孟 丹，孟慶玲，喬 軍*，蔡擴軍，王登峰，馬 帥，伍曄暉，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832003； 2.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，烏魯木齊 830063；3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830000； 4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是引起奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎最重要的病原菌之一，在葡萄球菌中致病力最強，含有多種酶類和毒素[1]。同時，SA也是一種人畜共患菌，特別是隨著細(xì)菌的不斷進(jìn)化與演變，耐甲氧西林SA(MRSA)在人類和動物之間交叉?zhèn)鞑2-3]，越來越多地受到世界衛(wèi)生組織及各國學(xué)者的關(guān)注。近年來SA耐藥性菌株逐年增多，特別是MRSA流行株的大量出現(xiàn)，引起嚴(yán)重感染的比例也有逐年升高的趨勢，給SA感染性疾病的臨床治療帶來了極大的困難。

研究發(fā)現(xiàn)，SA對抗生素的耐藥性主要依賴于自身攜帶的各種耐藥相關(guān)基因，不同的耐藥基因產(chǎn)生耐藥的機制也不同[4]，SA常見耐藥機制包括藥物捕獲、藥物靶標(biāo)的修飾、酶的失活和外排泵，均依賴于耐藥基因編碼的相關(guān)蛋白質(zhì)[5]。而隨著抗生素的大量使用，作為治療MRSA“最后防線”的糖肽類抗生素萬古霉素的耐藥株不斷出現(xiàn)，在中國大陸，W. J. Sun等在2009年發(fā)現(xiàn)了一株萬古霉素中介敏感金黃色葡萄球菌(VISA)[6]，因此對新疆流行株SA的耐藥性研究意義重大。SA的致病性主要取決于其毒力相關(guān)基因，目前已報道的SA毒力相關(guān)基因有40多種[7]，毒力因子溶血素，可在宿主細(xì)胞膜上形成小孔，造成細(xì)胞內(nèi)液外流而導(dǎo)致細(xì)胞破壞。殺白細(xì)胞毒素lukED和PVL可以對抗宿主的免疫系統(tǒng)。TST主要與編碼基因的一些特定可移動序列有關(guān)，可表達(dá)TSST-1，是一種超抗原，能夠直接活化T淋巴細(xì)胞，使其在感染患者體內(nèi)釋放出炎癥介質(zhì)而導(dǎo)致機體發(fā)病[8-10]。這些毒力因子(如SA編碼的表面蛋白、蛋白酶和毒素等)可協(xié)助細(xì)菌快速入侵宿主體內(nèi)，并在宿主體內(nèi)長時間存活，從而增強SA侵襲宿主的能力[11]。葡萄球菌染色體盒mec(SCCmec)和MLST分子分型是SA分型的兩個常用方法，由于編碼PBP2a的mecA基因位于可移動元件SCCmec上，且不同的MRSA內(nèi)的SCCmec結(jié)構(gòu)存在較大差異，因此可分為不同的SCCmec基因型，全球主要有8種SCCmec基因型，其中又分為若干亞型[12]。目前，在MLST數(shù)據(jù)庫中SA可以分成2 840種ST，共收錄了4 929 株菌株的相關(guān)信息，而中國食源性菌株只有91株。經(jīng)eBURST V3 分析顯示，中國食源性菌株ST分布存在5個克隆群ST97、ST5、ST398、ST1和ST9，最大克隆群為ST97，主要起源克隆群為ST398[13]。因此SCCmec和MLST分子分型既可作為探討SA在人-畜-環(huán)境間傳播途徑的重要依據(jù)，也是SA流行病學(xué)調(diào)查研究的重要工具。

新疆是我國五大牧區(qū)之一，也是我國重要的奶牛養(yǎng)殖基地，目前奶牛存欄360余萬頭，奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎已經(jīng)成為奶牛養(yǎng)殖業(yè)最難防控的疫病之一。然而，目前對新疆地區(qū)奶牛SA流行株的耐藥特性、致病性及流行病學(xué)特性研究甚少。鑒于此，本研究通過對新疆地區(qū)SA流行株耐藥表型、相關(guān)耐藥基因、相關(guān)毒力基因的檢測及SCCmec和MLST分子分型進(jìn)行研究，分析耐藥表型與耐藥基因之間、不同分子分型與毒力基因之間的相關(guān)性，為新疆地區(qū)規(guī)?；膛雠R床合理用藥和保障牛奶產(chǎn)品的安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Baird-Parker培養(yǎng)基、BHI液體培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌(E.coli) DH5α菌種由本實驗室保存；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、pMD19-T載體、DNA Marker均購自TaKaRa公司；生化鑒定管購自杭州濱和微生物試劑有限公司；抗菌藥物紙片購自杭州微生物試劑有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自諾維森(北京)生物科技有限公司。

1.2 樣本采集

2014—2016年從新疆五家渠、石河子、塔城、伊犁、烏魯木齊、阿克蘇、喀什地區(qū)的15個規(guī)?；膛龉膊杉R床型乳房炎和子宮內(nèi)膜炎臨床樣品337份。采用蘭州隱性乳房炎檢測法(LMT)檢測乳樣[14]，根據(jù)臨床型子宮內(nèi)膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[15]收集樣品，乳樣采集通過溫水清洗乳房并使用75%酒精棉球?qū)θ轭^進(jìn)行消毒處理，收集第3把奶后的奶樣。子宮內(nèi)膜炎樣品通過直腸把握子宮直接采樣法收集，放于滅菌的試劑管中，置于冰盒中，運送至實驗室進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.3 SA的分離鑒定

將采集的奶牛乳樣用接種環(huán)接種于Baird-Parker培養(yǎng)基，子宮內(nèi)膜炎樣品用棉簽涂布于Baird-Parker培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12～48 h。挑取具有典型特征的單菌落，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。對純化菌進(jìn)行涂片、革蘭染色、鏡檢，然后隨機選取分離株用SA成套生化鑒定管測定其生化反應(yīng)特性；根據(jù)GenBank中已公布的SA 16S rRNA的序列設(shè)計通用引物，對SA分離株進(jìn)行16S rRNA序列比對分析，鑒定分離株為SA。將分離的SA在BHI肉湯中37 ℃培養(yǎng)24 h，取500 μL所得新鮮菌液加入到500 μL 40%甘油中，振蕩混合均勻制成20%甘油菌，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用無菌接種環(huán)挑取單個菌落接種至無菌LB培養(yǎng)液，于37 ℃振蕩過夜，取1.5 mL細(xì)菌培養(yǎng)液于無菌EP管內(nèi)在12 000 r·min-1下高速離心，去掉上清液，余下操作步驟按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明進(jìn)行。DNA提取結(jié)束后，4 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后在凝膠成像系統(tǒng)上成像。準(zhǔn)備好的DNA模板于-20 ℃保存，用于耐藥基因、毒力基因檢測和基因分型研究。

1.4 SA新疆流行株的藥物敏感性測定

用無菌接種環(huán)挑取單個菌落，接種于LB培養(yǎng)液于37 ℃培養(yǎng)20～24 h，再用滅菌生理鹽水將細(xì)菌濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，?00 μL均勻涂布于MHA培養(yǎng)基，涂布均勻后貼上環(huán)丙沙星、苯唑西林、氯霉素、甲氧嘧啶、左氟沙星、青霉素、紅霉素、四環(huán)素、頭孢西叮、呋喃妥因、利福平、替考拉寧、克林霉素、慶大霉素、氟苯尼考、萬古霉素、利耐唑胺17種藥敏紙片，用鑷子輕壓紙片使其與培養(yǎng)基表面緊密接觸。放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h后測量抑菌圈直徑，依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.5 MRSA新疆流行株的篩選與鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)[16]將在藥敏試驗中頭孢西叮的抑菌圈直徑小于或等于21 mm的SA篩選出來，進(jìn)一步通過PCR方法擴增mecA來確定MRSA陽性菌。

1.6 SA新疆流行株耐藥基因的檢測

采用多重PCR[17]方法對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因(msrA、msrB)、紅霉素類耐藥基因(ermA、ermC)、乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因(vatA、vatB、vatC)、氨基糖苷類耐藥基因(aacA-D)、四環(huán)素類耐藥基因(tetk、tetm)、林可胺類耐藥基因(linA)、氯霉素類耐藥基因(FexA、FexB)、惡唑烷酮類耐藥基因(cfr、optrA)、萬古霉素類耐藥基因(VgaA、VgaC)進(jìn)行檢測。

1.7 SA新疆流行株毒力基因的檢測

所有分離株通過多重PCR[18]技術(shù)進(jìn)行毒力基因白細(xì)胞毒素基因(PVL、lukED、lukM)、溶血素基因(hla、hlb、hld)、表皮剝脫素基因(eta、etb)、中毒休克綜合征毒素基因(tst)、黏附素基因(edin)和新型編碼細(xì)胞壁錨定蛋白毒力基因(sasX)的檢測。

1.8 SA流行株的SCCmecA和MLST分型

通過多重PCR方法[19]對MRSA進(jìn)行SCCmec的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd、Ⅴ 8個主要的型和亞型的檢測，擴增的產(chǎn)物送至北京華大公司測序，然后按照文獻(xiàn)[20]描述進(jìn)行多位點序列分析(MLST)分型方法，根據(jù)每個菌株的等位基因和ST型從數(shù)據(jù)庫(http://saureus.beta.mlst.net/)獲得，來確定菌株的基因型。

1.9 引物

本研究中所用的主要耐藥基因、毒力基因、SCCmec分型及MLST分型的引物設(shè)計如表1。

2 結(jié) 果

2.1 SA新疆流行株的分離與鑒定

從新疆15個不同的牛場采集了337份樣品，其中乳樣207份，子宮內(nèi)膜炎樣品130份，共分離到155株SA，乳樣分離出118株，占57.0%(118/207)，子宮內(nèi)膜炎樣品分離出37株，占28.5%(37/130)，其中MSSA有133株，占85.8%(133/155)，MRSA有22株，并且22株菌的mecA基因檢測均為陽性。MRSA流行株占14.2%(22/155)。

2.2 SA新疆流行株的抗生素敏感試驗

155株SA分離株中，133(85.8%)株甲氧西林敏感型SA(MSSA)，22(14.2%)株MRSA，所有菌株均未檢出萬古霉素、利奈唑胺的耐藥表型，MSSA菌株對青霉素、紅霉素、甲氧嘧啶、四環(huán)素的耐藥率相對較高，對利福平、替考拉寧的耐藥率較低；MRSA菌株對青霉素、頭孢西叮、四環(huán)素、克林霉素的耐藥率相對較高，對環(huán)丙沙星、左氟沙星、呋喃妥因的耐藥率較低(表2)，利福平耐藥表型未檢出。相比來說，MSSA菌株對抗菌藥物的耐藥率普遍比MRSA菌株的耐藥率低，且MRSA和MSSA對抗菌藥物的耐藥菌株分布也不同(圖1)。

表1試驗中用到的引物

Table1Primersusedinthisstudy

基因種類和名稱Genetypeandname序列(5'→3')Nucleotidesequence擴增長度/bpSizeofamplifiedproduct退火溫度/℃Annealingtemperature16SrRNAF1:GTAGGTGGCAAGCGTTACCF2:CGCACATCAGCGTCAG22959耐藥基因ResistancegenesmecAF1:GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAAF2:CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA31055msrAF1:GGCACAATAAGAGTGTTTAAAGGF2:AAGTTATATCATGAATAGATTGTCCTGTT94050msrBF1:TATGATATCCATAATAATTATCCAATCF2:AAGTTATATCATGAATAGATTGTCCTGTT59550ermAF1:AAGCGGTAAACCCCTCTGAF2:TTCGCAAATCCCTTCTCAAC19055ermCF1:AATCGTCAATTCCTGCATGTF2:TAATCGTGGAATACGGGTTTG29955vatAF1:TGGTCCCGGAACAACATTTATF2:TCCACCGACAATAGAATAGGG26855vatBF1:GCTGCGAATTCAGTTGTTACAF2:CTGACCAATCCCACCATTTTA13655vatCF1:AAAATCGATGGTAAAGGTTGGCF2:AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC46755aacA-DF1:TAATCCAAGAGCAATAAGGGCF2:GCCACACTATCATAACCACTA22755tetkF1:GTAGCGACAATAGGTAATAGTF2:GTAGTGACAATAAACCTCCTA36055tetmF1:AGTGGAGCGATTACAGAAF2:CATATGTCCTGGCGTGTCTA15855linAF1:GGTGGCTGGGGGGTAGATGTATTAACTGGF2:GCTTCTTTTGAAATACATGGTATTTTTCGA32357FexAF1:TTGGGAAGAATGGTTCAGGGF2:ATCGGCTCAGTAGCATCACG97750FexBF1:TTCCCACTATTGGTGAAAGGATF2:GCAATTCCCTTTTATGGACGTT75049cfrF1:TAAGAAGTAATAATGAGCPHF2:TATAGAAAGTCTACGAGG51849optrAF1:GCACCAGACCAATACGATACAAF2:TCCTTCTTAACCTTCTCCTTCTCA79457VgaAF1:ATGAAAATATTGTTAGAGGF2:AGACATGTCCTTAAAGTGATTC159449VgaCF1:CGTATGCCCAGAGTGAGF2:GAGTGCTTCCGTATCCA107355

基因種類和名稱Genetypeandname序列(5'→3')Nucleotidesequence擴增長度/bpSizeofamplifiedproduct退火溫度/℃Annealingtemperature毒力基因VirulencegenesPVLF1:ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCAF2:GCATCAASTGTATTGGACATGATCCA43355lukEDF1:TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAGF2:TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA26952lukMF1:TGGATGTTACCTATGCAACCTACF2:GTTCGTTTCCATATAATGAATCACTAC78058HlaF1:CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTGF2:CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT20958hlbF1:GTGCACTTACTGACAATAGTGCF2:GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT30956hldF1:AGAATTTTTATCTTAATTAAGGAAGGAGTGF2:TTAGTGAATTTGTTCACTGTGTCGA11154etaF1:ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGTF2:TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC19057etbF1:CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTACF2:GTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC61255tstF1:TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACTF2:TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT18057edinF1:GAAGTATCTAATACTTCTTTAGCAGCF2:TCATTTGACAATTCTACACTTCCAAC62558sasXF1:ATGAAGAGAAAACTCACAGCF2:ATTAGACCATTTAGCATCATCA34353SCCmec分型基因SCCmectypegenesSCCmecⅠF1:GCTTTAAAGAGTGTCGTTACAGGF2:GTTCTCTCATAGTATGACGTCC61353SCCmecⅡF1:CGTTGAAGATGATGAAGCGF2:CGAAATCAATGGTTAATGGACC39853SCCmecⅢF1:CCATATTGTGTACGATGCGF2:CCTTAGTTGTCGTAACAGATCG28053SCCmecⅣaF1:GCCTTATTCGAAGAAACCGF2:CTACTCTTCTGAAAAGCGTCG77653SCCmecⅣbF1:TCTGGAATTACTTCAGCTGCF2:AAACAATATTGCTCTCCCTC49353SCCmecⅣcF1:ACAATATTTGTATTATCGGAGAGCF2:TTGGTATGAGGTATTGCTGG20053SCCmecⅣdF1:CTCAAAATACGGACCCCAATACAF2:TGCTCCAGTAATTGCTAAAG88153SCCmecⅤF1:GAACATTGTTACTTAAATGAGCGF2:TGAAAGTTGTACCCTTGACACC32553

基因種類和名稱Genetypeandname序列(5'→3')Nucleotidesequence擴增長度/bpSizeofamplifiedproduct退火溫度/℃AnnealingtemperatureMLST分型基因MLSTtypegenesaroF1:ATCGGAAATCCTATTTCACATTCF2:GGTGTTGTATTAATAACGATATC45652glpF1:CTAGGAACTGCAATCTTAATCCF2:TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC46554gmkF1:ATCGTTTTATCGGGACCATCF2:TCATTAACTACAACGTAATCGTA42952ptaF1:GTTAAAATCGTATTACCTGAAGGF2:GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA47454tpiF1:TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAAF2:TTTGCACCTTCTAACAATTGTAC40254yqiF1:CAGCATACAGGACACCTATTGGCF2:CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC51659arcF1:TTGATTCACCAGCGCGTATTGTCF2:AGGTATCTGCTTCAATCAGCG45655

表2MRSA與MSSA對抗菌藥物的耐藥率

Table2DrugresistanceratesoftheMRSAandMSSA

抗菌藥物AntimicrobialdrugsMSSA(n=133)MRSA(n=22)耐藥株數(shù)(n)Resistant(n)耐藥率/%Resistantrate耐藥株數(shù)(n)Resistant(n)耐藥率/%Resistantrate青霉素Penicillin(PEN)12291.722100苯唑西林Oxacillin(OXA)118.3940.9頭孢西叮Cefoxitin(FOX)1410.51986.4慶大霉素Gentamicin(GEN)139.81254.5利福平Rifampicin(RIF)32.300四環(huán)素Tetracycline(TCY)4433.11777.3紅霉素Erythromycin(ERY)5742.91359.1氯霉素Chloroamphenicol(CHL)3224.1731.8氟苯尼考Florfenicol(FFC)1511.3627.3萬古霉素Vancomycin(VAN)0000替考拉寧Teicoplanin(TEC)75.3522.7甲氧嘧啶Trimethoprim(TMP)5037.61463.6環(huán)丙沙星Ciprofloxacin(CIP)3425.6418.2左氟沙星Levofloxacin(LVX)2317.1418.2呋喃妥因Furadantin(NIT)2115.8418.2克林霉素Clindamycin(CLI)3123.31777.3利奈唑胺Linezolid(LNZ)0000

圖1 MSSA 和MRSA對抗菌藥物的耐藥菌株分布Fig.1 Distribution of resistant strains on antimicrobial in MSSA and MRSA

2.3 SA新疆流行株耐藥基因檢測

所有菌株均未檢測到惡唑烷酮類耐藥基因(cfr、optrA)、萬古霉素類耐藥基因(VgaA、VgaC)，其中MSSA菌株中l(wèi)inA(42.1%)、tetm(40.6%)和ermC(30.8%)檢出率較高，MRSA菌株中mecA(100%)、linA(90.9%)、ermC(72.7%)和VatC(72.7%)檢出率較高，多重PCR檢測到九種耐藥基因的特征性條帶(圖2)。除了四環(huán)素類耐藥基因tetk只在MSSA菌株中檢出，相比之下，MRSA的其他耐藥基因檢出率明顯高于MSSA菌株中耐藥基因的檢出率(表3)。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1.耐藥基因msrB、FexA； 2.耐藥基因ermC；3.耐藥基因aacA-D、tetk；5.耐藥基因mecA、tetm、VatC；6.耐藥基因linA；4、7.陰性對照M. DL2000 DNA marker;1. Resistant gene msrB, FexA; 2. Resistant gene ermC; 3. Resistant gene aacA-D, tetk; 5. Resistant gene mecA, tetm, VatC; 6. Resistant gene linA; 4,7.Negative control圖2 耐藥基因的PCR擴增Fig.2 Amplification of resistant genes by PCR

表3MRSA與MSSA對耐藥基因的分布率

Table 3 Distributing rates of antimicrobial genes in the MRSA and MSSA strains %(株)

2.4 SA新疆流行株毒力基因的檢測

SA新疆流行株檢出的主要毒力基因為白細(xì)胞毒素基因(lukED)、溶血素基因(hla、hlb、hld)和中毒休克綜合征毒素基因tst，其中溶血素基因(hla、hlb、hld)在MSSA菌株中分布率較高，毒力基因lukED和tst在MRSA中分布率較高(圖3)，可見，不同的毒力基因在SA中的分布有所差異，在MSSA菌株和MRSA菌株中的分布也有所差異(表4)。

表4MRSA與MSSA菌株毒力基因攜帶率

Table 4 Distributing rates of toxin genes in the MRSA and MSSA strains %(株)

圖3 MRSA與MSSA菌株毒力基因分布Fig.3 Distributing of toxin genes in the MRSA and MSSA strains

2.5 SA流行株SCCmecA分型

所有菌株中主要檢出的有SCCmecⅠ和SCCmecⅣa兩種分型，多重PCR檢測到兩種不同特征性條帶(圖4)，SCCmecⅡ、SCCmecⅢ和SCCmecⅤ均未檢出，在MSSA中未檢測到任何SCCmec型，MRSA中SCCmecⅠ和SCCmecⅣa的檢出率分別為77.3%(17/22)和22.7%(5/22)其中SCCmecⅠ為MRSA的主要流行株。

2.6 SA新疆流行株MLST分型

155株SA共檢測出14種ST型，MSSA菌株檢出ST188、ST584、ST9、ST805、ST2139、ST1、ST2700、ST903、ST2454、ST2990、ST63、ST X 12種ST型，ST9為主要流行株，其中有一株菌在MLST數(shù)據(jù)庫中輸入7個看家基因的等位基因后未查得所對應(yīng)的ST型，假定其為ST X型，7種看家基因經(jīng)凝膠電泳得到7種不同特征的條帶(圖5)。MRSA菌株檢出ST188、ST9、ST968、ST2139、ST1、ST2700、ST2373、ST63 8種不同ST型，ST1為主要流行株。此外，不同ST型菌株所攜帶的毒力基因、抗性基因、SCCmec型也存在差異(表5)，并且不同ST型攜帶耐藥基因和毒力基因的多重性也不同(圖6)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1、3、7、9、10、12、15. SCCmecⅠ型；4、14、16.SCCmecⅣa型；2、5、6、8、11、13、17. 陰性對照M. DNA marker DL2000; 1, 3, 7, 9, 10, 12, 15. SCCmecⅠtype; 4, 14, 16. SCCmecⅣa type; 2, 5, 6, 8, 11, 13, 17. Negative control圖4 SCCmec分型結(jié)果Fig.4 The results of SCCmec genotyping

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；其他條帶為7種看家基因M. DL2000 DNA marker; The other strips are 7 housekeeping genes 圖5 MLST分型電泳圖Fig.5 PCR electrophoretogram of MLST genotyping

S.甲氧西林敏感SA；R.耐甲氧西林SA；1V、2V、3V. 攜帶1、2、3種毒力基因；1R、2R、3R、4R、5R、6R. 攜帶1、2、3、4、5、6種耐藥基因S. MSSA; R. MRSA; 1V, 2V, 3V. Carrying one, two, three kinds of virulence genes; 1R, 2R, 3R, 4R, 5R, 6R. Carrying one, two, three, four, five, six kinds of resistant genes圖6 ST分型與耐藥、毒力基因多重性的分布Fig.6 Distribution of the ST types and resistant, toxin genes multiplicity

3 討 論

SA是引起人畜疾病的最重要的病原菌，也是引起人類食物中毒的四大食源性病原菌之一[21-22]。在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，SA可引起奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎，成為奶牛養(yǎng)殖業(yè)防控最難的病原菌，嚴(yán)重阻礙奶牛業(yè)持續(xù)、快速、健康發(fā)展[23]。本研究通過對新疆不同地區(qū)規(guī)?；霾杉?37份樣品分離鑒定發(fā)現(xiàn)，在分離出的155株SA中，MSSA(85.8%)是引起奶牛感染性疾病的主要流行株，MRSA(14.2%)相比MSSA，多重耐藥更加明顯。在藥敏試驗中發(fā)現(xiàn)，MSSA對頭孢西叮的耐藥率為10.5%，MRSA對頭孢西叮的耐藥率為86.4%，可以看出并不是對頭孢西叮耐藥的金黃色葡萄球菌一定是MRSA，依據(jù)耐藥表型來判斷MRSA在一定程度上可以作為一種標(biāo)準(zhǔn)，但不是絕對的“金標(biāo)準(zhǔn)”?？赡苁怯捎诨蚪閷?dǎo)的作用較弱，也可能受環(huán)境因素(如生長溫度、培養(yǎng)時間等)的影響，從而干擾紙片法檢測的結(jié)果。因此需要通過檢測mecA基因進(jìn)一步鑒定。MRSA產(chǎn)生的耐藥表型比MSSA多，但所檢出的耐藥基因與其耐藥表型不完全對應(yīng)，表型敏感卻含有耐藥基因，可能與其他耐藥機制(如生物膜生成)有關(guān)，菌株表型耐藥卻未檢測到相關(guān)耐藥基因，可能是該耐藥基因未被激活，提示這些菌株雖然攜帶耐藥基因，可能這些耐藥基因并未表達(dá)，但作為“儲存庫”在一定條件下可轉(zhuǎn)化為耐藥菌株，可以通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、耐藥島使SA獲得耐藥，在細(xì)菌之間傳播，不僅具有潛在的耐藥特性，并且能夠使耐藥基因蔓延擴散，因此這類菌株在SA耐藥性傳遞和流行中可能具有重要的作用。研究表明SCCmecⅢ型菌株攜帶氨基糖苷類耐藥基因及四環(huán)素耐藥基因的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子，如pT181質(zhì)粒和Tn554轉(zhuǎn)座子[24]，因此可見對于多重耐藥的MRSA更多可能的是通過介導(dǎo)的耐藥質(zhì)粒隨移動遺傳元件在細(xì)菌間發(fā)生水平傳播。

毒力基因編碼的毒力因子是SA 致病的分子基礎(chǔ)。本研究對SA新疆流行株毒力基因檢測結(jié)果顯示，同為MRSA或MSSA的不同株會攜帶多種不同的毒力基因，如MRSA菌株可同時攜帶毒力基因hld、lukED和tst；不同毒力基因的分布也有差異，如本試驗中通過MLST分型得到的ST2373菌株只攜帶了毒力基因tst，其他的毒力基因沒有分布，提示SA的毒力差異不僅表現(xiàn)在菌株之間，還可能與不同菌株來源、遺傳背景以及宿主因素的影響關(guān)系密切。有研究報道，SA菌株獲得耐藥的同時伴隨毒力因子的改變，會使毒力因子表達(dá)降低[25-26]。本研究中，MSSA菌株溶血素毒力基因的檢出率稍高于MRSA，但并無顯著差異，而MRSA菌株對白細(xì)胞毒素基因和中毒休克綜合征毒素基因的檢出率高于MSSA，可能是MRSA在獲得多重耐藥的同時發(fā)生了補償性突變，抵消了溶血素毒力因子，從而降低了溶血素毒力因子的檢出率。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，不同SCCmec基因型其耐藥特性及地域分布存在著明顯的差異。mecA基因位于可移動元件SCCmec上[24，27-29]。因此也驗證了對于不攜帶mecA基因的MSSA菌株未檢出SCCmec基因型的結(jié)果。研究表明，通常認(rèn)為SCCmecⅠ、SCCmecⅡ、SCCmecⅢ為醫(yī)院相關(guān)性MRSA，SCCmecⅣ或SCCmecⅤ為社區(qū)相關(guān)性MRSA[30]。本研究中分離到SCCmecⅠ和SCCmecⅣa兩種型，其中SCCmecⅠ的檢出率較高，SCCmecⅠ型MRSA可能通過牛場養(yǎng)殖工人感染后由醫(yī)院途徑在人畜中傳播，SCCmecⅣa型MRSA可能通過環(huán)境在人畜間傳播，因此切斷病原菌在人源-動物源之間的傳播對于人MRSA的感染至關(guān)重要。

近年來，多位點測序分型(MLST)技術(shù)越來越多被用于細(xì)菌大規(guī)模的流行病學(xué)研究，一些新的ST型(如ST2816、ST772)以及在人畜共存的ST型(如ST398)被相繼報道[31-33]。在本研究中，155株SA中檢出12種ST型，其中MSSA菌株中的ST型比MRSA菌株的ST型多。ST1和ST9作為檢出率較大的兩種型分布在不同的SA中，目前已有研究報道發(fā)現(xiàn)，ST9可以在不同種屬的動物源、人源、食物源中分離出[34]。本研究還檢測出了一種新的假定ST X基因型，該基因型是否在人-畜間交叉?zhèn)鞑ド行柽M(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果提示，SA在分子水平上存在著人-奶牛-環(huán)境之間傳播擴散的較大風(fēng)險。相對于多重耐藥的MRSA菌株來說，在引起奶牛臨床感染的SA中大多數(shù)是MSSA，而MSSA在耐藥性、毒力及水平傳播上同樣占有重要的地位。因此，開展奶牛SA流行株耐藥特性、毒力基因及分子分型研究具有重要理論價值和實踐意義。

4 結(jié) 論

新疆地區(qū)奶牛源金黃色葡萄球菌中主要流行株為甲氧西林敏感型，但耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性更強，且毒力基因分布多樣，ST9為甲氧西林敏感型金黃色葡萄球菌流行株的主要基因型，ST1-SCCmecⅠ為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌流行株的主要基因型。

[1] GENG W J, YANG Y H, WU D J, et al. Molecular characteristics of community-acquired, methicillin-resistantStaphylococcusaureusisolated from Chinese children[J].FEMSImmunolMedMicrobiol, 2010, 58(3): 356-362.

[2] ASIIMWE B B, BALDAN R, TROVATO A, et al. Prevalence and molecular characteristics ofStaphylococcusaureus, including methicillin resistant strains, isolated from bulk can milk and raw milk products in pastoral communities of South-West Uganda[J].BMCInfectDis, 2017, 17: 422.

[3] THAPALIYA D, DALMAN M, KADARIYA J, et al. Characterization ofStaphylococcusaureusin goose feces from state parks in Northeast Ohio[J].EcoHealth, 2017, 14(2): 303-309.

[4] 潘引君, 謝玲麗, 任志華, 等. 醫(yī)院與社區(qū)獲得性金黃色葡萄球菌耐藥性分析[J]. 職業(yè)與健康, 2014, 30(7): 898-900.

PAN Y J, XIE L L, REN Z H, et al. Analysis on drug resistance of hospital-acquired and community-acquiredStaphylococcusaureus[J].OccupationandHealth, 2014, 30(7): 898-900. (in Chinese)

[5] JENSEN S O, LYON B R. Genetics of antimicrobial resistance inStaphylococcusaureus[J].FutureMicrobiol, 2009, 4(5): 565-582.

[6] SUN W J, CHEN H B, LIU Y D, et al. Prevalence and characterization of heterogeneous vancomycin-intermediateStaphylococcusaureusisolates from 14 cities in China[J].AntimicrobAgentsChemother, 2009, 53(9): 3642-3649.

[7] 楊 峰, 王旭榮, 李新圃, 等. 牛源金黃色葡萄球菌耐藥性與相關(guān)耐藥基因和菌株毒力基因的相關(guān)性研究[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2016, 46(2): 247-252.

YANG F, WANG X R, LI X P, et al. Study on relationship between resistance and resistance-and virulence-related genes inStaphylococcusɑureusfrom bovine mastitis cases[J].ChineseVeterinaryScience, 2016, 46(2): 247-252. (in Chinese)

[8] MOMTAZ H, HAFEZI L. Meticillin-resistantStaphylococcusaureusisolated from Iranian hospitals: virulence factors and antibiotic resistance properties[J].BosnJBasicMedSci, 2014, 14(4): 219-226.

[9] 張蓉映, 朱健銘, 翁幸鐾. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌毒力與耐藥基因分型研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2014, 24(14): 3384-3385, 3388.

ZHANG R Y, ZHU J M, WENG X B. Genotyping method depending on virulence factors and drug-resistant genes in methicillin-resistantStaphylococcusaureus[J].ChineseJournalofNosocomiology, 2014, 24(14): 3384-3385, 3388. (in Chinese)

[10] MALACHOWA N, DELEO F R. Mobile genetic elements ofStaphylococcusaureus[J].CellMolLifeSci, 2010, 67(18): 3057-3071.

[11] MAGRO G, BIFFANI S, MINOZZI G, et al. Virulence genes ofS.aureusfrom dairy cow mastitis and contagiousness risk[J].Toxins, 2017, 9(6): 195.

[12] UDO E E, AL-SWEIH N, DHAR R, et al. Surveillance of antibacterial resistance inStaphylococcusaureusisolated in Kuwaiti hospitals[J].MedPrincPract, 2008, 17(1): 71-75.

[13] KEHRENBERG C, CUNY C, STROMMENGER B, et al. Methicillin-resistant and-susceptibleStaphylococcusaureusstrains of clonal lineages ST398 and ST9 from swine carry the multidrug resistance genecfr[J].AntimicrobAgentsChemother, 2009, 53(2): 779-781.

[14] 郝維聰. 奶牛隱性乳房炎的檢測及預(yù)防[J]. 湖北畜牧獸醫(yī), 2016, 37(5): 25-26.

HAO W C. Detection and prevention of mastitis of dairy cow[J].HubeiJournalofAnimalandVeterinarySciences, 2016, 37(5): 25-26. (in Chinese)

[15] 秦佳晨, 曹桂彬, 王新莊, 等. 牛子宮內(nèi)膜炎臨床診斷及采樣方法的研究[C]//第五屆中國牛業(yè)發(fā)展大會論文集. 濱州: 中國畜牧業(yè)協(xié)會, 2010: 6.

QIN J C, CAO G B, WANG X Z, et al. Clinical diagnosis and sampling method of endometritis in cattle[C]//National Cattle Industry Association. Binzhou: China Animal Agriculture Association, 2010: 6. (in Chinese)

[16] 張曉平. 金黃色葡萄球菌耐藥機制與分子流行病學(xué)研究[D]. 揚州: 揚州大學(xué), 2012.

ZHANG X P. Antimicrobial resistance and molecular epidemiology ofStaphylococcusaureus[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2012. (in Chinese)

[17] DORMANESH B, SIROOSBAKHAT S, KHODAVERDI D E, et al. Methicillin-resistantStaphylococcusaureusisolated from various types of hospital infections in pediatrics: panton-valentine leukocidin, staphylococcal chromosomal cassette mecSCCmecphenotypes and antibiotic resistance properties[J].JundishapurJMicrobiol, 2015, 8(11): e11341.

[18] STEPHAN R, ANNEMüLLER C, HASSAN A A, et al. Characterization of enterotoxigenicStaphylococcusaureusstrains isolated from bovine mastitis in north-east Switzerland[J].VetMicrobiol, 2001, 78(4): 373-382.

[19] KHEMIRI M, AKROUT ALHUSAIN A, ABBASSI M S, et al. Clonal spread of methicillin-resistantStaphylococcusaureus-t6065-CC5-SCCmecV-agrII in a Libyan hospital[J].JGlobAntimicrobResist, 2017, 10: 101-105.

[20] ENRIGHT M C, DAY N P J, DAVIES C E, et al. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones ofStaphylococcusaureus[J].JClinMicrobiol, 2000, 38(3): 1008-1015.

[21] GOSTEV V, KRUGLOV A, KALINOGORSKAYA O, et al. Molecular epidemiology and antibiotic resistance of methicillin-resistantStaphylococcusaureuscirculating in the Russian federation[J].InfectGenetEvol, 2017, 53: 189-194.

[22] OU Q, ZHOU J, LIN D, et al. A large meta-analysis of the global prevalence rates ofS.aureusand MRSA contamination of milk[J].CritRevFoodSciNutr, 2017, 7: 1-16.

[24] XIAO M, WANG H, ZHAO Y, et al. National surveillance of methicillin-resistantStaphylococcusaureusin China highlights a still-evolving epidemiology with 15 novel emerging multilocus sequence types[J].JClinMicrobiol, 2013, 51(11): 3638-3644.

[25] COLLINS J, RUDKIN J, RECKER M, et al. Offsetting virulence and antibiotic resistance costs by MRSA[J].ISMEJ, 2010, 4(4): 577-584.

[26] 童 俊, 占志平. 金黃色葡萄球菌毒力基因檢測及分子分型研究[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2015, 35(1): 46-50.

TONG J, ZHAN Z P. Study of the virulence genes and molecular characteristics ofStaphylococcusaureusstrains[J].ChineseJournalofMicrobiologyandImmunology, 2015, 35(1): 46-50. (in Chinese)

[27] VANDENDRIESSCHE S, VANDERHAEGHEN W, LARSEN J, et al. High genetic diversity of methicillin-susceptibleStaphylococcusaureus(MSSA) from humans and animals on livestock farms and presence of SCCmecremnant DNA in MSSA CC398[J].JAntimicrobChemother, 2013, 69(2): 355-362.

[28] 閆 虹, 茍建軍, 張志堅, 等. 河南地區(qū)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec分型與耐藥性分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2016, 26(3): 512-515.

YAN H, GOU J J, ZHANG Z J, et al. Antibiotic resistance and staphylococcal chromosomal cassettemectyping of methicillin-resistantStaphylococcusaureusisolates in Henan[J].ChineseJournalofNosocomiology, 2016, 26(3): 512-515. (in Chinese)

[29] 王 曉，俞 英. 中國北方奶牛金葡菌乳房炎感染現(xiàn)狀及耐藥性和流行類型研究進(jìn)展[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2015, 46(9): 1477-1488.

WANG X，YU Y. Infectious status of mastitis in dairy cattle induced byStaphylococcusaureusand its advances on epidemiological patterns and antimicrobial resistance in Northern China[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2015, 46(9): 1477-1488. (in Chinese)

[30] SAMUTELA M T, KALONDA A, MWANSA J, et al. Molecular characterisation of methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) isolated at a large referral hospital in Zambia[J].PanAfrMedJ, 2017, 26: 108.

[31] SONG Z, GU F F, GUO X K, et al. Antimicrobial resistance and molecular characterization ofStaphylococcusaureuscausing childhood pneumonia in Shanghai[J].FrontMicrobiol, 2017, 8: 455.

[32] XAVIER A R E O, ALMEIDA A C, SOUZA C N, et al. Phenotypic and genotypic characterization ofStaphylococcusaureusisolates in milk from flocks diagnosed with subclinical mastitis[J].GenetMolRes, 2017, 16(2): gmr16029709.

[33] LI T M, LU H Y, WANG X, et al. Molecular characteristics ofStaphylococcusaureuscausing bovine mastitis between 2014 and 2015[J].FrontCellInfectMicrobiol, 2017, 7: 127.

[34] DHUP V, KEARNS A M, PICHON B, et al. First report of identification of livestock-associated MRSA ST9 in retail meat in England[J].EpidemiolInfect, 2015, 143(14): 2989-2992.