王佳

（浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310058 ）

飼草是反芻動物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。我國飼草資源短缺，進口飼草量逐年增加，但我國農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物資源十分豐富，具有飼料化利用的巨大潛力。農(nóng)作物秸稈存在消化性差、可利用養(yǎng)分不足等缺陷。為了提高秸稈飼料化利用效率，學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界經(jīng)歷了化學(xué)[1]、高壓蒸汽[2-3]、膨化[4]、酶和微生物預(yù)處理[5]等加工手段的研究，營養(yǎng)補飼[6]、外源酶[7]、微生物添加劑[8]的研發(fā)以及作物遺傳選育[9]的探索等。雖然上述方法在不同程度上提高了秸稈的利用效率，變廢為寶，但在生產(chǎn)應(yīng)用中仍不能滿足易操作、環(huán)境友好和效果穩(wěn)定等要求。因此，針對秸稈消化性差這一特性，有必要進一步提升預(yù)處理酶和飼用酶的效價，避免飼用酶被瘤胃微生物降解。

瘤胃是纖維物質(zhì)降解的主要場所，功能強大的瘤胃意味著生產(chǎn)效率的最大化。瘤胃的早期發(fā)育直接影響反芻動物成年后的泌乳[10]和產(chǎn)肉性能[11]。幼齡期尤其是斷奶前期是瘤胃最可塑的階段，飼料組成及形態(tài)、揮發(fā)性脂肪酸、瘤胃的pH值以及瘤胃微生物等，這些因素相互作用、相互牽制，共同影響瘤胃的形態(tài)和功能分化。為此，從動物內(nèi)源因素出發(fā)，通過營養(yǎng)供應(yīng)、物理刺激等多角度調(diào)節(jié)幼齡反芻動物瘤胃發(fā)育，提高瘤胃微生物消化能力及瘤胃上皮的吸收功能，應(yīng)該是提升粗飼料利用率的另一突破口。

為此本實驗室開展了高效纖維分解酶基因挖掘、酶菌一體化產(chǎn)品開發(fā)和瘤胃發(fā)育調(diào)節(jié)3方面的研究，以期通過提升外源酶效價改善反芻動物的秸稈消化率，調(diào)節(jié)瘤胃早期功能分化培育反芻動物的秸稈利用潛力。

1 高效纖維分解酶基因挖掘

消化道微生物生態(tài)群落是一個非常復(fù)雜的生物體系，有著巨大的基因資源以及豐富的生態(tài)資源。宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)通過免培養(yǎng)技術(shù)，分別研究生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和與全基因組的轉(zhuǎn)錄情況以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，在研究消化道微生物代謝和開發(fā)消化道微生物資源上展示出強勁的優(yōu)勢[12-13]。蛋白質(zhì)工程技術(shù)，包含蛋白質(zhì)的理性設(shè)計和非理性設(shè)計2種方法。傳統(tǒng)的理性設(shè)計需要預(yù)先知道蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性位點、催化機制等信息，在清楚結(jié)構(gòu)與功能的前提下，定點突變改變蛋白質(zhì)分子中個別氨基酸殘基，產(chǎn)生新性狀的蛋白質(zhì)。然而，在實際應(yīng)用中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息很難獲取，結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系異常復(fù)雜，因此理性設(shè)計具有很大的限制性。蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計，即體外定向改良，它模擬達爾文的自然進化論，利用基因的突變和重組，在體外改造酶的基因，產(chǎn)生基因多樣性，并結(jié)合定向的篩選最終獲得預(yù)期性狀的進化酶[14]。因此，我們利用宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，從草食動物消化道微生物中篩選具活性的酶基因，并通過定向改良技術(shù)進一步提升酶的特性。

通過擴增草食動物（奶牛、水牛、湖羊、麋鹿、馬和兔子）消化道微生物的糖苷水解酶家族（GH）10和11的基因發(fā)現(xiàn)，湖羊纖維分解菌中真菌所占比例高于其他物種[15]。為此確定湖羊為目標(biāo)物種，成功構(gòu)建了湖羊瘤胃微生物Fosmid文庫，篩選到木聚糖酶陽性克隆16個，內(nèi)切葡聚糖酶陽性克隆18個[16]。其中兩個木聚糖酶基因ORF6-UN[17]和Xyn-LXY[18]經(jīng)大腸桿菌表達后酶活性分別達到1 150 U/g和664.7 U/g，且這兩個木聚糖酶可以水解木聚糖產(chǎn)出高量的木二糖，具有消化道益生作用。通過隨機突變和定向篩選使ORF6-UN比活和催化速度分別提升2倍和4.6倍[19]。

通過湖羊瘤胃微生物宏轉(zhuǎn)錄組預(yù)測到249個具有纖維素酶催化模塊的開放閱讀框。其中β-1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶主要存在于GH5、GH9、GH44和GH45家族，外切葡聚糖酶主要存在于GH48家族，而β-葡萄糖苷酶主要存在于GH1和GH3家族中。經(jīng)部分檢測，宏轉(zhuǎn)錄組獲得的酶基因具有更好的內(nèi)切葡聚糖酶活性。

2 酶菌一體化開發(fā)

酶作為一種外源蛋白，動物采食后極易被瘤胃中的微生物降解。然而瘤胃中存在的微生物不僅存活著，而且發(fā)揮著重要的功能，為此考慮是否可通過微生物承載外源酶，通過微生物的保護使表達的酶逃避瘤胃微生物的降解，并通過微生物的增殖，保持該酶在瘤胃中的濃度。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)就需要合適的載體菌以及酶菌一體化的方式。酵母及其培養(yǎng)物對瘤胃的益生作用已得到廣泛證實，而且酵母細(xì)胞表達體系具備較為完善的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和分泌的機制。以酵母為基礎(chǔ)的細(xì)胞表面展示技術(shù)是一項新興的真核蛋白展示技術(shù)，其基本原理是將外源靶蛋白基因與特定的載體基因序列融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，融合蛋白誘導(dǎo)表達后，信號肽引導(dǎo)融合蛋白向細(xì)胞外分泌。由于融合蛋白含有錨定酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，可將融合蛋白錨定在酵母細(xì)胞壁中，從而將外源蛋白分子固定化表達在酵母細(xì)胞表面。該技術(shù)已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)識別、蛋白質(zhì)的固定化和定向進化研究，成為了蛋白質(zhì)工程研究的重要工具[20]。因此我們選擇酵母表面展示技術(shù)表達ORF6-UN，生產(chǎn)全細(xì)胞的酵母酶，以期發(fā)揮酵母和酶的雙重功效。

經(jīng)酵母細(xì)胞表面展示，實現(xiàn)了每克冷凍后的細(xì)胞表面木聚糖酶酶活為137 U。體外產(chǎn)氣試驗證實該酵母酶可有效提高玉米秸稈的干物質(zhì)降解率，縮短產(chǎn)氣延滯時間，增加揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白產(chǎn)量，且其作用效果顯著優(yōu)于酵母本身，實現(xiàn)了酵母和酶的雙重功效[21]。

代謝組分析顯示該酵母酶通過促進瘤胃中微生物的苯丙氨酸代謝等發(fā)揮功能。即外源酶通過內(nèi)源微生物的介導(dǎo)而發(fā)揮提高纖維物質(zhì)降解的作用。這也進一步說明瘤胃早期功能調(diào)節(jié)的重要性[22]。

3 瘤胃功能分化的調(diào)節(jié)

精料的飼喂可以在瘤胃內(nèi)生成更多的揮發(fā)性脂肪酸，尤其是丁酸和丙酸，這些揮發(fā)性脂肪酸可促進瘤胃上皮的快速發(fā)育[23]。然而有研究顯示，精料的飼喂易使瘤胃上皮粘附食糜斑塊[24]。在飼喂精料的過程中補飼粗料可以提高日增重、胴體重和瘤胃健康水平[25]，補飼粗料的效果受粗料類型、纖維長度以及補飼量的影響[26]。我們以湖羊為研究對象，研究了粗飼料的早期補飼對幼齡反芻動物瘤胃發(fā)育的影響。飼養(yǎng)試驗結(jié)果顯示，羔羊出生后10 d補飼苜蓿能夠提高斷奶前后開食料和粉狀精料的采食量和營養(yǎng)物質(zhì)攝入量，增加幼齡反芻動物的體重、日增重、胴體重，促進前胃和臟器的發(fā)育，減少瘤胃壁食糜粘附[27]。

為了研究這一過程中瘤胃微生物如何快速適應(yīng)飼料的改變，瘤胃上皮又如何回應(yīng)微生物及其代謝產(chǎn)物的變化，我們在飼養(yǎng)試驗的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)地比較了補飼苜蓿與否對瘤胃微生物區(qū)系和瘤胃上皮基因表達的影響。研究發(fā)現(xiàn)，羔羊出生后10 d補飼苜蓿能誘導(dǎo)瘤胃微生物區(qū)系在斷奶前就部分接近斷奶后，減少斷奶前后細(xì)菌屬水平的變化，提高微生物區(qū)系的穩(wěn)定性，從而促進羔羊?qū)嗄毯蟾呃w維日糧的適應(yīng)性，減少斷奶應(yīng)激。補飼苜蓿在斷奶前增強細(xì)胞代謝過程、細(xì)胞定位、生物質(zhì)量調(diào)控等分子功能；瘤胃上皮中細(xì)胞色素P450、類固醇激素的生物合成、脂肪酸代謝等代謝途徑，從而在斷奶后代謝途徑和生物過程相對穩(wěn)定。而不補飼苜蓿的羔羊在斷奶后再接觸苜蓿則表現(xiàn)為應(yīng)激反應(yīng)、生物質(zhì)量調(diào)控、外源刺激反應(yīng)、化學(xué)反應(yīng)等分子功能和緊密連接蛋白、唾液分泌等代謝途徑的增強[28]。

4 小結(jié)與展望

組學(xué)與定向進化及酶菌一體化技術(shù)的聯(lián)用，使外源酶的開發(fā)和應(yīng)用更為高效；瘤胃早期功能調(diào)節(jié)使粗飼料的高效利用有了新的靶點。然而酶結(jié)構(gòu)，如纖維小體（Cellulosomes）和多糖利用基因座（Polysaccharide Utilization Loci），與功能的關(guān)系；瘤胃功能調(diào)節(jié)的作用機制和長效性等都有待深入研究。

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