沈克飛，許國洋，胡瑞思，徐登峰，楊 睿，付利芝，張素輝*

(1.重慶市畜牧科學院，重慶 402460； 2.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，楊凌 712100)

化膿隱秘桿菌是革蘭陽性菌，主要寄生在動物上呼吸道、消化道、生殖道等黏膜，是和化膿性感染相關聯(lián)的機會性病原體[1-3]。化膿隱秘桿菌是山羊呼吸道疾病和體表淋巴結(jié)炎的重要病原之一，病羊表現(xiàn)漸進性消瘦、流產(chǎn)等癥狀，病理組織學變化為化膿性炎癥[4-5]。

細菌定植于宿主組織是感染發(fā)生的關鍵一步。在感染過程中，許多病原菌產(chǎn)生蛋白質(zhì)以促進細菌黏附。微生物表面識別黏附基質(zhì)分子成分(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMM)是一類與宿主細胞外基質(zhì)成分相互作用的蛋白質(zhì)家族，導致細菌黏附宿主[6]。MSCRAMM屬于一類具有類似結(jié)構(gòu)的細胞壁錨定蛋白質(zhì)，N端由信號序列、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個或多套重復多肽組成，C端有細胞壁錨定結(jié)構(gòu)域?；撾[秘桿菌的膠原結(jié)合蛋白(collagen-binding protein，Cbp)CbpA是MSCRAMM中一員，具有MSCRAMM基本序列特征，能黏附多型膠原和多種細胞，在細菌黏附中發(fā)揮重要作用[7]。病原體常以真核細胞表面的氨基葡聚糖(glycosaminoglycan)(如肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素等多糖)作為黏附受體[8-11]。

山羊化膿隱秘桿菌重慶分離株2012CQ-ZSH(GenBank登錄號CP012649)已完成基因組測序[12]。序列比對顯示，其CbpA(CbpA-CQ)基因與已公布化膿隱秘桿菌的CbpA基因在5′端無明顯相似性。為了揭示其分子特性，本研究對CbpA-CQ進行序列分析，并鑒定了其中2個潛在的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌HeLa細胞株、山羊化膿隱秘桿菌重慶分離株2012CQ-ZSH由重慶市畜牧科學院獸醫(yī)研究所保存和提供；新生胎牛血清、Roswell Park Memoria Institute-1640(RPMI-1640)培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自Hyclone公司；細菌DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自OMEGA公司；肝素、還原性谷胱甘肽購自GE Healthcare公司；GST小鼠單克隆抗體(GST2)、堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG(完整分子)抗體購自Sigma公司，Gluthathione-Sepharose 4B購自Pharmacia公司；BCTP/NBT購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 序列分析 將CbpA-CQ基因在NCBI上作BLAST搜索以進行同源性分析，使用在線軟件(http://web.expasy.org/translate/)翻譯基因，查找蛋白質(zhì)序列中的堿性氨基酸，預測CbpA-CQ的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽(http://phobius.sbc.su.se)，進行保守結(jié)構(gòu)域分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)。采用MEGA 4軟件中的鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建CbpA-CQ進化樹。

1.2.2 基因克隆 為了分析功能，設計了2對引物分別擴增CbpA-CQ的N端富含堿性氨基酸區(qū)域NRB和膠原結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域B1(圖1)的編碼序列。引物序列分別為CbpAF1：5′-GGATCCGTGAGCCCTGGGAAAAGTTA-3′，CbpAR1：5′-CTCGAGAGGCAATAGTTTACCCGAGA-3′；CbpAF2: 5′-GGATC-CGTTACCGTATCTGTTGAGAAGATG-3′，CbpAR2: 5′-CTCGAGGTAAGTGTTGACCACCGTAAA-3′。引物序列中斜體分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。使用細菌 DNA 試劑盒提取化膿隱秘桿菌基因組DNA。PCR反應體系：10×PCR Buffer (含15 mmol·L-1Mg2+)2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL，5 U·μL-1rTaq 0.10 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，用去離子水補足25 μL。PCR反應參數(shù)：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸25 s，共進行30循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。目的片段經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收后克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α。經(jīng)序列測定的重組質(zhì)粒使用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，將酶切下的目的基因與經(jīng)同樣雙酶切pGEX-4T-1連接構(gòu)建表達載體pGEX-NRB和pGEX-B1，轉(zhuǎn)化入DH5α，篩選陽性克隆提取重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化入DE3用于誘導表達。預測GST融合蛋白GST-NRB和GST-B1的相對分子質(zhì)量為44 和33 ku。

1.2.3 誘導表達 37 ℃下振搖培養(yǎng)至菌體濃度達OD600 nm約為1時，加入終濃度0.1 mmol·L-1IPTG，37 ℃下誘導表達3 h。培養(yǎng)物4 ℃下5 000 r·min-1離心30 min，沉淀用PBS洗滌3次。每100 mL培養(yǎng)液加20 mL PBS以懸浮菌體沉淀，冰水浴中超聲裂解菌懸液(超聲功率為300 W，工作4 s間歇5 s，超聲裂解15 min)。裂解物12 000 r·min-1離心10 min，采用免疫印跡(GST小鼠單克隆抗體)檢測上清中的GST融合蛋白。

1.2.4 蛋白質(zhì)純化 純化上清中的可溶性重組蛋白質(zhì)。向裂解物中加入終濃度1% Trition X-100，4 ℃振搖孵育30 min，5 000 r·min-1離心30 min，收集上清。每20 mL上清加入300 μL Gluthathione-Sepharose 4B，4 ℃攪動孵育1 h。PBS洗滌3次后用10 mmol·L-1還原性谷胱甘肽洗脫，采用透析法去除其中的還原性谷胱甘肽。利用SDS-PAGE分析純化效果。

1.2.5 細菌黏附抑制試驗 在6孔培養(yǎng)板內(nèi)放入細胞爬片進行細胞培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察爬片上細胞生長至60%時停止培養(yǎng)，用RPMI-1640洗貼壁細胞3次。加入RPMI-1640洗滌的新鮮化膿隱秘桿菌(109·mL-1)，10 μL·孔-1；加入肝素溶液(RPMI-1640溶液配制)，使用RPMI-1640溶液將每孔溶液補足至1 mL，肝素終質(zhì)量濃度依次為13.8、3.6、1.2、0.4、0.13、0 mg·mL-1。37 ℃放置1 h。棄去懸浮液，加入RPMI-1640溶液振搖洗3次。甲醛固定10 min，PBS洗2次。取出爬片，在爬片上滴一滴結(jié)晶紫溶液染色1 min，用蒸餾水沖洗干凈，待爬片干燥后觀察。

1.2.6 融合蛋白黏附試驗 用胰酶(0.05%胰酶，0.02% EDTA)消化長滿單層的HeLa細胞，用RPMI-1640洗3次，將細胞制備成1010·mL-1備用。將蛋白質(zhì)(GST、GST-NRB或GST-B1)的質(zhì)量濃度調(diào)整為1 mg·mL-1。按表1加入各組分，每組按蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分為4個濃度梯度，依次為0、0.05、0.15和0.75 mg·mL-1。顛倒混勻各組分，4 ℃下緩慢搖動孵育1 h。4 ℃下800 r·min-1離心10 min，沉淀用1 mL 預冷PBS洗3次。樣本經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次后與GST單克隆抗體(1∶5 000)孵育，TBST洗3次后與堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)孵育，最后置BCTP/NBT中顯色。

1.2.7 融合蛋白黏附抑制試驗 按上述方法制備細胞和肝素溶液。按表2加入各組分，每組按肝素濃度分為4個質(zhì)量濃度梯度，依次為0、13.29、39.69、118.80 mg·mL-1?；靹颍? ℃下緩慢搖動孵育1 h，其間注意翻轉(zhuǎn)離心管以使細胞不沉降。4 ℃下800 r·min-1離心10 min保留沉淀。按上述方法進行免疫印跡分析。

表1融合蛋白細胞黏附分析

Table 1 Cell adhesion assay of fusion proteins μL

表2肝素抑制融合蛋白黏附細胞分析

Table2Heparininhibitstheadhesionoffusionproteinstocells

μL

2 結(jié) 果

2.1 序列分析

CbpA-CQ基因全長3 456 bp，編碼1 151個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。BLAST結(jié)果顯示，CbpA-CQ在膠原結(jié)合蛋白重復B結(jié)構(gòu)域部分與化膿隱秘桿菌、鏈球菌屬等細菌有同源性，覆蓋率為55%，其編碼基因也僅在這部分與上述細菌有同源性。

在CbpA-CQ中，共有38 R、97 K和17 H，堿性氨基酸含量為13.2%(152/1151)(圖1)。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，CbpA-CQ含有7個膠原結(jié)合蛋白B重復結(jié)構(gòu)域?？缒そY(jié)構(gòu)域和信號肽預測結(jié)果顯示，在CbpA-CQ的N端有信號肽，羧基端有跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1)。分子系統(tǒng)進化分析顯示，CbpA-CQ與化膿隱秘桿菌的CbpA在進化樹中聚集成一個進化支(圖2)。

2.2 融合蛋白質(zhì)的可溶性表達分析

免疫印跡分析顯示，重組菌經(jīng)IPTG誘導后，在裂解物上清中可見相對分子質(zhì)量分別約44和33 ku的目的條帶，大小與預期相符，表明融合蛋白GST-NRB和GST-B1有可溶性表達(圖3)。

信號肽切割位點以箭頭標注。用于表達的氨基酸序列為斜體和加粗字體，7個重復B結(jié)構(gòu)域用下劃線標注，跨膜結(jié)構(gòu)域被加框The predicted signal peptide cleavage site is denoted by the vertical arrow. The amino acid sequence expressed is in italic and bold, seven repeat B domains are underlined, and the intervening membrane-spanning domain is boxed圖1 CbpA-CQ的序列分析Fig.1 Sequence analysis of CbpA-CQ

●. CbpA-CQ圖2 CbpA-CQ及其相似蛋白質(zhì)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of CbpA-CQ and similar proteins

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1. GST-NRB；2.GST-B1；3.GST-NRBM. Protein marker; 1. GST-NRB; 2.GST-B1; 3.GST-NRB圖3 菌體裂解物上清的融合蛋白質(zhì)Western blot鑒定(GST單克隆抗體)Fig.3 Detection of fusion proteins by Western blot (GST mAb) in the supernatant of the induced bacteria lysate

2.3 融合蛋白質(zhì)純化

SDS-PAGE分析顯示，采用Gluthathione-Sepharose 4B從裂解物上清中純化得到融合蛋白質(zhì)GST-NRB和GST-B1(圖4)。

2.4 肝素抑制化膿隱秘桿菌黏附細胞

結(jié)晶紫染色觀察顯示，共同孵育后，山羊化膿隱秘桿菌重慶株黏附到HeLa細胞表面；肝素、化膿隱秘桿菌、細胞共同孵育后，在肝素質(zhì)量濃度為0.13～13.8 mg·mL-1間，HeLa細胞表面的化膿隱秘桿菌數(shù)量隨肝素劑量遞增而遞減(圖5)。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1. GST；2. GST-B1；3. GST-NRB M. Protein marker; 1. GST; 2. GST-B1; 3. GST-NRB圖4 融合蛋白質(zhì)的純化Fig.4 Purification of fusion proteins

2.5 融合蛋白質(zhì)黏附細胞及肝素抑制黏附

免疫印跡顯示，GST未與HeLa細胞發(fā)生黏附，GST-NRB、GST-B1與HeLa細胞孵育后，出現(xiàn)特異條帶，且條帶亮度隨GST-NRB、GST-B1劑量的增加而增加，表現(xiàn)出良好的劑量依賴關系(圖6)，

肝素劑量：13.8(A)、3.6(B)、1.2(C)、0.4(D)、0.13(E)、0(F)mg·mL-1Heparin dose: 13.8 (A), 3.6 (B), 1.2 (C), 0.4 (D), 0.13 (E) and 0 (F) mg·mL-1圖5 肝素抑制山羊化膿隱秘桿菌重慶株黏附HeLa細胞Fig.5 Heparin inhibits the adhesion of T. pyogenes Chongqing isolate from goat to HeLa cells

A. GST-NRB；B. GST-B1。1. GST；2～5. 0、0.05、0.15和0.75 mg·mL-1蛋白質(zhì)A. GST-NRB; B. GST-B1. 1. GST; 2-5. Protein concentration: 0, 0.05, 0.15 and 0.75 mg·mL-1, respectively圖6 GST-NRB和GST-B1黏附HeLa細胞分析Fig.6 Adhesion assay of GST-NRB and GST-B1 to HeLa cells

表明GST-NRB、GST-B1與HeLa細胞發(fā)生特異性黏附，且黏附與標簽GST無關。肝素與HeLa細胞、GST-NRB或GST-B1孵育后，免疫印跡中的特異條帶亮度隨肝素質(zhì)量濃度降低而升高，表現(xiàn)出劑量依賴關系(圖7)，表明肝素對GST-NRB、GST-B1黏附細胞的抑制作用是特異的。

A. GST-NRB；B. GST-B1。1～4. 0、13.29、39.69和118.80 mg·mL-1肝素A. GST-NRB; B. GST-B1. 1-4. Heparin concentration: 0, 13.29, 39.69 and 118.80 mg·mL-1, respectively圖7 肝素抑制GST-NRB 和GST-B1黏附HeLa細胞分析Fig.7 Heparin inhibits the adhesion of GST-NRB and GST-B1 to HeLa cells

3 討 論

序列分析結(jié)果顯示，CbpA-CQ基因及其編碼的蛋白質(zhì)盡管在前半部分有超過40%的序列與已知菌株無同源性，但Cbp-CQ具有MSCRAMM 家族典型的分子特征，即N端含有信號序列、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、C端有細胞壁錨定結(jié)構(gòu)域等[6]，與化膿隱秘桿菌的同源性最高，在進化樹中與化膿隱秘桿菌構(gòu)成一個獨立進化分支。研究指出化膿隱秘桿菌的CbpA可黏附多種細胞，在黏附宿主細胞上發(fā)揮重要作用[7]。我們的結(jié)果證實CbpA-CQ的NRB和B1結(jié)構(gòu)域可黏附HeLa細胞，提示其在功能上可能與化膿隱秘桿菌其他菌株的CbpA一樣在黏附宿主細胞上發(fā)揮作用。

黏附宿主細胞是感染發(fā)生的關鍵階段。在過去的研究中，人們發(fā)現(xiàn)細菌、病毒、寄生蟲等病原體特異黏附真核細胞表面的氨基葡聚糖分子，是黏膜感染的主要機制之一[8-11]。本研究觀察到肝素可競爭性抑制山羊化膿隱秘桿菌重慶株黏附HeLa細胞，表明肝素分子介導細菌黏附HeLa細胞，提示化膿隱秘桿菌也利用這一一般策略以實現(xiàn)感染動物。

氨基葡聚糖結(jié)合蛋白在細菌生長和培養(yǎng)過程中表達，微生物利用氨基葡聚糖結(jié)合蛋白黏附、入侵宿主[13]。蛋白質(zhì)與肝素類似物黏附的分子基礎，是配體蛋白分子上帶正電荷的氨基酸簇與肝素類似物的負電荷形成離子鍵，帶正電荷的氨基酸簇與疏水性氨基酸相靠近[14]，疏水性氨基酸側(cè)鏈和肝素類似物的非極性基團間的相互作用穩(wěn)定了蛋白質(zhì)和聚糖的作用[15]。暴露在結(jié)構(gòu)域表面的富含賴氨酸基序在配體分子與肝素或硫酸乙酰肝素結(jié)合上起主要作用，而其他區(qū)域或結(jié)構(gòu)域?qū)Y(jié)合有穩(wěn)定或促進作用[15-17]。這樣，盡管肝素結(jié)合蛋白的功能、空間構(gòu)象可能不同，但它們都具有肝素結(jié)合基序(motif)暴露在結(jié)構(gòu)域表面。因此，在蛋白質(zhì)序列中帶正電荷的區(qū)域尤其是含有賴氨酸簇區(qū)域是肝素分子的潛在結(jié)合位點。CbpA是堿性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)，可能是肝素結(jié)合蛋白。為了鑒定肝素結(jié)合域，本研究選擇了CbpA-CQ中富含堿性氨基酸的NRB和B1區(qū)域，通過黏附試驗和黏附抑制試驗證實NRB和B1是肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其與HeLa細胞的黏附受肝素介導。

4 結(jié) 論

運用生物信息學軟件分析山羊化膿隱秘桿菌重慶分離株的膠原結(jié)合蛋白(CbpA-CQ)基因及其編碼產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)重慶株CbpA有7個膠原結(jié)合蛋白B結(jié)構(gòu)域，約占全長的55%，此結(jié)構(gòu)域與化膿隱秘桿菌、鏈球菌屬等細菌有同源性，具有已知化膿隱秘桿菌CbpA的共同序列特征；CbpA-CQ的NRB和B1結(jié)構(gòu)域可黏附HeLa細胞，其NRB和B1區(qū)域為肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

[1] RIBEIRO M G, RISSETI R M, BOLAOS C A, et al.Trueperellapyogenesmultispecies infections in domestic animals: a retrospective study of 144 cases (2002 to 2012)[J].VetQ, 2015, 35(2): 82-87.

[2] ISHIYAMA D, MIZOMOTO T, UEDA C, et al. Factors affecting the incidence and outcome ofTrueperellapyogenesmastitis in cows[J].JVetMedSci, 2017, 79(3): 626-631.

[3] AFEMA J A, BECKMEN K B, ARTHUR S M, et al. Disease complexity in a declining Alaskan muskox (Ovibosmoschatus) population[J].JWildlDis, 2017, 53(2): 311-329.

[4] 張素輝, 付利芝, 朱買勛, 等. 山羊源化膿隱秘桿菌的分離與鑒定及自然感染病例的病理學觀察[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2015, 46(12): 2251-2257.

ZHANG S H, FU L Z, ZHU M X, et al. Isolation and identification ofArcanobacteriumpyogenesfrom goats and pathological observation of naturally infected case[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2015, 46(12): 2251-2257. (in Chinese)

[5] 許國洋, 付利芝, 楊金龍, 等. 山羊淋巴結(jié)炎病原菌的分離鑒定及多重PCR檢測方法的建立[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2017, 48(2): 324-330.

XU G Y, FU L Z, YANG J L, et al. Isolation and identification of pathogenic bacteria of lymphadenitis in goat and establishment of multiplex PCR detection method[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2017, 48(2): 324-330. (in Chinese)

[6] ROSS C L, LIANG X W, LIU Q, et al. Targeted protein engineering provides insights into binding mechanism and affinities of bacterial collagen adhesins[J].JBiolChem, 2012, 287(41): 34856-34865.

[7] ESMAY P A, BILLINGTON S J, LINK M A, et al. TheArcanobacteriumpyogenescollagen-binding protein, CbpA, promotes adhesion to host cells[J].InfectImmun, 2003, 71(8): 4368-4374.

[8] FULLER A O. Microbes and the proteoglycan connection[J].JClinInvest, 1994, 93(2): 460.

[9] WADSTR?M T, LJUNGH ?. Glycosaminoglycan-binding microbial proteins in tissue adhesion and invasion: key events in microbial pathogenicity[J].JMedMicrobiol, 1999, 48(3): 223-233.

[10] MENOZZI F D, PETHE K, BIFANI P, et al. Enhanced bacterial virulence through exploitation of host glycosaminoglycans[J].MolMicrobiol, 2002, 43(6): 1379-1386.

[11] 尹 鑫，張 穎，劉瀾瀾, 等. 3種受體抑制劑對雞傳染性支氣管炎病毒感染雞胚腎細胞的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2011, 42(5): 704-710.

YIN X, ZHANG Y, LIU L L, et al. The impact of three different receptor inhibitors in the progress of infectious bronchitis virus infection in chicken embryo kidney cells[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2011, 42(5): 704-710. (in Chinese)

[12] ZHANG S H, QIU J J, YANG R, et al. Complete genome sequence ofTrueperellapyogenes, isolated from infected farmland goats[J].GenomeAnnounc, 2016, 4(6): e01421-16, doi: 10.1128/genomeA.01421-16.

[13] CHHATWAL G S. Anchorless adhesins and invasins of Gram-positive bacteria: a new class of virulence factors[J].TrendsMicrobiol, 2002, 10(5): 205-208.

[14] SINNIS P, CLAVIJO P, FENY? D, et al. Structural and functional properties of region II-plus of the malaria circumsporozoite protein[J].JExpMed, 1994, 180(1): 297-306.

[15] VERMERSCH P S, LEMON D D, TESMER J J, et al. Sugar-binding and crystallographic studies of an arabinose-binding protein mutant (Met108Leu) that exhibits enhanced affinity and altered specificity[J].Biochemistry, 1991, 30(28): 6861-6866.

[16] YUAN Z Z, YAN X J, ZHANG A D, et al. Molecular mechanism by which surface antigen HP0197 mediates host cell attachment in the pathogenic bacteriaStreptococcussuis[J].JBiolChem, 2013, 288(2): 956-963.

[17] ZHAO J H, BHANOT P, HU J J, et al. A comprehensive analysis ofPlasmodiumcircumsporozoite protein binding to hepatocytes[J].PLoSOne, 2016, 11(8): e0161607.