王 涵，陳 燁，周榮艷,*，DUNN Ian，陳 輝，錫建中，張振紅

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071001；2. Roslin Institute (Edinburgh), Roslin, Midlothian EH25 9RG, Scotland)

骨骼重塑對(duì)于維持骨骼健康是非常重要的，產(chǎn)蛋后期蛋雞骨骼變脆，甚至發(fā)生骨折[1]，表明在該階段骨骼重塑出現(xiàn)異常。前期研究發(fā)現(xiàn)，在骨骼強(qiáng)度不同的產(chǎn)蛋后期蛋雞脛骨中胱硫醚β合酶(Cystathionine beta synthase，CBS)基因的表達(dá)水平存在顯著差異。結(jié)果表明，CBS在調(diào)節(jié)骨骼重塑中起著非常重要的作用[2-7]。CBS是轉(zhuǎn)硫途徑代謝中的一種5′磷酸吡哆醛依賴性酶，也是體內(nèi)同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)代謝的關(guān)鍵酶，催化絲氨酸和Hcy合成胱硫醚。CBS活性下降、基因表達(dá)水平下降和堿基突變均可引起血液中Hcy水平上升，表現(xiàn)為高同型半胱氨酸血癥(HHcy)，從而引發(fā)包括骨骼重塑異常和心血管疾病在內(nèi)的多種疾病[4,6,8]。

遺傳選擇和營養(yǎng)與管理水平顯著影響蛋雞的產(chǎn)蛋性能，蛋雞在產(chǎn)蛋期間需要大量的鈣以滿足蛋殼形成，同時(shí)隨著蛋雞日齡的增加，骨骼質(zhì)量會(huì)發(fā)生變化，如骨骼變脆等。蛋雞每產(chǎn)1枚蛋大約需要2.3 g鈣，相當(dāng)于其本身骨骼中鈣總量的10%[9]。產(chǎn)蛋后期蛋雞容易患骨質(zhì)疏松癥[1]。血漿中Hcy調(diào)節(jié)骨骼重塑，且與老年人骨骼膠原蛋白交聯(lián)比呈顯著相關(guān)，進(jìn)而影響骨骼質(zhì)量[3,5-7]，因此推測，CBS基因表達(dá)調(diào)控對(duì)產(chǎn)蛋后期雞骨骼重塑起著重要作用。人CBS基因外顯子1a和1b上游至少有2個(gè)富含GC的TATA less啟動(dòng)子(包含預(yù)測的轉(zhuǎn)錄元件Sp1、AP1和AP2等)[10]。人CBS基因5′調(diào)控區(qū)突變顯著降低了漢族人群先天性心臟病的易感性[11]。雞CBS基因定位于1號(hào)染色體上，全長大約28 kb，cDNA由18個(gè)外顯子組成，其中外顯子1不編碼氨基酸(數(shù)據(jù)來源于Ensemble數(shù)據(jù)庫http://www.ensembl.org/index.html)。啟動(dòng)子位于基因上游，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因表達(dá)起調(diào)控作用，目前尚未見雞CBS基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)報(bào)道。

本研究克隆雞CBS基因5′調(diào)控區(qū)序列，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其序列特征進(jìn)行分析，并采用雙熒光素酶報(bào)告基因確定雞CBS基因核心啟動(dòng)子區(qū)，預(yù)測了與骨骼重塑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取健康、正常產(chǎn)蛋的68周齡羅曼蛋雞16只，采集脛骨組織，并置于液氮中速凍后用于提取基因組DNA。

1.2 試驗(yàn)材料

DF-1細(xì)胞購于北京協(xié)和細(xì)胞資源庫；T4連接酶購于Promega公司；內(nèi)切酶KpnI和XhoI購于NEB公司； PCR克隆載體pSC-A-amp/kan試劑盒購于StrataClone公司；Taq酶、DNA marker購于Roche公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于Promega公司；Tris Base、EDTA、瓊脂糖、瓊脂粉、酵母提取物、NaCl、硼酸購于北京索萊寶科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、雞血清、胎牛血清、青鏈霉素、Lipofectamine LTX購于ThermoFisher公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組提取 脛骨組織勻漿后，采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取基因組總DNA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 下載Ensemble數(shù)據(jù)庫中CBS基因(1號(hào)染色體:109 704 963～109 732 461 bp，Gallus_gallus-4.0，2011)上游長度為2 000 bp的核苷酸序列，結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并在正反向引物5′端分別添加KpnI和XhoI酶切位點(diǎn)(表1，黑體加下劃線)和保護(hù)堿基(表1，用黑體表示)，引物信息見表1。

1.3.3 PCR擴(kuò)增和測序 以脛骨組織DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增總體積為20 μL：Faststart Taq buffer(10×) 2 μL，gDNA 1 μL，正向和反向引物(濃度為10 pmol·μL-1)分別為1 μL，F(xiàn)aststart Taq 0.2 μL，滅菌水14.8 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s～1 min， 30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收PCR產(chǎn)物并克隆到pSC-A-amp/kan載體上。經(jīng)酶切鑒定后，將陽性克隆送至華大基因公司測序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 利用生物信息分析軟件對(duì)蛋雞CBS基因5′-調(diào)控區(qū)序列進(jìn)行分析。CpG島預(yù)測采用CpG Island Search (http://cpgislands.usc.edu/)和MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/)；轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析采用Alibaba2 (http://www.gene-regulation.com)。

表1蛋雞CBS基因擴(kuò)增引物

Table1PrimersforamplifyingCBSgene

擴(kuò)增片段Amplifiedfragment引物名稱Nameofprimers引物序列(5'-3')Sequence片段長度/bpLengthoffragmentF1F1FF1RCGGGGTACCAGGCTTTGGGATGAGGAAGGGTTCACTCGAGGTTTACACCAAGCAGCCCAC890(-545～+345)F2F2FF1RCGGGGTACCTCCATCCCGATTAATATCCAGGTTCACTCGAGGTTTACACCAAGCAGCCCAC495(-150～+345)F3F3FF3RCGGGGTACCTCCAGCCCATCCATCCCGATTAATATCGTTCACTCGAGTTACGATTGGCTGCCACCAC349(-218～+131)F4F4FF3RCGGGGTACCGCCCATCCATCCCGATTAATATCGTTCACTCGAGTTACGATTGGCTGCCACCAC286(-155～+131)F5F4FF5RCGGGGTACCGCCCATCCATCCCGATTAATATCGTTCACTCGAGGGTGAGGTGGCGGCTCTC156(-155～+1)

1.3.5CBS基因缺失表達(dá)載體的構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI對(duì)pGL3-basic載體和PCR產(chǎn)物克隆載體分別進(jìn)行雙酶切，并回收酶切片段，用T4 DNA 連接酶連接載體和目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，鑒定為陽性的克隆經(jīng)測序驗(yàn)證后，提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒。

1.3.6 細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶活性分析 用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清+2%雞血清+100 U青鏈霉素)培養(yǎng)雞成纖維細(xì)胞系DF-1，細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h將1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)板底部覆蓋率達(dá)到80%～90%時(shí)，用Lipofectamine LTX (Life technologies)轉(zhuǎn)染缺失表達(dá)質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK(比例為1∶25)。轉(zhuǎn)染48 h后利用雙熒光素酶檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 雞CBS基因啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增

以脛骨基因組DNA為模板，利用F1F和F1R引物(表1)進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測得到特異性擴(kuò)增條帶(圖1)。測序結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致，說明成功擴(kuò)增獲得蛋雞CBS基因5′調(diào)控區(qū)。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 引物F1的PCR產(chǎn)物M. DNA marker; 1. PCR product amplified by F1圖1 雞CBS基因5′調(diào)控區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖 Fig.1 PCR agarose gel photograph of 5′ regulatory region of chicken CBS gene

2.2 雞CBS基因啟動(dòng)子區(qū)序列分析

將測序結(jié)果與UCSC數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)分析(圖2)，與1號(hào)染色體：109 058 488～109 059 378 bp區(qū)域同源性為99.7%，且包含一個(gè)GC含量為74.9%(CpG位點(diǎn)數(shù)為50)的CpG島(圖3)。CBS基因5′調(diào)控區(qū)序列堿基組成分析發(fā)現(xiàn)， A、T、C、G堿基含量分別為18.52%、12.79%、35.58%、33.11%，其中C+G含量為68.69%。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)CBS基因5′調(diào)控區(qū)包含54個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 雞CBS基因啟動(dòng)子區(qū)缺失表達(dá)載體構(gòu)建

以蛋雞脛骨總DNA為模板，對(duì)CBS基因5′調(diào)控區(qū)和不同缺失片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明獲得了與預(yù)期長度一致的擴(kuò)增片段(圖4A)。將獲得的目的片段和pGL3-basic連接后對(duì)鑒定為陽性的克隆進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果(圖4B)表明，所獲得的質(zhì)粒為包含預(yù)期片段大小的陽性克隆。

圖2 蛋雞CBS基因5′調(diào)控區(qū)序列與UCSC數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment of 5′ regulatory sequence of layer CBS gene with UCSC database

圖3 雞CBS基因5′調(diào)控區(qū)預(yù)測的CpG島Fig.3 The predicted CpG islands in 5′ regulatory region of chicken CBS gene

M1、M2. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；F1～F5. 分別為引物F1、F2、F3、F4、F5擴(kuò)增的目的片段M1, M2. DNA marker; F1-F5. Products amplified by primer F1, F2, F3, F4, F5圖4 不同缺失片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(A)和陽性克隆酶切鑒定(B)電泳圖譜Fig.4 Agarose gel photograph of different deletion fragments (A) and restriction enzyme digested positive clones (B)

2.4 雞CBS基因啟動(dòng)子區(qū)的鑒定

將獲得的各缺失表達(dá)載體與內(nèi)參載體pRL-TK進(jìn)行共轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后測定熒光素酶活性。結(jié)果表明,所有片段均具有啟動(dòng)子活性，但不同片段活性存在差異(圖5)，其中F4片段(-155～+131 bp)具有最高的轉(zhuǎn)錄活性，確定該片段為雞CBS基因的核心啟動(dòng)子區(qū)。

2.5 雞CBS基因核心啟動(dòng)子區(qū)序列分析

雞CBS基因核心啟動(dòng)子區(qū)序列長度為286 bp(-155～+131)，位于預(yù)測的CpG島內(nèi)。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果顯示(圖6)，CBS基因核心啟動(dòng)子區(qū)富含 GC(含量為67.8%)，有6個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)，1 個(gè)AP-2alpah、Egr-1和WT-1結(jié)合位點(diǎn)，且轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)存在重疊區(qū)。

A. 啟動(dòng)子區(qū)不同片段位置；B. 啟動(dòng)子區(qū)不同片段熒光素酶活性：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母代表差異極顯著(P<0.01)，相同字母代表差異不顯著(P>0.05)A. Positions of different fragments; B. Luciferase activities of different fragments: the different lower case letters indicate significant difference(P<0.05), the different upper case letters indicate extremely significant difference(P<0.01), the same letter indicate no significant difference(P>0.05)圖5 雞CBS基因啟動(dòng)子區(qū)不同片段的熒光素酶活性Fig.5 Luciferase activities of different fragments in promoter region of chicken CBS gene

圖6 雞CBS基因核心啟動(dòng)子預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)Fig.6 The putative transcription factor binding sites in promoter of chicken CBS gene

3 討 論

啟動(dòng)子在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄中起著十分重要的作用，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)豐度[12]。動(dòng)物核心啟動(dòng)子一般包含兩類，即具有典型TATA框和不含典型TATA框但富含轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)的高GC區(qū)域[13]。本研究成功克隆了雞CBS基因5′調(diào)控區(qū)890 bp序列，該區(qū)域不包含TATA框，但富含多個(gè)CpG位點(diǎn)的CpG島，與人的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)相似[9]。人CBS基因外顯子1a和1b上游至少有2個(gè)富含GC的TATA-less啟動(dòng)子(包含預(yù)測的轉(zhuǎn)錄元件Sp1、AP1和AP2等)。啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)易發(fā)生甲基化，高度甲基化的啟動(dòng)子通過阻礙轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或募集甲基CpG結(jié)合蛋白引起染色質(zhì)凝聚，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)[14]。研究證實(shí)，人CBS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與結(jié)腸直腸癌或胃腸癌發(fā)生相關(guān)[15-17]。在骨骼重塑過程中，甲基化對(duì)于骨組織細(xì)胞(成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞)的正常發(fā)育和功能起重要作用，成骨細(xì)胞分化通過與功能相關(guān)的Wnt和BMP信號(hào)通路相關(guān)基因啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)甲基化來調(diào)控基因表達(dá)，如硬骨素基因啟動(dòng)子高甲基化抑制基因表達(dá)；與破骨細(xì)胞形成相關(guān)的RANK/RANKL信號(hào)通路通過相關(guān)基因啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)高甲基化來抑制基因表達(dá)，如RANKL和OPG基因[18]。因此，雞CBS基因5′調(diào)控區(qū)CpG島的存在為研究其甲基化程度與基因表達(dá)水平以及骨骼代謝間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

本研究構(gòu)建了多個(gè)熒光素酶報(bào)告基因缺失載體，成功鑒定出雞CBS基因核心啟動(dòng)子位于-155～+131 bp區(qū)域， 且在該區(qū)域包含多個(gè)保守的轉(zhuǎn)錄因子(Sp1、Egr-1、WT-1等)結(jié)合位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)錄因子Sp1與啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)節(jié)PPARα的表達(dá)[19]。轉(zhuǎn)錄因子Egr-1調(diào)節(jié)小鼠骨骼的力學(xué)特性[20]。人CBS基因最小的啟動(dòng)子-1 bp(32 bp)中轉(zhuǎn)錄因子Sp1/Sp3、核因子Y和USF-1調(diào)控啟動(dòng)子基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性，單一Sp1/Egr-1結(jié)合位點(diǎn)是HepG2 細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄所必需的，且轉(zhuǎn)錄因子Sp1對(duì)其表達(dá)起著關(guān)鍵且不可替代的作用[9]。研究也表明，COL1A1 基因Sp1結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)與骨密度降低和骨折風(fēng)險(xiǎn)顯著增加相關(guān)[21-22]。因此，推測這些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)該基因表達(dá)起著重要調(diào)控作用，進(jìn)一步研究雞CBS基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子與基因表達(dá)水平以及骨骼質(zhì)量間的關(guān)系，并結(jié)合凝膠阻滯電泳、染色質(zhì)免疫沉淀等技術(shù)的研究，將為揭示CBS基因在骨骼組織中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了多個(gè)熒光素酶報(bào)告基因缺失載體，成功鑒定出雞CBS基因核心啟動(dòng)子位于-155～+131 bp區(qū)域， 且在該區(qū)域包含多個(gè)保守的轉(zhuǎn)錄因子(Sp1、Egr-1、WT-1等)結(jié)合位點(diǎn)，蛋雞CBS基因5′調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)特征與核心啟動(dòng)子的鑒定和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為研究該基因在骨骼中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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