狀態(tài)、信號傳導(dǎo)及分化方向產(chǎn)生不同的影響[1,4,5]。2012年，Dahl[6]的研究顯示，表皮基底層、皮脂腺和毛囊隆突區(qū)域分布有豐富的表皮干細胞，這些細胞可分化成不同的皮膚細胞，替換死亡的表皮、皮脂腺和毛囊細胞，從而維持皮膚的自我更新及穩(wěn)態(tài)。

1.2 表皮干細胞的篩選及鑒定

在過去的10余年中，表皮干細胞的篩選及鑒定方法得到不斷改善。Ⅳ型膠原快速黏附法是目前常用的篩選表皮干細胞的簡單方法，表皮干細胞表面高表達β1整合素，而有絲分裂后細胞及終末分化細胞不表達β1整合素，利用這一特性將細胞置于預(yù)鋪Ⅳ型膠原的培養(yǎng)皿中，表皮干細胞依靠其β1整合素能較為快速地與Ⅳ型膠原進行黏附而與其他細胞成分區(qū)分開[7,8]。流式細胞分選法則利用表皮干細胞高表達α6整合素而不表達CD71的特性，通過設(shè)立特定的門控通道而高效分選出α6整合素+CD71-的表皮干細胞[9]。此外，通過免疫熒光、免疫組化、基因表達檢測等方式，檢測整合素α6、P63、K19等的表達也是較為常用的表皮干細胞篩選鑒定方式[7]。除了以上常見的表面標(biāo)志物，也有文獻報道應(yīng)用delta樣蛋白1(delta-like protein 1，DLL1)、富含亮氨酸的重復(fù)序列和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains protein 1，LRIG1)、CD46作為標(biāo)志物進行表皮干細胞的篩選[2,7,10]。

1.3 表皮干細胞的分化及增殖特點

表皮干細胞不斷通過自我分裂及分化維持皮膚的穩(wěn)態(tài)。2001年，Dunnwald等[11]應(yīng)用Hoechest和碘化丙啶熒光染色方法，通過設(shè)定特定的門控，證實鼠表皮基底細胞存在干細胞[(3.4±0.2)%]、短暫擴增細胞[(89.2±1.1)%]和非增殖細胞[(7.4±0.9)%]3種不同分化狀態(tài)。在受到特定刺激信號后，表皮干細胞不均等分裂形成新的表皮干細胞及若干短暫擴充細胞，短暫擴充細胞再通過有限的細胞分裂形成終末細胞。由于這3種細胞增殖能力不同，在體外培養(yǎng)時分布形成3種不同的細胞克隆[1]：①全克隆(holoclone)，克隆細胞集群大而圓，其內(nèi)細胞成分主要是小而形態(tài)規(guī)則的干細胞，具有很強的自我增殖能力，高表達β1整合素、K14、P63等細胞標(biāo)記，可不均等分裂成干細胞及短暫擴增細胞。②部分克隆(meroclone)，主要由短暫擴增細胞形成，細胞大小不等，自我增殖及分化能力存在差異，由于在向低分化細胞分化的過程中逐漸脫離了干細胞壁龕環(huán)境，這一細胞P63的表達水平明顯低于干細胞。③次全克隆(paraclone)，克隆面積小且形態(tài)不規(guī)則，其內(nèi)幾乎均為終末分化細胞，細胞大而扁平，且高表達終末分化細胞標(biāo)記物內(nèi)皮蛋白(involucrin)，通常僅能維持較短的復(fù)制周期，便逐漸喪失增殖能力。

2 表皮干細胞修復(fù)皮膚軟組織創(chuàng)傷的實驗研究

表皮干細胞是皮膚及其附屬器發(fā)生、修復(fù)、重建的基礎(chǔ)，在保持皮膚正常結(jié)構(gòu)、維持表皮的自我更新和穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。1984年首次出現(xiàn)應(yīng)用體外培養(yǎng)的表皮干細胞治療大面積皮膚燒傷的案例報道[12]，2例全身燒傷95%以上的患兒(Ⅲ度燒傷面積分別為83%和89%)，應(yīng)用體外培養(yǎng)的表皮干細胞成功覆蓋50%以上燒傷創(chuàng)面，同時挽救了生命。

2.1 表皮干細胞促進急、慢性創(chuàng)面的愈合

創(chuàng)傷可刺激表皮干細胞增殖分化，形成新的子細胞填充皮膚組織缺損[13,14]。在基底層完整的情況下，基底層表皮干細胞逐漸自下而上脫離壁龕，通過自我增殖分化進行創(chuàng)面修復(fù)。若基底層同時受到破壞，則主要依靠傷口邊緣附屬器內(nèi)的表皮干細胞向傷口分化、增殖、遷移而進行修復(fù)功能[15]。β1整合素是表皮干細胞進行壁龕黏附的重要分子，在創(chuàng)傷早期表皮再生中發(fā)揮重要作用[1]。創(chuàng)傷后，表皮干細胞的β1整合素消失，使其失去黏附作用向創(chuàng)面移動，進行分裂啟動修復(fù)功能[16]。在移動過程中，新生成的短暫擴增細胞高表達磷酸化P63，保持增殖功能的同時繼續(xù)向表面移動，填補細胞空缺，促進創(chuàng)面愈合[13]。1999年，Pellegrini等[17]應(yīng)用富含表皮干細胞的自體角質(zhì)細胞移植治療7例20%～45%皮膚全層燒傷，其中6例在移植術(shù)后1個月創(chuàng)面表皮再生覆蓋達100%，1例覆蓋達80%。此外，Mascre等[18]的示蹤研究還顯示表皮干細胞對創(chuàng)傷組織的修復(fù)和再生起著重要作用，其能在創(chuàng)面基底迅速形成克隆向創(chuàng)面中心擴展，僅3.5天，60%干細胞已經(jīng)經(jīng)歷了一輪細胞分裂。同時證實表皮干細胞是創(chuàng)面中長期發(fā)揮作用的細胞，(3.8±0.1)細胞克隆/mm2在移植后35天密度仍可達(2.6±0.1)細胞克隆/mm2。

除了大面積燒傷和急性創(chuàng)傷，糖尿病潰瘍等慢性難愈性創(chuàng)面的修復(fù)也是目前表皮干細胞治療研究的熱點。隨著人口老齡化，肥胖人群增多，糖尿病的患病率逐年增長，糖尿病潰瘍的發(fā)生率也持續(xù)上升，這類創(chuàng)口往往難以自愈，可遷延數(shù)月甚至數(shù)年?，F(xiàn)有治療方法包括組織工程皮膚產(chǎn)品、局部應(yīng)用生長因子、電刺激、負壓吸引等，都難以達到滿意效果[13]。2016年，Yang等[19]用糖尿病潰瘍動物模型進行研究，觀察到表皮干細胞能夠通過Notch信號傳導(dǎo)通路促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合，這一通路中的Jag1能夠促進表皮干細胞向創(chuàng)面遷移，應(yīng)用Jag1轉(zhuǎn)染的表皮干細胞治療的鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面在15天時明顯小于未轉(zhuǎn)染的表皮干細胞治療的創(chuàng)面。

隨著體外細胞技術(shù)的發(fā)展，利用表皮干細胞自我增殖的特性，體外培養(yǎng)擴增獲得上皮皮片，移植于創(chuàng)面進行修復(fù)，從而彌補了自體皮片供區(qū)不足的缺點。經(jīng)過不斷的技術(shù)改進，自體擴增皮片已經(jīng)成為目前治療大面積燒傷皮損及慢性創(chuàng)面的可行手段[2]。2010年，Sood等[20]報道一項為期18年的臨床研究，對88例大面積燒傷創(chuàng)面患者進行自體擴增皮片移植，分別對其移植存活率、水皰發(fā)生率、創(chuàng)面攣縮發(fā)生率等并發(fā)癥進行3～90個月的隨訪，結(jié)果顯示應(yīng)用這一技術(shù)治療的大面積燒傷患者，總生存率達91%(80/88)，自體擴增皮片移植的成活率高達72.7%，有66%的患者(58/88)出現(xiàn)創(chuàng)面攣縮，其中32例行攣縮松解手術(shù)。

2.2 表皮干細胞與皮膚附屬器再生

表皮干細胞在傷口愈合中的作用不僅僅局限于再生形成分層的表皮，還與毛囊、汗腺等重要皮膚附屬器的再生密切相關(guān)。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路是汗腺發(fā)生和發(fā)育過程中的重要信號通路，抑制MAPK/ERK通路的磷酸化在表皮干細胞向汗腺細胞分化過程中十分重要[21]。在培養(yǎng)基中加入PD98059可阻斷ERK磷酸化，從而抑制MAPK/ERK通路，促使表皮干細胞退出干細胞群落，向汗腺細胞方向分化[22]。同時，創(chuàng)面底部的表皮干細胞在創(chuàng)傷刺激下能夠大量分裂增殖并向創(chuàng)面遷移，在增厚的瘢痕乳頭層部位形成毛囊樣結(jié)構(gòu)[23]。有研究表明，創(chuàng)面中心的表皮細胞具有更大的形態(tài)可塑性，能夠與創(chuàng)面下方的真皮共同作用，參與創(chuàng)面毛囊的再生[24]。2017年，王元元等[25]將體外培養(yǎng)的人表皮干細胞接種在組織工程真皮上，加入不同濃度的表皮生長因子(EGF)，進行三維培養(yǎng)和定向誘導(dǎo)分化，通過HE染色及CK19熒光染色，結(jié)果表明在15～20 ng/ml濃度的EGF誘導(dǎo)下，表皮干細胞能形成管腔樣結(jié)構(gòu)，該管腔樣結(jié)構(gòu)由單層細胞構(gòu)成的管壁和中央空腔組成，在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)上與在體汗腺分泌部的管狀結(jié)構(gòu)相似，且抗CKl8和抗-CEA免疫熒光染色均表達陽性，從而證實表皮干細胞參與創(chuàng)面皮膚附屬器的再生。

2.3 表皮干細胞與創(chuàng)面瘢痕調(diào)控

表皮干細胞對創(chuàng)面瘢痕的形成過程產(chǎn)生影響[26]。P63和ki-67的異常表達與瘢痕形成關(guān)系密切。Edriss等[27]對瘢痕形成時期的表皮干細胞進行染色，觀察到其核蛋白P63和ki-67的表達明顯增強，證實其在瘢痕形成過程中的活性增強。Wang等[28]的研究證實表皮干細胞能夠下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)，促進堿性成纖維生長因子(bFGF)的表達及細胞橋粒形成，與表皮干細胞共同培養(yǎng)的真皮細胞外基質(zhì)分布良好，未見膠原束形成，且膠原mRNA和蛋白表達水平下降至46%，從而減緩皮膚纖維化的進程及緩解瘢痕形成。

3 小結(jié)

表皮干細胞研究的擴大及深入，為創(chuàng)面修復(fù)研究提供了新的思路?，F(xiàn)有研究提示我們，具有自我增殖及多項分化能力的表皮干細胞在創(chuàng)面覆蓋、皮膚附屬器再生、瘢痕修復(fù)等方面有一定的研究基礎(chǔ)及誘人的應(yīng)用前景。然而目前關(guān)于表皮干細胞的臨床應(yīng)用研究仍然十分匱乏，大量的研究仍然停留在基礎(chǔ)層面而缺乏臨床證據(jù)支持。如何將基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，讓表皮干細胞在創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域真正發(fā)揮其作用，仍需更進一步的探索。