陳月娟+劉文簡(jiǎn)+陳丹娜+詹賢福+蔣林

[摘要] 應(yīng)用Cytb序列對(duì)燕窩進(jìn)行DNA條形碼（DNA barcodes）研究，為燕窩的溯源研究及全面評(píng)價(jià)燕窩質(zhì)量提供理論依據(jù)。以馬來(lái)西亞、印度尼西亞、越南、泰國(guó)等地的燕窩，共計(jì)39個(gè)樣本為研究對(duì)象，提取基因組DNA，擴(kuò)增Cytb序列并雙向測(cè)序。采用MEGA 7.0軟件，對(duì)39條樣本序列及36條從Gen Bank中下載5種金絲燕的Cytb序列進(jìn)行序列特征分析，基于Kimura雙參數(shù)法計(jì)算序列種內(nèi)、種間遺傳距離，構(gòu)建NJ和UPGMA系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明，39個(gè)樣本共來(lái)源于3個(gè)不同的金絲燕物種。Cytb序列種間變異顯著大于其種內(nèi)變異，可以準(zhǔn)確地區(qū)分不同種類(lèi)的燕窩。所構(gòu)建的NJ和UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，也能將全部物種區(qū)分開(kāi)。表明基于Cytb序列的DNA條形碼技術(shù)可用于準(zhǔn)確快速地鑒別燕窩的生物基原。

[關(guān)鍵詞] 燕窩； DNA條形碼； Cytb序列； 物種鑒定

[Abstract] To provide theoretical basis for the traceability and quality evaluation of edible bird′s nests （EBNs）， the Cytb sequence was applied to identify the origin of EBNs. A total of 39 experiment samples were collected from Malaysia， Indonesia， Vietnam and Thailand. Genomic DNA was extracted for the PCR reaction. The amplified products were sequenced. 36 sequences were downloaded from Gen Bank including edible nest swiftlet， black nest swiftlet， mascarene swiftlet， pacific swiftlet and germain′s swiftlet. MEGA 7.0 was used to analyze the distinction of sequences by the method of calculating the distances in intraspecific and interspecific divergences and constructing NJ and UPMGA phylogenetic tree based on Kimera-2-parameter model. The results showed that 39 samples were from three kinds of EBNs. Interspecific divergences were significantly greater than the intraspecific one. Samples could be successfully distinguished by NJ and UPMGA phylogenetic tree. In conclusion， Cytb sequence could be used to distinguish the origin of EBNs and it is efficient for tracing the origin species of EBNs.

[Key words] edible bird′s nests； DNA barcodes； Cytb； species identification

燕窩為雨燕科Apodidae金絲燕屬Aerodramus和侏金絲燕屬Collocalia的幾種燕類(lèi)分泌的唾液與其絨羽混合筑成的巢窩，按筑巢的地方可分為“屋燕”和“洞燕”，主要產(chǎn)于印度尼西亞、馬來(lái)西亞等東南亞國(guó)家[1-2]。燕窩，性平、味甘，歸心、肺、腎三經(jīng)，是一種宜藥宜膳的高級(jí)保健品[3-4]，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。中醫(yī)認(rèn)為燕窩具有養(yǎng)陰潤(rùn)燥、益氣補(bǔ)中、化痰止咳之功效[5]。古代醫(yī)書(shū)《本草求真》中記載[6]：“燕窩入肺生氣，入腎滋水，入胃補(bǔ)中，俾其補(bǔ)不致燥，潤(rùn)不致滯，而為藥中至平至美之味者也”。燕窩中含有大量蛋白質(zhì)及生物活性物質(zhì)[7]，近年來(lái)研究表明，燕窩具有抗衰老、提高免疫力、抗病毒、強(qiáng)骨作用等功效[8-10]。

燕窩價(jià)格昂貴，市場(chǎng)需求量巨大，利益豐厚。它的價(jià)格和品質(zhì)不僅受燕窩顏色、成分、形狀等影響，而且不同種屬金絲燕所產(chǎn)的燕窩種類(lèi)不同，在價(jià)格和質(zhì)量上也差異巨大[11]。傳統(tǒng)意義上認(rèn)為燕窩的質(zhì)量與產(chǎn)地有密切的關(guān)系，如越南會(huì)安的燕窩優(yōu)于印尼、泰國(guó)等地的燕窩，這可能與不同產(chǎn)地金絲燕物種不同有關(guān)[4]。鳥(niǎo)類(lèi)分類(lèi)學(xué)家將產(chǎn)燕窩的金絲燕分為兩大類(lèi)：一是雨燕科侏金絲燕屬Collocalia，包括白腹金絲燕C.esculenta、穴金絲燕C.linchi；二是雨燕科金絲燕屬Aerodramus，包括爪哇金絲燕A. fuciphagus、戈式金絲燕A.germani、大金絲燕A.maximus、印度金絲燕A.sunicolor、小灰腰金絲燕A.francicus[12]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)燕窩生物基原方面的研究報(bào)道較少，市場(chǎng)上以劣充優(yōu)的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。本研究利用DNA條形碼鑒定技術(shù)，對(duì)39個(gè)未知來(lái)源的毛燕窩進(jìn)行鑒定，為燕窩的溯源研究及全面評(píng)價(jià)燕窩質(zhì)量提供參考。

1 材料

ESP-600型電泳儀，C1000TM PCR儀，GBOX-F3凝膠成像儀，Centrifuge 5417R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Nanodrop2000微量定量?jī)x口腔拭子基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，引物（上海捷瑞生物工程有限公司廣州分公司），2×Taq PCR StarMix with Loading Dye、瓊脂糖、50×TAE（北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司），Gold View I型核酸染色劑，DNA Marker（上海捷瑞生物工程有限公司），其余試劑均為分析純。endprint

本研究所有樣品均經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院蔣林研究員鑒定，憑證樣本保存于中山大學(xué)藥學(xué)院。實(shí)驗(yàn)樣本信息見(jiàn)表1，從Genbank下載36條Cytb序列，Gen Bank登錄號(hào)等信息見(jiàn)表2。

2 方法

2.1 總DNA提取 將燕窩樣品于50 ℃烘48 h，研磨成細(xì)粉，過(guò)120目篩，密封保存于-20 ℃冰箱備用。采用口腔拭子基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。稱取燕窩樣品約40 mg，按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行總DNA的提取，利用微量定量?jī)x對(duì)提取DNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 擴(kuò)增序列的引物為Genbank中上傳最多的Cytb基因序列[13-14]，見(jiàn)表3。PCR反應(yīng)體系為20 μL：其中DNA模板1 μL，正向引物（10 μmol·L-1） 1 μL，反向引物（10 μmol·L-1） 1 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL， ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件的設(shè)置：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s；55～65 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。取5 μL的PCR 產(chǎn)物，用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。Marker采用上海捷瑞DL 2501，Marker相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)從上至下為2 000，1 000，750，500，250，100 bp。將檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.3 數(shù)據(jù)處理 測(cè)序結(jié)果用DNASTAR軟件包中的Seqman和Editseq進(jìn)行校對(duì)拼接，去除引物區(qū)和低質(zhì)量的序列，然后通過(guò)Clustal X V2.1[15]校對(duì)，MEGA 7.0[16]對(duì)齊刪減，最終選取所有樣品長(zhǎng)度均為530 bp的一段Cytb序列。從Genbank下載的36條Cytb序列，與拼接好的樣品序列比對(duì)后，對(duì)齊刪減獲得相對(duì)應(yīng)的區(qū)段。所有序列應(yīng)用MEGA 7.0軟件比對(duì)并計(jì)算K2P（Kimura-2-parameter）遺傳距離[17]，建立NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)[18]和UPGMA系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)[19]。在Gen Bank上通過(guò)BLAST相似性搜索法[20]，進(jìn)行序列的比對(duì)分析，驗(yàn)證各樣品的生物基原。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品序列特征分析 利用MEGA 7.0軟件，將以Cytb為引物所獲得的39條序列進(jìn)行比對(duì)，最終選取對(duì)齊后的530 bp的序列進(jìn)行分析。所有序列不含插入或缺失堿基以及終止密碼子。結(jié)果顯示，序列中保守位點(diǎn)516個(gè)，變異位點(diǎn)14個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)7個(gè)，單一多態(tài)位點(diǎn)7個(gè)。A，T，C，G堿基平均量分別為27.3%，23.2%，35.1%，14.4%。

3.2 種內(nèi)種間遺傳距離分析 在軟件MEGA 7.0中應(yīng)用Kimura雙參數(shù)法計(jì)算39條樣品序列和36條從Genbank下載的5種金絲燕的Cytb序列的種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離。結(jié)果顯示，大金絲燕和小灰腰金絲燕與其他金絲燕種間遺傳距離在1.85～1.92，其他3種金絲燕種間遺傳變異在0.02～0.08，種內(nèi)遺傳距離在0.000 3～0.023 6，見(jiàn)表4。種間遺傳距離明顯高于種內(nèi)遺傳距離，表明各序列的種間變異均顯著大于種內(nèi)變異，這與條形碼種間變異大而種內(nèi)變異小的要求是相一致的[18]，說(shuō)明Cytb條形碼序列適用于燕窩生物基原的鑒定，并且可以對(duì)其進(jìn)行有效的區(qū)分。

3.3 NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)和UPGMA系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù) 基于Cytb序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)和UPGMA系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)見(jiàn)圖1，2，結(jié)果顯示2種方法獲得的物種聚集信息分布基本一致。所有序列被聚為兩大支，各個(gè)序列的建樹(shù)效果良好，基本上能將不同種類(lèi)燕窩區(qū)分開(kāi)。

UPGMA系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)節(jié)點(diǎn)的支持率明顯高于NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，以UPGMA系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)進(jìn)行分析。爪哇金絲燕、白腰雨燕和戈氏金絲燕聚為一大支，節(jié)點(diǎn)支持率為99%。白腰雨燕單獨(dú)聚為一小支，爪哇金絲燕和戈氏金絲燕聚為一小支，同時(shí)又各自聚為不同的小支。大金絲燕和小灰腰金絲燕聚為一大支，節(jié)點(diǎn)支持率均為99%，大金絲燕和小灰腰金絲燕又各自聚為一小支。06號(hào)樣品與小灰腰金絲燕聚為一大支，節(jié)點(diǎn)支持率為89%，表明樣品生物基原為小灰腰金絲燕。39號(hào)樣品與戈式金絲燕聚為一支，節(jié)點(diǎn)支持率為56%，其生物基原為戈式金絲燕。其余樣品均與爪哇金絲燕聚為一支，表明其生物基原為爪哇金絲燕。以上結(jié)果與Blast搜索結(jié)果一致，表明Cytb序列可對(duì)不同種類(lèi)的燕窩生物基原進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。

4 討論

DNA條形碼是近年來(lái)生物分類(lèi)和鑒定的研究熱點(diǎn)和方向，是利用基因組中一段公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)短序列來(lái)進(jìn)行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)[21]。DNA條形碼研究的主要目的是用于物種的鑒定和新種的發(fā)現(xiàn)[22-23]，特別是在鑒定未知來(lái)源樣品方面有著極大 的優(yōu)勢(shì)[24]。近年來(lái)在經(jīng)過(guò)加工的肉類(lèi)、海鮮食品的物種溯源方面得到成功的應(yīng)用[25-26]，為食品質(zhì)量監(jiān)督提供保障。燕窩從采摘到加工成品，需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的挑毛、塑型等過(guò)程，成品的外形十分相似，無(wú)法通過(guò)形態(tài)特征等進(jìn)行物種溯源鑒定。本文采用DNA條形碼技術(shù)，對(duì)39份燕窩樣品進(jìn)行溯源研究。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Cytb序列作為擴(kuò)增引物，擴(kuò)增和測(cè)序成功的效率高達(dá)100%。對(duì)樣本Cytb序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示其相似度為99%～100%，E值為0，為鑒定的準(zhǔn)確性提供保障。

《中國(guó)藥典》2010年版[27]和2015年版[28]已正式收載了DNA分子鑒別方法及中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則。DNA條形碼技術(shù)可以為動(dòng)植物來(lái)源的中藥材提供快速、準(zhǔn)確的鑒定[29]。它通過(guò)構(gòu)建NJ，UPGMA系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)、計(jì)算遺傳距離、分析變異位點(diǎn)等方法相結(jié)合準(zhǔn)確鑒定出中藥材基原。本研究基于Cytb序列將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于燕窩樣品生物基原的鑒定。結(jié)果表明：Cytb序列種間變異顯著大于其種內(nèi)變異，符合理想的DNA條形碼 基因片段的特點(diǎn)[30]。所構(gòu)建的NJ和UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示所有序列被聚為兩大支，各個(gè)序列的建樹(shù)效果良好，且2種方法獲得的物種聚集信息分布基本一致，可以將全部物種區(qū)分開(kāi)。DNA條形碼技術(shù)對(duì)燕窩樣品的鑒定成功為燕窩的溯源研究及全面評(píng)價(jià)燕窩質(zhì)量提供理論參考，同時(shí)也為合理開(kāi)發(fā)燕窩資源，規(guī)范燕窩市場(chǎng)提供理論依據(jù)。endprint

[致謝] 感謝鐘元、周王曉云、郭襄、林國(guó)超、柯海燕、許旭、寶迪、周利和、丁香、陶敏等提供燕窩樣品。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]endprint