倪黎綱+趙旭庭+王宵燕+劉鶴鳴+陳章言

摘要：通過冷PBS氣管灌洗法分離培養(yǎng)姜曲海豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM），進(jìn)行了PAM純度鑒定、細(xì)胞吞噬功能和存活率檢測。從健康20日齡仔豬，分離得到PAM。以10% RPMI-1640培養(yǎng)液對PAM進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)，用墨汁吞噬和免疫熒光檢測了PAM的吞噬功能和純度，比較凍存前和復(fù)蘇后細(xì)胞的活率和細(xì)胞吞噬功能，以獲得一批高純度的PAM，用于豬體外呼吸道疾病發(fā)病機(jī)理的研究。

關(guān)鍵詞：豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）；分離；培養(yǎng)；鑒定

中圖分類號： S858.286.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0163-03

通信作者：趙旭庭，碩士，教授，研究方向為地方畜禽遺傳資源的保護(hù)與利用。E-mail：825587062@qq.com。肺泡巨噬細(xì)胞是機(jī)體抵御外來微生物侵襲肺臟的第一道防線，一直是研究肺部抗感染模型的重要細(xì)胞類型[1]。豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages，PAM）是豬肺臟重要的功能細(xì)胞，它不僅可吞噬侵入肺臟的粒子，參與肺臟的防御和免疫，而且還能分泌大量的生物活性物質(zhì)，維持肺臟和機(jī)體正常的生理活動[2]。目前，肺泡巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)以小動物，如大鼠、小鼠、豚鼠居多，國內(nèi)關(guān)于豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法的報道很少。豬肺泡巨噬細(xì)胞屬于不繁殖細(xì)胞群，為多代培養(yǎng)，難以在體外長期生存[3]。隨著體外分離細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，巨噬細(xì)胞的提取方法有多種，又由于研究目的不同，在體內(nèi)提取細(xì)胞的部位也不盡相同[4-5]，巨噬細(xì)胞在肝、腦等實質(zhì)器官以及腹腔等空腹部位以不同的形式分布，不少文獻(xiàn)報道從多種組織器官中分離和純化巨噬細(xì)胞[6]。為獲得存活率高，純度高，吞噬功能強(qiáng)的PAM，并節(jié)約試驗材料、減少因細(xì)胞來源不同造成的試驗誤差，本試驗對地方豬姜曲海豬PAM進(jìn)行了分離、純化、鑒定和冷凍保存，探索PAM生長和凋亡周期，觀察生長過程中形態(tài)和吞噬能力的變化。為利用PAM在體外研究地方豬呼吸道疾病及其他肺部疾病的治病機(jī)理探究等奠定基礎(chǔ)。

1試驗方法

1.1試驗材料

20日齡健康姜曲海豬由江蘇姜曲海種豬場提供。

1.2試驗試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清FBS為Giboc公司產(chǎn)品，DMSO為國產(chǎn)試劑，1 ∶100稀釋的小鼠源抗MAC387單抗（abcam，ab22506），1 ∶200稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（Bioworld）。

1.3試劑的配制

RPMI-1640完全培養(yǎng)液：RPMI-1640培養(yǎng)液，10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（PS）、1%非必需氨基酸（NEAA）、1%丙酮酸；細(xì)胞凍存液：70% RPMI-1640培養(yǎng)基，20% FBS，10% DMSO；墨汁：4.5 mL PBS加入0.5 mL墨汁，均勻混合后高壓滅菌。

1.4試驗方法

1.4.1PAM的分離將試驗仔豬置于無菌室內(nèi)解剖臺上，采取股動脈放血致死，剖開胸腔，小心剝離并結(jié)扎氣管后連同心臟取出完整的肺臟，用PBS充分清洗肺臟表面，清洗血塊污垢，從氣管往肺臟注入雙抗PBS 50～100 mL，輕輕拍打表面，1～2 min后回收支氣管肺泡灌洗液，重復(fù)灌洗2～3次，直到共回收200 mL灌洗液，將灌洗液經(jīng)4層無菌紗布過濾，去除脂肪組織塊等。1 000 r/min離心10min，倒掉上清，用PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)洗滌2次，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌1次，離心去上清，得到肺泡巨噬細(xì)胞。

1.4.2原代PAM的培養(yǎng)用RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個/mL，吸取2 mL鋪于6孔板，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2 h后從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞板，棄掉舊培養(yǎng)液，用PBS輕輕潤洗2次，加入新的RPMI1640完全培養(yǎng)液。以后每24 h更換1次新鮮培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)20 d，觀察記錄細(xì)胞培養(yǎng)的全過程。

1.4.3PAM存活率和純度鑒定

1.4.3.1臺盼藍(lán)染色檢測PAM細(xì)胞的存活率將0.4%的臺盼藍(lán)染液與等體積的細(xì)胞懸液混合，染色2～3 min，取1滴混合液加入細(xì)胞計數(shù)板內(nèi)，在顯微鏡下計數(shù)著藍(lán)色和未著色的細(xì)胞。計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=未著色細(xì)胞數(shù)/（著色細(xì)胞數(shù)+未著細(xì)胞數(shù)）×100%[1]。

1.4.3.2免疫熒光法檢測PAM吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液沖洗，加入4%多聚甲醛固定30 min，經(jīng)0.2% Triton-100穿透20 min后，用PBS清洗3次，每次5 min，加入一抗（1 ∶100 稀釋的小鼠源抗MAC387單抗），室溫孵育2 h，加入二抗（1 ∶200稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG），室溫孵育1 h后，加入終濃度為10 μg/L的Hoechst33342，室溫染色3～5 min，熒光顯微鏡觀察并拍照。試驗每一步均需用PBS充分洗滌。

1.4.4PAM的冷凍保存與復(fù)蘇

1.4.4.1細(xì)胞凍存將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液棄掉，用PBS沖洗2遍后，加入0.25%胰酶消化4 min后加入完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，用移液器輕輕吹吸使細(xì)胞脫落，將細(xì)胞懸液移至15 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min，棄去上清。將 4 ℃ 預(yù)冷的凍存液加入15 mL離心管中，輕輕吹打，使細(xì)胞重懸于凍存液中，將細(xì)胞懸液分裝于細(xì)胞凍存管中，1 mL/管，標(biāo)記細(xì)胞名稱和凍存日期。放入4 ℃預(yù)冷的程序降溫盒中，將程序降溫盒放至-70 ℃，第2天移至液氮中保存。

1.4.4.2細(xì)胞復(fù)蘇從液氮中取出凍存管，迅速放到37 ℃水浴箱中搖晃至解凍，完全解凍后，加入2 mL完全培養(yǎng)基，混勻后1 500 r/min離心5 min。離心后棄去上清，加入4 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液鋪至新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。endprint

1.4.4.3墨汁吞噬試驗將PAM接種至24孔板，接種的細(xì)胞量為1×105個/孔，細(xì)胞培養(yǎng)2 h后，每孔加入1 mL墨汁，對照組加入等量的PBS，每組3個平行樣。16 h后更換新鮮的培養(yǎng)液，隨機(jī)選擇5個視野，每個視野觀察200個細(xì)胞，單個視野的墨汁吞噬率=吞噬墨汁的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，所有視野的平均值即為墨汁吞噬百分率。

2結(jié)果與分析

2.1分離培養(yǎng)細(xì)胞3周內(nèi)的形態(tài)學(xué)觀察

從豬肺泡里分離出來的巨噬細(xì)胞大多呈圓形或者橢圓形，細(xì)胞大小不一，培養(yǎng)2 h后洗去未貼壁的細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)液，PAM細(xì)胞達(dá)到純化、成圓形，繼續(xù)培養(yǎng)至有偽足和突出生出，細(xì)胞活力較好。培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞貼壁生長，體積逐漸增大，有橢圓形、長梭形和不規(guī)則的形態(tài)，胞漿豐富。從3 d開始細(xì)胞周邊或者兩極可見伸展的偽足。培養(yǎng)4 d，細(xì)胞生長依然良好。7～8 d，細(xì)胞開始出現(xiàn)萎縮，貼壁細(xì)胞逐漸減少，生長狀態(tài)較差，懸浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞開始死亡。14 d左右細(xì)胞大量死亡（圖1）。20 d左右細(xì)胞全部死亡。

2.2原代PAM存活率與純度鑒定

體外分離得到原代PAM后，用臺盼藍(lán)染色檢測其存活率，結(jié)果顯示活率較高，約為99.50%。用間接免疫熒光檢測PAM的純度，即用免疫熒光法對純化后BALF細(xì)胞中PAM進(jìn)行鑒定，純度約為94.70%（圖2）。

2.3細(xì)胞冷凍復(fù)蘇對PAM存活率和吞噬功能的影響

2.3.1冷凍和復(fù)蘇對PAM存活率的影響細(xì)胞凍存時細(xì)胞密度為1.51×107個/mL，復(fù)蘇后，細(xì)胞密度為1.48×107個/mL，細(xì)胞的存活率較高，為98.01%（圖3）。

2.3.2冷凍和復(fù)蘇對PAM吞噬功能的影響豬肺泡巨噬細(xì)胞的墨汁吞噬檢測試驗發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)中有大量的墨汁顆粒，胞核形態(tài)不規(guī)則并有明顯扭曲折疊，細(xì)胞吞噬試驗結(jié)果顯示墨汁吞噬率很高，冷凍前吞噬率約為92.00%，復(fù)蘇后吞噬率約為 93.10%（圖4），表明巨噬細(xì)胞對墨汁顆粒有很強(qiáng)的吞噬作用，并且冷凍保存和復(fù)蘇對細(xì)胞的吞噬功能影響不大，復(fù)蘇后的細(xì)胞吞噬功能略大于冷凍前（P>0.05）。

3討論與結(jié)論

豬肺泡巨噬細(xì)胞屬于不繁殖細(xì)胞群，難以在體外長期生存，多做原代培養(yǎng)，因此將豬肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外分離、純

化、冷凍保存非常重要。預(yù)冷PBS灌洗法獲得BALF是目前分離PAM通常采用的方法[3]，該方法獲取的細(xì)胞超過90%是貼壁細(xì)胞為PAM。由BALF回收的細(xì)胞中除了PAM外，還有T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等細(xì)胞，雜細(xì)胞的存在會影響試驗效果，本試驗中利用貼壁速度的不同，培養(yǎng)2 h后換液去除未貼壁的細(xì)胞獲得了高純度的PAM。用免疫熒光法對巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)標(biāo)記的MAC387進(jìn)行檢測，試驗結(jié)果表明本試驗中獲得的PAM純度較高。分離培養(yǎng)得到的PAM純度越高，越有利于后續(xù)相關(guān)試驗的進(jìn)行。

巨噬細(xì)胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，吞噬、清除和呈遞抗原異物的功能是其基本生物學(xué)功能和維持正常生理狀態(tài)所必需的。PAM對細(xì)菌和異物的吞噬作用，測定其吞噬功能，可作為機(jī)體免疫功能的一種指標(biāo)，墨汁吞噬試驗是檢測AM功能的一種簡便易行的方法[1]。本試驗檢測了分離培養(yǎng)16 h和復(fù)蘇后巨噬細(xì)胞的墨汁吞噬率，得出復(fù)蘇后細(xì)胞吞噬能力略微提高，但是差異不顯著，與前人的試驗結(jié)果基本一致。

原代培養(yǎng)的PAM存在增殖速度慢、難以傳代和在體外長期生存的問題，但為節(jié)約試驗動物成本和獲得均一的用于體外試驗的PAM，需要將同批次的PAM細(xì)胞進(jìn)行凍存。本試驗中采用的凍存液和凍存方法較為合適，70%的RPMI-1640，20%胎牛血清和10% DMSO配制成凍存液凍，并用 4 ℃ 預(yù)冷的程序降溫盒凍存細(xì)胞，過夜后轉(zhuǎn)移至液氮中長期凍存，復(fù)蘇后細(xì)胞的存活率在97%以上，可以用于PAM的冷凍與保存。

綜上所述，本試驗進(jìn)行了PAM的分離、純化、鑒定及冷凍保存，獲得了一批純度較高，吞噬能力較強(qiáng)的PAM。本試驗分離得到的PAM可以用于體外研究豬呼吸道疾病及其他肺部疾病的治病機(jī)理探究等奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]孟春華，曹少先，蘇磊，等. 豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)、純化和冷凍保存研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（11）：198-201.

[2]王貴平，劉福林，劉健，等. 從屠宰豬肺中分離培養(yǎng)豬肺泡巨噬細(xì)胞[J]. 養(yǎng)豬，2013（2）：123-124.

[3]楊克禮，田永祥，梁望旺，等. 豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)[J]. 國外畜牧學(xué)（豬與禽），2011，31（4）：52-53.

[4]蘭青，尹美珍，李世普. 大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J]. 武漢理工大學(xué)學(xué)報，2009，31（9）：41-43.

[5]李靜，王亞平. 大鼠骨骼巨噬細(xì)胞的分離，純化以及鑒定[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003，28（4）：436-439.

[6]范仕郡，劉鑫，黃敏，等. 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的快速提取及培養(yǎng)[J]. 局解手術(shù)學(xué)雜志，2015，24（2）：130-131.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年第45卷第23期譚紅連，楊劍，尹丹，等. 馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細(xì)胞活性及炎癥相關(guān)因子的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（23）：166-168.endprint