半仿生法提取箬葉總黃酮的研究

龔乃超 鎖進猛 張浩 樂薇

摘要：以箬葉為模型中藥，采用正交試驗對箬葉總黃酮的半仿生法提取工藝進行了優(yōu)選。采用L9（3⁴）正交實驗設(shè)計表，以箬葉總黃酮提取得率為考察指標，考察了提取溫度、提取時間、料液比與乙醇體積分數(shù)對箬葉總黃酮提取得率的影響。結(jié)果表明：實驗得到的半仿生法提取箬葉總黃酮的最佳工藝條件為：提取溫度70℃、提取時間105min、料液比1： 30與乙醇體積分數(shù)80%，此時箬葉黃酮提取得率最高為2.26%。驗證性實驗表明半仿生提取法對比其他傳統(tǒng)提取方法，具有提取效率高、設(shè)備簡單、操作方便的優(yōu)點，可供在生產(chǎn)中試行。

關(guān)鍵詞：正交試驗;半仿生;箬葉;黃酮

中圖分類號：R282.2

文獻標識碼：A

文章編號：1674-9944（2018）6-0179-03

1引言

箬葉，又稱粽葉，主要生長在我國長江以南。箬葉清香、葉片寬大、耐儲存等特征使它成為端午時節(jié)的包粽子材料。經(jīng)醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，箬葉還具有清熱解毒，止血消腫，治療排尿困難等藥用價值，箬葉中含有豐富的黃酮類化合物、多糖、酚酸、蒽醌等生物活性成分，具有防腐、殺菌、抗癌、抗炎癥、抗?jié)?、抗腫瘤等多種作用顯著，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及日化用品等。故研究人員對于箬葉中化合物的提取分離備受重視，尤其是箬葉中的黃酮類化合物。但關(guān)于總黃酮的已有報道多采用的是熱浸法、超聲、微波法提取，該方法提取過程易使黃酮喪失天然活性。半仿生提取法是為生物制藥所設(shè)計的一種新型的植物提取工藝：模仿口服藥物在胃腸道的轉(zhuǎn)運過程，采用活性指導(dǎo)下的導(dǎo)向分離方法而保證被提取物的生物活性的一種新型提取方法。

2實驗儀器、材料及試劑

材料：箬葉（市售，產(chǎn)地湖北仙桃）;蕓香葉苷（HPLC≥99.5%，標準品）成都西亞化工股份有限公司。

儀器：酸度計（上海亞榮生化儀器廠）;磁力攪拌器（上海亞榮生化儀器廠）;KQ-100E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;SP752型紫外分光儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

3實驗方法

3.1箬葉黃酮含量的測定

3.1.1標準曲線的繪制

準確稱取蘆丁10mg溶于30%乙醇溶液中，定容至100mL （貯存于冰箱中，室溫下使用）。用移液管分別取O、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL于10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，使其混勻，放置6 min后加入10%硝酸鋁0.3mL。搖勻靜置6min后加入4mL4%氫氧化鈉，以30%乙醇定容至刻度，搖勻靜置10min后在波長510nm處測吸光度，參比為不加蘆丁標準品的溶液。以測定的吸光度A為縱坐標，蘆丁標準品濃度c為橫坐標，繪制標準曲線，并計算相關(guān)系數(shù)（r）。

3.1.2總黃酮得率的計算

將箬葉黃酮浸提液定容至100mL ，再準確移取2.00mL 按標準曲線的繪制方法加入各種試劑，以不加黃酮提取液的溶液為參比，在波長510nm處測定吸光度，并按下式計算總黃酮得率：

公式（1）中：f為總黃酮的濃度（mg/mL）;，m為箬葉粉末的質(zhì)量（g）;V為溶液的體積（mL ）; n為稀釋倍數(shù)。3.2 半仿生法提取箬葉總黃酮3.2.1 箬葉黃酮提取

根據(jù)半仿生實驗設(shè)計原則，模擬人體胃、小腸、大腸的體液pH值，用乙醇一水作為提取液，分別為0.9-1.5、7.6、8.3～8.5。

稱取1.00g已經(jīng)脫脂脫色的箬葉粉末，第1次提取：模擬人體胃pH值，用1mol/L的HC1調(diào)節(jié)pH值為2.0，分別在不同的時間、溫度、料液比和乙醇濃度下提取，過濾，保留濾液、濾渣。用濾渣第2次提?。耗M人體小腸pH值，用磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值為7.5，在同樣的時間、溫度、料液比和乙醇濃度下提取，過濾，保留濾液、濾渣。用濾渣第3次提?。耗M人體大腸pH值，用磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值為8.4，在同樣的時間、溫度、料液比和乙醇濃度下提取，過濾，保留濾液。合并3次提取液，定容至100mL。按前文方法測定黃酮含量。

3.2.2正交試驗設(shè)計

在粒度、提取工藝相同的條件下，考察提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）與乙醇體積分數(shù)（D）因素對箬葉黃酮提取得率的影響，采用L9 （3⁴）正交表進行試驗方案設(shè)計，實驗因素水平設(shè)計方案見表1。

4結(jié)果與討論

4.1蘆丁標準曲線繪制

按照蘆丁對照品濃度梯度與對應(yīng)的吸光度繪制標準曲線，如圖1 （f）所示，得回歸方程：A=10.974C+0.00009，R²=0.9994，式中：A為吸光度值，C為蘆丁的濃度（mg/mL）。

4.2不同因素對箬葉黃酮提取得率的影響

不同提取時間、時間比、料液比、提取溫度與乙醇體積分數(shù)對箬葉黃酮提取得率的影響，見圖1中（a）～（e）所示。

由圖1中（a）～（e）可知，箬葉黃酮提取得率受到提取溫度、時間與料液比等多種因素影響.其中提取溫度.時間與料液比均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而乙醇體積分數(shù)呈現(xiàn)先上升后不變，這是由于70%的乙醇對植物細胞壁的滲透作用最強，此時黃酮提取得率較大.進一步增加乙醇濃度，箬葉黃酮得率無明顯上升。時間比對提取得率的影響顯示在3：1：2是效果最好，由此說明酸堿性對植物細胞的破壁效應(yīng)明顯。

4.3正交試驗對箬葉黃酮提取得率的影響

4.3.1箬葉黃酮提取條件的確定

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，為進一步研究提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）與乙醇體積分數(shù)（D）四個因素對箬葉黃酮提取得率的影響進行考察，以確定半仿生法提取箬葉黃酮最佳工藝條件。本實驗采用L9 （3⁴）正交試驗，以箬葉黃酮提取得率為指標進行正交優(yōu)化實驗，實驗方案及結(jié)果如表2所示。通過SPSS-18軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

由表2中極差R來看，正交試驗所考察的4個因素對箬葉黃酮提取得率的影響程度為A>C>B>D。最佳的提取工藝為A2B2C3D3，即在提取溫度70℃、提取時間105min、料液比1：30以及乙醇體積分數(shù)80%時箬葉黃酮提取得率最高。

4.3.2正交試驗方差分析

由于正交表中所有的列都被因素占據(jù)了，沒有空白列，從而無法得到誤差的估計誤差，對于這種情況應(yīng)取各列偏差平方和中最小的近似當作誤差的估計，這里選用因素D操作壓力為誤差估計，方差分析結(jié)果見表3。

4.4驗證性實驗

利用SPSS-18軟件分析，由正交試驗數(shù)據(jù)得出

得率最高時的最佳工藝條件：提取溫度70℃、提取時間105min、料液比1：30與乙醇體積分數(shù)80%時，箬葉黃酮提取得率最大，并與傳統(tǒng)熱提取法、超聲提取法及微波提取法相比較，見表4。

不同提取方法對箬葉黃酮進行提取結(jié)果如表所示，超聲波提取法與微波提取法效果明顯優(yōu)于熱提取，同樣條件下半仿生提取法提取得率有所增加，但半仿生提取法采用的方式較為溫和，模擬人體吸收系統(tǒng)，提取的黃酮類化合物天然活性較高。

5結(jié)論與展望

本次實驗通過正交試驗最終確定影響箬葉黃酮提取得率的因素的主次順序為提取溫度>料液比>提取時間>乙醇體積分數(shù)，最佳提取條件參數(shù)組合為：提取溫度70℃、提取時間105min、料液比1：30與乙醇體積分數(shù)80%，在此最佳條件下，箬葉黃酮提取得率最高為2.26%。