王 婭,莊布軍，吳伯岳，高衛(wèi)真,

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，天津300211；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系，天津300070；3.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070）

氨基糖苷類抗生素以其抗菌活性高、抗菌譜廣且水溶性好[1]等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床。其中硫酸慶大霉素是常用的該類藥物之一，主要用于革蘭陰性菌感染的治療[2]。但其耳毒性和腎毒性[3-4]是制約該藥物臨床使用的重要因素。硫酸慶大霉素的血藥濃度與其毒性密切相關(guān)[5]，中毒的谷濃度僅為2 mg/L[6]，其藥代動(dòng)力學(xué)存在較為明顯的個(gè)體差異，患者的感染程度、年齡和腎功能狀況等都會(huì)改變其血藥濃度[7]。因此，為了保證患者用藥的安全性和有效性，有必要進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM），為制定個(gè)體化給藥方案提供依據(jù)[8]。目前液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]、高效液相色譜法[10-11]是較為常用的檢測(cè)硫酸慶大霉素濃度的方法。但這些方法成本較大且操作比較復(fù)雜繁瑣[12]。熒光檢測(cè)是常用的定量分析方法，具有準(zhǔn)確、靈敏及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，而磷光具有較熒光更長(zhǎng)的壽命，可以更有效地避免生物體液的自發(fā)熒光等的干擾[13]。量子點(diǎn)是一種半導(dǎo)體納米微晶，因其良好的耐光漂白性、吸收光譜寬、發(fā)射光譜窄等[14]優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于熒光檢測(cè)，Mn摻雜的ZnS量子點(diǎn)具有室溫磷光性質(zhì)，故本實(shí)驗(yàn)基于硫酸慶大霉素對(duì)其磷光的敏化作用建立一種簡(jiǎn)便、靈敏且線性范圍廣的檢測(cè)硫酸慶大霉素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水，所有化學(xué)試劑的純度至少是分析純。所用試劑及其供應(yīng)源：硫酸慶大霉素（上海晶純生化科技股份有限公司，上海，規(guī)格：1 g），硫酸慶大霉素注射液（江蘇康寶制藥有限公司，江蘇，規(guī)格：2 mL），無水乙醇（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，天津，規(guī)格：500 mL），氫氧化鈉（NaOH，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，天津，規(guī)格：500 g），乙酸錳[Mn（Ac）2，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，天津，規(guī)格：500 g]，二水合乙酸鋅[Zn（Ac）2·2H2O，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司，上海，規(guī)格：500 g]，巰基丙酸（MPA，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司，上海，規(guī)格：100 mL），硫化鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，天津，規(guī)格：500 g），Tris-HCl緩沖溶液（1×10-2mol/L，pH=7.4，配制：10 mL 0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與42.0 mL 0.1 mol/L鹽酸混勻，用HCl調(diào)pH至7.4并用水定容至100.0 mL容量瓶，密閉保存于室溫中待用）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 F-380熒光分光光度計(jì)（天津市港東科技股份發(fā)展有限公司，天津），JA5003A電子精密天平（上海精天電子儀器有限公司，上海），真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，上海），X85-2S恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司，上海）。

1.2 方法

1.2.1 量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）的合成 參考已發(fā)表的文獻(xiàn)[15-16]，用以指導(dǎo)Mn摻雜ZnS QDs的合成。在100 mL三頸燒瓶中加入50 mL 4×10-2mol/L的MPA，2 mL 1×10-2mol/L 的 Mn(Ac)2和 5 mL 0.10mol/L的Zn(Ac)2水溶液。用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=11，室溫磁力攪拌并用氬氣脫氧30 min，之后將新配制的Na2S溶液(5 mL 0.10 mol/L)用注射器加入到三頸燒瓶中。繼續(xù)通氬氣20 min，隨后將反應(yīng)液在50℃中陳化2 h。將所得QDs溶液使用等體積無水乙醇進(jìn)行沉淀、離心并在室溫下置于真空干燥箱中干燥24 h，制備水溶性良好的Mn摻雜ZnS QDs粉末。最后把干燥的QDs粉末在水中復(fù)溶，即得到QDs的水溶液。

1.2.2 硫酸慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液和注射液的配制 于電子天平上準(zhǔn)確稱量100.00 mg硫酸慶大霉素溶于燒杯中，超聲5 min待完全溶解后定容于100.0 mL的容量瓶中，配制成硫酸慶大霉素初濃度C0=1.0×103mg/L。超聲后靜置，待溶液分散均勻后，用水稀釋，配制為C1=20 mg/L的硫酸慶大霉素儲(chǔ)備溶液備用。用倍比稀釋法將1支2 mL 8萬單位（80 mg）的硫酸慶大霉素注射液依次稀釋，至終濃度C2=20 mg/L備用。

1.2.3 硫酸慶大霉素的檢測(cè) 向一系列10 mL比色管中依次加入0.50 mLTris-HCl（pH=7.4，0.01 mol/L）、0.50mLMPA包裹的Mn摻雜ZnSQDs（C=0.20mg/L）、不同濃度的硫酸慶大霉素儲(chǔ)備溶液（使最終濃度 依 次 為 C=0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 mg/L）、然后用水定容至5.0 mL。于室溫下靜置30 min，以310 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，選擇激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度分別為10 nm和20 nm，PMT電壓為700 V，測(cè)定560～610 nm范圍內(nèi)的磷光光譜，并做出相對(duì)磷光強(qiáng)度與硫酸慶大霉素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 尿樣中硫酸慶大霉素的檢測(cè) 尿樣采自于健康志愿者人群，檢測(cè)前不做任何處理。向10mL比色管中依次加入 Tris-HCl（0.50mL，pH=7.4，1×10-2mol/L）、MPA 包裹的 Mn摻雜ZnS QDs（0.50 mL，0.20 mg/L）、不同濃度的硫酸慶大霉素溶液、尿液（1×10-2mL），然后用水定容至5.0 mL，室溫靜置30 min，以310 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，選擇激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度分別為10nm和20 nm，PMT電壓為700 V，測(cè)定560～610 nm范圍內(nèi)的磷光光譜。本實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，將測(cè)到的磷光光譜數(shù)據(jù)代入已做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即可得到尿樣中硫酸慶大霉素的濃度。

1.2.5 硫酸慶大霉素注射液的檢測(cè) 與尿樣中硫酸慶大霉素的檢測(cè)中其他條件完全相同，將尿液和不同濃度的硫酸慶大霉素替換為對(duì)應(yīng)濃度的硫酸慶大霉素注射液。同樣進(jìn)行平行測(cè)定3次。

2 結(jié)果

2.1 影響磷光檢測(cè)的因素

2.1.1 緩沖溶液類型對(duì)室溫磷光檢測(cè)的影響 為了考察緩沖溶液對(duì)室溫磷光檢測(cè)的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用的PBS、Tris-HCl緩沖溶液中的磷光相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。由圖1可知，在Tris-HCl緩沖體系中，磷光增敏的程度比較大，靈敏度相對(duì)較高。

圖1 緩沖溶液類型對(duì)磷光檢測(cè)的影響Fig 1 Effect of the type of buffer on the phosphorescence detection

2.1.2 緩沖溶液pH對(duì)室溫磷光檢測(cè)的影響 在影響QDs強(qiáng)度與穩(wěn)定性的因素中，溶液的pH最為重要。本實(shí)驗(yàn)考察了在其他條件不變時(shí)，反應(yīng)體系pH值在5.0～9.5范圍內(nèi)檢測(cè)體系的穩(wěn)定性。由圖2可知，溶液pH在7.0～7.5之間時(shí)，磷光強(qiáng)度雖相比于其它pH較低，但QDs的磷光強(qiáng)度具有較好的穩(wěn)定性。

圖2pH對(duì)Mn摻雜ZnS QDs穩(wěn)定性的影響Fig 2 Effect of pH on the RTP stability of the Mn-doped ZnS QDs

2.1.3 體系反應(yīng)時(shí)間對(duì)室溫磷光檢測(cè)的影響 考察不同反應(yīng)時(shí)間下，硫酸慶大霉素對(duì)體系磷光強(qiáng)度的影響。其他條件不變時(shí)，測(cè)量反應(yīng)體系靜置10～50 min內(nèi)磷光強(qiáng)度的變化，每隔5 min測(cè)量1次。由圖3可知，靜置時(shí)間在30 min左右時(shí)，磷光強(qiáng)度開始變得穩(wěn)定，且在隨后的20 min內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.1.4 QDs濃度對(duì)室溫磷光檢測(cè)的影響 在保證其他條件不變，一定濃度硫酸慶大霉素存在的情況下，我們加入不同濃度的QDs并檢測(cè)其磷光強(qiáng)度。低濃度的硫酸慶大霉素會(huì)對(duì)Mn摻雜ZnS QDs產(chǎn)生磷光增敏。但當(dāng)Mn摻雜ZnS QDs的濃度過高或者過低時(shí)，硫酸慶大霉素引起磷光的增敏都會(huì)大大降低（圖4）。當(dāng)Mn摻雜ZnS QDs的濃度為2×10-2mg/L左右時(shí)，其磷光強(qiáng)度增強(qiáng)幅度較大。

圖4QDs濃度對(duì)Mn摻雜ZnS QDs相對(duì)磷光強(qiáng)度的影響Fig 4 Effect of QDs concentration on the relative phosphorescence intensity of the Mn-doped ZnS QDs

2.1.5 溶液加入順序?qū)κ覝亓坠鈾z測(cè)的影響 比色管中含有以下成分：Mn摻雜ZnS QDs溶液、硫酸慶大霉素溶液、Tris-HCl緩沖溶液、尿液以及水溶液，分別以3種不同的順序加入到比色管中，靜置30 min后測(cè)量磷光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，加入順序?qū)α坠鈾z測(cè)體系幾乎沒有影響（圖5）。本實(shí)驗(yàn)選擇的順序是先加入Tris-HCl緩沖溶液，再加入Mn摻雜ZnS的QDs溶液、硫酸慶大霉素溶液，尿液，最后用水定容至比色管刻度。

圖5 加入順序?qū)α坠鈾z測(cè)體系的影響Fig 5 Effect of the order of addition on the phosphorescence detection system stability

2.1.6 共存離子對(duì)室溫磷光檢測(cè)的影響 考察了幾種常見的離子對(duì)Mn摻雜ZnS QDs磷光檢測(cè)硫酸慶大霉素的影響。當(dāng)硫酸慶大霉素的濃度為0.20 mg/L 時(shí)，500 倍的 Na+、K+，5 倍的 Ca2+、Mg2+對(duì)其室溫磷光強(qiáng)度影響均不大（表1）。

2.2 Mn摻雜ZnS QDs對(duì)硫酸慶大霉素的磷光響應(yīng) 在pH=7.4的Tris-HCl緩沖體系中檢測(cè)，于室溫下放置30 min。不同濃度硫酸慶大霉素的加入對(duì)Mn摻雜ZnS QDs磷光發(fā)射光譜的影響如圖6所示。由圖6 A可知，隨著硫酸慶大霉素濃度的增加，Mn摻雜ZnS QDs的磷光峰值顯著升高；由圖6 B可知，校正曲線（y=3.85×10-4x+1.54×10-4）的線性范圍為 0.10～10.00 mg/L，R2=0.998 5。

表1 共存離子的影響Tab 1 Effect of coexisting ions

圖6 不同濃度硫酸慶大霉素對(duì)Mn摻雜ZnS QDs磷光光譜（A）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）的影響Fig6 Influence of the concentration of added gentamicin sulfate on the phosphorescence spectra(A)and on the calibration curve(B)of the Mn-doped ZnS QDs

2.3 Mn摻雜ZnS QDs對(duì)硫酸慶大霉素的測(cè)定 在熒光分光光度計(jì)上選擇激發(fā)波長(zhǎng)310 nm、發(fā)射波長(zhǎng)560～610 nm進(jìn)行磷光掃描，并測(cè)定最大發(fā)射波長(zhǎng)下的磷光強(qiáng)度，再將最大磷光強(qiáng)度代入校正曲線中（y=3.85×10-4x+1.54×10-4）計(jì)算尿液中硫酸慶大霉素以及硫酸慶大霉素注射液濃度，結(jié)果列于表2。

表2 硫酸慶大霉素測(cè)定結(jié)果Tab 2 Results for determination of gentamicin sulfate

3 討論

本實(shí)驗(yàn)先對(duì)有可能影響QDs在檢測(cè)體系中穩(wěn)定性和磷光強(qiáng)度的因素進(jìn)行了考察，驗(yàn)證了緩沖溶液pH及類型、體系反應(yīng)時(shí)間、QDs的濃度及溶液加入順序等條件對(duì)檢測(cè)體系的影響。該QDs用于檢測(cè)硫酸慶大霉素濃度，需要保證其磷光強(qiáng)度和穩(wěn)定相較好的反應(yīng)體系，由圖1可知，不同類型的緩沖溶液對(duì)Mn摻雜ZnS QDs磷光強(qiáng)度的影響存在差別，本實(shí)驗(yàn)最終選用Tris-HCl作為緩沖溶液。由圖2可知，體系的pH對(duì)Mn摻雜ZnS QDs穩(wěn)定性和磷光強(qiáng)度影響很大，pH過大或者過小QDs的磷光強(qiáng)度均不穩(wěn)定，而硫酸慶大霉素為酸性溶液，不同濃度的硫酸慶大霉素溶液會(huì)使體系的pH產(chǎn)生變化，因此需要加入適當(dāng)?shù)木彌_溶液維持體系在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的pH環(huán)境中。同時(shí)，由于硫酸慶大霉素對(duì)Mn摻雜ZnS QDs的磷光存在增敏效果，為了獲得更高的靈敏度，應(yīng)該盡可能降低空白樣品（只含有QDs而不含有被測(cè)物）的磷光強(qiáng)度。因此，本實(shí)驗(yàn)選用的反應(yīng)體系為pH=7.4的Tris-HCl溶液，由圖3可知，QDs在體系中靜置時(shí)間較短時(shí)，其磷光強(qiáng)度呈不規(guī)則變化，這是由于反應(yīng)時(shí)間短，QDs和硫酸慶大霉素的相互作用不充分，反應(yīng)時(shí)間在30～50 min時(shí)磷光強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定，而時(shí)間過長(zhǎng)，又違背了快速檢測(cè)原則，基于此本實(shí)驗(yàn)選擇的體系反應(yīng)時(shí)間為30 min。由圖4可知，QDs濃度過低時(shí)，硫酸慶大霉素引起磷光增敏的靈敏度會(huì)大大降低；而濃度過高時(shí)，隨著藥物濃度的增加，磷光強(qiáng)度會(huì)超出磷光測(cè)量的最大范圍，同時(shí)QDs也會(huì)發(fā)生自淬滅現(xiàn)象，導(dǎo)致靈敏度也會(huì)降低，因此本實(shí)驗(yàn)選擇2×10-2mg/L的Mn摻雜ZnS QDs用于硫酸慶大霉素的室溫磷光檢測(cè)。由圖5及表1可知，溶液的加入順序和共存離子對(duì)Mn摻雜ZnS QDs的室溫磷光檢測(cè)結(jié)果影響不大。由圖6A可知，硫酸慶大霉素對(duì)Mn摻雜ZnS QDs的磷光強(qiáng)度存在明顯的增敏作用。硫酸慶大霉素的濃度與QDs的磷光強(qiáng)度成良好的線性關(guān)系，其線性范圍為 0.10～10.00 mg/L，R2=0.998 5（圖 6B）?；诖私⒘艘环N高靈敏度且簡(jiǎn)便的硫酸慶大霉素的檢測(cè)方法。慶大霉素在人體內(nèi)幾乎不被代謝，大多是以原型從尿中排出體外，因此尿液藥物濃度可高達(dá)100.0 mg/L[13]。由表2可知，用該方法可以測(cè)定尿液中硫酸慶大霉素以及硫酸慶大霉素注射液的濃度。尿樣的采集無創(chuàng)且便捷，如果可以用尿藥濃度間接反映血藥濃度，從而指導(dǎo)患者用藥，將大大降低患者反復(fù)取血的痛苦等缺點(diǎn)。至于尿藥濃度是否可反映血藥濃度的變化情況需進(jìn)一步研究。關(guān)于血藥濃度與尿藥濃度對(duì)比實(shí)驗(yàn)，是我們下一步將要展開的工作。本文基于硫酸慶大霉素對(duì)Mn摻雜ZnS QDs的磷光增敏現(xiàn)象，建立了一種簡(jiǎn)便、快速測(cè)定尿液硫酸慶大霉素濃度的新方法，該方法有望用于生物體液中硫酸慶大霉素的檢測(cè)。

[1] 朱立勤,婁建石,焦建杰,等.慶大霉素不同給藥方案的藥代動(dòng)力學(xué)和腎功能損害的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2006,22(8):1009

[2] Garneau-Tsodikova S,Labby K J.Mechanisms of resistance to aminoglycoside antibiotics:Overview and perspectives[J].Medchemcomm,2016,7(1):11

[3] Li J,Woo C W.Finding ways to solve or preventaminoglycoside-inducedototoxicity[J].Ann Transl Med,2016,4(24):533

[4] Gerlach A T,Stawicki S P,Cook CH,et al.Risk factors for aminoglycoside-associated nephrotoxicity in surgical intensive care unit patients[J].Int J Crit Illn Inj Sci,2011,1(1):17

[5] Touw D J,Westerman E M,Sprij A J.Therapeutic drug monitoring of aminoglycosides in neonates[J].Clin Pharmacokinet,2009,48(2):71

[6] 曾萍,楊鎰?dòng)?陶建平,等.危重病患兒口服慶大霉素血藥質(zhì)量濃度監(jiān)測(cè)的意義[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2006,21(6):339

[7] 彭小林,范亞新,張亮,等.氨基糖苷類抗生素治療藥物濃度監(jiān)測(cè)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)感染與化療雜志,2017,17(1):104

[8] Mahmoudi L,Mohammadpour A H,Ahmadi A,et al.Influence of sepsis on higher daily dose of amikacin pharmacokinetics in critically ill patients[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2013,17(3):285

[9]Rodriquez M,Cretoso D S,Euterpio M A,et al.Fast determination of underivatized gentamicin C components and impurities by LC-MS using a porous graphitic carbon stationary phase[J].Anal Bioanal Chem,2015,407(25):7691

[10]李瑋,胡昌勤,王明娟.高效液相色譜法測(cè)定慶大霉素C組分的不同檢測(cè)方式測(cè)定結(jié)果的比較[J].色譜,2007,25(4):557

[11]楊利紅，常艷，姚尚辰，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定慶大霉素的組分純度和效價(jià)活性[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012,12:105

[12]潘進(jìn),邱凌峰,方圣瓊,等.衍生化紫外分光光度法測(cè)定硫酸慶大霉素含量[J].環(huán)境工程,2015,33:295

[13]Tan L,Li Y,Tang Y,et al.Room temperature phosphorescence sensor for Hg2+based on Mn-doped ZnS quantum dots[J].J Nanosci Nanotechnol,2012,12(10):7788

[14]Zhao M X,Zeng E Z.Application of functional quantum dot nanoparticles as fluorescence probes in cell labeling and tumor diagnostic imaging[J].Nanoscale Res Lett,2015,10(1):171

[15]Wu P,He Y,Wang H F,et al.Conjugation of glucose oxidase onto Mn-doped ZnS quantum dots for phosphorescent sensing of glucose in biological fluids[J].Anal Chem,2010,82(4):1427

[16]Zhang Z,Miao Y,Zhang Q,et al.Facile and sensitive detection of protamine by enhanced room-temperature phosphorescence of Mndoped ZnS quantum dots[J].Anal Biochem,2015,478:90