封 婕 高玲娟 許豪勤 吳玉璘 林 寧 閆林萍1, 綜述 鐘天鷹* 審校

1. 南京醫(yī)科大學第四臨床醫(yī)學院(210004)；2. 江蘇省南京市婦幼保健院；3.江蘇省計劃生育科學技術研究所

宮頸癌是世界范圍內(nèi)排名第4位的女性常見癌癥，被認為與高危型人乳頭瘤病毒( HPV)的感染密切相關[1-2]。高危型HPV可以通過性傳播途徑感染，至少有15個基因型，而HPV 16是其中最常見的致癌類型，被發(fā)現(xiàn)存在于全世界大約50%的侵入性宮頸腫瘤中[3]。目前，針對HPV感染已有預防性疫苗出現(xiàn)，并預期降低宮頸癌的發(fā)生率，但晚期或者復發(fā)的宮頸癌患者預后仍然較差，其死亡率也依然較高。對于無法進行手術治療并且已接受過放射治療的晚期或者復發(fā)的宮頸癌患者來說，通常的治療方法是鉑類化療[4]。最近，也有文獻報道大劑量貝伐單抗化療能延長晚期或者復發(fā)宮頸癌患者的生存時間[5]。但是，這種二線療法的優(yōu)勢還沒有被證實。因此，開發(fā)HPV的治療性疫苗并用來治療HPV感染導致的宮頸上皮內(nèi)損害以及宮頸癌有著重要意義。

1 HPV的結構特點及E6、E7蛋白致癌作用

HPV是一種無包膜的微小DNA 病毒，直徑約52～60nm，為二十面體對稱的核衣殼結構。目前，已鑒定出200余種HPV亞型,其中僅少數(shù)幾種能夠致癌[6]。HPV包含一條單向轉錄的閉環(huán)雙鏈DNA ，約含8000個核酸堿基對(bp)，按功能分為 3個區(qū)：早期蛋白編碼區(qū)(E)、晚期蛋白編碼區(qū)(L)和非編碼區(qū)(NCR)。HPV通過上皮細胞的分化在復制期間合成6種早期蛋白質(zhì)(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和兩種晚期衣殼蛋白(L1和L2)。HPV可以感染宮頸基底上皮細胞，引起病毒增殖，導致上皮增生或瘤變。E5、E6、E7被認為是癌基因蛋白，能持續(xù)進行細胞增殖、DNA擴增和DNA損傷修復,由此導致突變、重組和非整倍體的出現(xiàn)。E6能使抑癌基因p53編碼的蛋白失活，并通過與E6相關蛋白(E6-AP)相互作用，抑制白介素16(IL-16)的分泌，導致半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)功能紊亂，從而導致免疫監(jiān)視缺失[7]；E7蛋白與低磷酸化的視網(wǎng)膜母細胞瘤腫瘤抑制蛋白(Rb)結合，破壞Rb與轉錄因子E2F結合的復合物，導致E2F活性失調(diào)，使早期有絲分裂抑制子1(EMI1)累積，從而導致其作用底物細胞周期后期促進復合物(APC/C)異常紊亂，最終使細胞周期紊亂，導致組織增生[8]。E6、E7可以持續(xù)高表達于被HPV感染的上皮細胞中，因而成為HPV治療性疫苗控制或清除感染以及防止癌變的理想靶標。

2 HPV疫苗研究的現(xiàn)狀

2.1 預防性疫苗

HPV預防性疫苗通常以主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2為靶抗原，刺激機體免疫應答產(chǎn)生抗體，防止HPV 感染。以 L1 體外表達形成的重組病毒樣顆粒(VLP)為靶抗原誘導機體的體液免疫反應，產(chǎn)生中和抗體，在HPV 進入機體前抗體即可與病毒抗原結合，從而防止HPV 的感染。目前，由L1與佐劑形成的重組VLP的HPV亞型疫苗已獲得上市許可[9]。2價疫苗(HPV16/18)、4價疫苗(HPV6/11/16/18)或者9價疫苗(HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58)疫苗能誘導高效價的中和抗體，對于預防 HPV相關亞型的持續(xù)感染及相關的宮頸病變非常有效，但均受到疫苗亞型的限制。生產(chǎn)多價疫苗L1-VLP的復雜性限制了VLP種類的數(shù)量以及疫苗保護的廣度。另外， L1 肽段的變異性較高，無法產(chǎn)生交叉免疫性，L1-VLP只能有效抑制部分hrHPV，無法預防其他HPV亞型的感染。與L1-VLP相比，較小的衣殼蛋白L2包含共同類型的抗原表位[9]，在動物模型中能誘導低效價但針對HPV亞型范圍更廣的交叉中和抗體，并提供交叉保護。提高L2肽段的免疫原性,開發(fā)廣譜HPV L2肽段疫苗是HPV預防性疫苗研究的新思路。

2.2 治療性疫苗

在HPV慢性感染導致宮頸上皮內(nèi)損害以及癌變的過程中，通常存在致癌蛋白E6、E7的持續(xù)表達。所以目前存在多種針對靶抗原E6、E7的治療性疫苗，其疫苗類型包括活載體疫苗、蛋白或多肽疫苗以及核酸疫苗等，且不少疫苗的研發(fā)工作已進入臨床前模型和臨床試驗階段。

活載體疫苗通常分為細菌或病毒載體疫苗。這些載體在機體內(nèi)復制，促進了抗原的傳播[10-11]。活載體疫苗有很高的免疫原性,可以產(chǎn)生強烈的細胞和體液免疫反應。他們還可以將E6、E7抗原遞呈給抗原遞呈細胞(APCs)，促進主要組織相容性復合體( MHC) I和II類分子識別抗原。但是，活載體疫苗有潛在的安全風險，尤其是在免疫力低下的人群中[10]。此外,重復接種相同的活載體疫苗后，產(chǎn)生的免疫反應療效是有限的[10,12-13]。

多肽和蛋白質(zhì)疫苗中的多肽和蛋白質(zhì)組分是從HPV抗原分離出來的，經(jīng)由樹突狀細胞(DCs)處理后，被遞呈給MHC I 或II類分子，能有效刺激CD8+或CD4+T細胞的免疫應答。多肽和蛋白質(zhì)疫苗安全穩(wěn)定,易于生產(chǎn)，顯示了巨大的應用前景。

核酸疫苗可以分為DNA疫苗和RNA疫苗。DNA疫苗安全穩(wěn)定,易于生產(chǎn)，與RNA疫苗或蛋白質(zhì)疫苗相比，可以使抗原在細胞內(nèi)持續(xù)表達更長時間。另外，DNA疫苗不產(chǎn)生中和抗體,可以重復接種[14]。但是，DNA能編碼HPV E6、E7致癌基因，有可能導致細胞轉化。RNA復制子可以從幾種RNA病毒中分離出來[15-17]，且RNA復制子能自我復制,這可能導致抗原的持續(xù)表達和免疫原性的增加。此外,RNA復制子不會形成病毒顆粒，因而不會產(chǎn)生中和抗體，能重復接種。與DNA疫苗相比，RNA沒有染色體整合和細胞轉化的風險，但RNA疫苗的穩(wěn)定性很低。

一般來說,治療性疫苗以多種形式包含E6、E7抗原，并將這些抗原傳遞給APCs，進一步通過MHC I類和MHC II類刺激抗原表達,從而產(chǎn)生CD8 +細胞毒性T細胞(CTL)或CD4+輔助T細胞(Th)反應。E6、E7抗原在被APCs的MHC I類分子識別之前，先在APCs被蛋白酶加工、消化成更小的肽段。重要的是,并不是所有的這些肽段都能成功加載到MHC分子進而被特異性的T細胞識別[18]。只有一些含有特定抗原表位的肽段能高親和力地結合到MHC分子，并與能引起免疫反應的特異性T細胞的受體(TCR)發(fā)生相互反應[19]。目前，大多數(shù)治療性HPV疫苗致力于誘導E7抗原的免疫反應,因為在臨床前模型中，E7抗原免疫反應性比E6抗原更好。

3 HPV治療性多肽疫苗研究的現(xiàn)狀

來源于HPV抗原的多肽疫苗，主要被DCs攝取和MHC I或II類分子提呈，并進一步刺激CD8+或CD4+T細胞免疫反應[20]。目前，多肽疫苗通常致力于誘導高反應性的E6、E7特異性細胞免疫應答，以E6、E7為靶抗原，能引起有利的免疫反應，產(chǎn)生病毒特異的CD4+和CD8+CTL，CTL進一步產(chǎn)生干擾素-γ ( IFN γ)，從而控制和清除被病毒感染的細胞[21]。治療性多肽疫苗有許多優(yōu)點，如穩(wěn)定、安全且容易生產(chǎn)，但其免疫原性很低，不同的HLA個體還需要確定HPV抗原的特定表位[22]。多肽疫苗一般可分為兩組: 特定表位短肽疫苗和合成長肽疫苗。

3.1 以E6、E7蛋白為靶抗原的治療性多肽疫苗

3.1.1 HPV特定表位短肽疫苗眾所周知線性短肽抗原表位能夠誘導細胞毒性反應，因而使用特定表位短肽疫苗能通過免疫接種特定的抗原表位來確保精準的CTL反應。但這種疫苗局限于患者的HLA類型，因此，在接種疫苗之前通常需要進行HLA的初步分型。

目前，已有一些以HPV16 E6、E7為靶抗原的小鼠或者人的T細胞表位被鑒定，如E7 49-57 、E7 11-20、E7 49-57、E7 86-93 等 CTL表位[23-24]，E7 35-50、E743-77、E750-62、E748-54等Th表位以及兼有CTL表位和Th表位的E643-57[15,23,25]。還有一些特定表位的HPV治療性短肽疫苗已經(jīng)進行了臨床試驗，在VIN或CIN患者中呈現(xiàn)較低的臨床反應[26],甚至采用了新的遞呈系統(tǒng)[27]。

近期，Kim等[28]鑒定了從HPV16 E7獲得的可用于宮頸癌患者免疫治療的HLA-A* 33;03-限制的新抗原表位。他們合成了14條包含15個氨基酸的多肽，使用流式細胞儀和酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISpot)測量外周血單核細胞(PBMCs)產(chǎn)生的IFN-γ的量以及CD8+CTL的數(shù)目，并使用51 Cr與人類宮頸癌細胞系SNU1299細胞釋放試驗來驗證抗原表位的免疫原性。在14條多肽中，E749-63表位刺激PBMCs產(chǎn)生的IFN-γ含量最高，且其致敏的CD8+CTL也顯示了更高的細胞毒性效應。在13條包含9～10個氨基酸的多肽中，E749-63、E750-59和E752-61表位誘導產(chǎn)生的IFN-γ含量和細胞毒性效應顯著高于其他肽。據(jù)此，E750-59和E752-61被認定為HLA-A*33;03限制性的HPV16 E7的新抗原表位，能致敏CD8+CTL,從而對宮頸癌細胞產(chǎn)生抗腫瘤作用。然而，一項研究報告認為，需要謹慎解釋肽誘導的CTL作用導致腫瘤細胞溶解的特異性，因為CTL對子宮頸癌細胞系的反應可能是由于同種異體HLA分子的交叉反應而不是E7識別[29]。也有報告認為，這種類型的疫苗治療可能更適合于侵襲前疾病患者的治療，如原位癌，因為晚期病變相對較少，病變越小基因越穩(wěn)定[30]。

由于短肽疫苗的免疫原性較弱，為了增強疫苗效能，通常需要連接脂質(zhì)和佐劑，如4-1BBL，霍亂毒素突變、CpG寡脫氧核苷酸 (CpG-ODN)、toll樣受體( TLR)配體[31-35]。這些方法增強了疫苗激活先天和適應性免疫的能力，促進了CD8+T細胞反應。最近， Lee等[36]發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白是一種有效的佐劑，能通過激活TLR5信號，輔助疫苗治療生殖器癌癥。Mardani等[37]用一個簡短的兩性分子肽載體(Pep-1)與E7肽結合，引起了反應性更強的Th細胞反應，Pep-1肽被認為可用于改進HPV治療性疫苗。

有研究表明，在納米結構中的肽抗原能產(chǎn)生比其可溶形式更強的免疫反應。Rad-Malekshahi等[38]利用基于自組裝材料的新型納米材料提高肽抗原的免疫原性。他們開發(fā)了兩種疫苗遞呈系統(tǒng)，通過將一個自組裝的肽(Ac-AAVVLLLW-COOH)或一種熱敏性的聚合物聚(N-異丙基拉酰胺)添加到不同的肽抗原[卵清蛋白(OVA)250-264、HPV-E743-57]的N端來產(chǎn)生自組裝肽抗原(SAPEs)。結果表明，SAPEs能夠形成直徑20～200nm的納米結構。在小鼠體內(nèi)，以CpG為佐劑的SAPEs誘導和增強了CD8+T細胞的抗原性。此外，與安慰劑對照組相比，接種含HPV E743-57肽的SAPEs的荷瘤小鼠，顯示了腫瘤生長延緩和生存期延長。然而，也可能出現(xiàn)一些問題，比如由于抗原表位的過早釋放而導致T細胞無反應性或者效應低，這些問題對進一步的臨床實驗的成功提出了挑戰(zhàn)。

3.1.2 HPV合成長肽疫苗短肽疫苗可能會出現(xiàn)無法與抗原表位結合的情況，從而無法刺激產(chǎn)生有效的免疫反應；且短肽疫苗是MHC特異性的，只有確定每一個人的HPV抗原的特定表位，疫苗才可能是有效的。因此, 短肽疫苗可能不適合治療大規(guī)模人群，可能的解決方案是應用重疊長肽疫苗改善短肽疫苗。合成長肽疫苗最顯著的特點是不需要基于患者的MHC類型選擇適宜的疫苗。目前，合成長肽疫苗多在動物實驗模型中進行測試[39]，也有一些已經(jīng)在臨床試驗中開展測試。動物模型的結果顯示被接種動物能產(chǎn)生免疫反應，HPV 16的相關腫瘤也得到根除[40]。Welters等[41]發(fā)現(xiàn)HPV16 E6、E7合成長肽疫苗能誘導宮頸癌患者特異性的CD4+和CD8+ T細胞免疫反應。最近，由于合成長肽疫苗具有廣泛的免疫原性，且通過免疫原性能引起CD4+Th或CD8+T細胞毒性反應，合成長肽疫苗進一步得到關注。

在一期臨床試驗中，橫跨HPV16 E6、E7肽序列的長肽疫苗在晚期宮頸癌患者接種后顯示了低毒性和穩(wěn)定的免疫原性[42]。35位晚期宮頸癌患者被分為3組，一起接種或者分開接種以Montanide ISA-51為佐劑的HPV16 E6與E7合成長肽疫苗。組1僅在一側手臂接種300 μg合成肽；組2在一側手臂上接種100 μgE6肽，并在另一側手臂上接種300μgE7肽；組3分別接種E6、E7肽，每種肽劑量50μg。在疫苗治療的4個療程期間以及結束之后，沒有觀察到超過2級的毒性反應。酶聯(lián)免疫斑點實驗分析顯示, E6、E7肽的整合產(chǎn)生了強大且廣譜的T細胞反應。分別在不同位置接種E6、E7肽能增加E7的反應,但對E6產(chǎn)生的免疫反應沒有影響。HPV16 E6、E7合成長肽疫苗耐受性良好，甚至在晚期宮頸癌患者也能夠誘導廣泛的腫瘤壞死因子(INF)相關的T細胞反應。

在一個二期臨床試驗中，van Poelgeest等[43]對晚期或復發(fā)的婦科癌癥患者接種HPV16-SLP疫苗的毒性、安全性、免疫原性以及有效性進行探討。HPV16-SLP由13 條HPV 16 E6、E7重疊長肽組成，并以Montaniade ISA 51為佐劑，20名晚期或者復發(fā)的宮頸癌患者接受了疫苗的皮下接種，在整個試驗中，沒有觀察到CTCAE二級以上的系統(tǒng)性毒性反應，僅在一些患者中觀察到暫時的類似流感的癥狀。固相酶聯(lián)免疫斑點技術(ELISPOT)分析結果顯示，13例患者中有11個產(chǎn)生疫苗誘導的免疫反應。試驗開始階段患者對共同記憶抗原的免疫狀態(tài)反映了患者的免疫狀態(tài)，對疫苗的反應能力被認為與患者免疫狀態(tài)呈正相關。但在被評估的12例患者中沒有觀察到腫瘤的緩解。最后，19名患者因腫瘤惡化死亡。HPV16-SLP疫苗耐受性良好,能誘導產(chǎn)生廣泛的T細胞反應，但不能誘導腫瘤緩解，也不能阻止疾病進展。因此,使用這種疫苗應同時配合化療和免疫調(diào)節(jié)治療。

近期，一項研究將HPV16-SLP與優(yōu)化的toll樣受體2配體(TLR2-L)結合,并評估其在體外激活HPV16相關的癌癥患者的T細胞的能力[44]。兩個高免疫原性的SLP序列均來自HPV16 E6蛋白，與TLR2-L 在GMP條件下共表達。融合蛋白可以使人類DCs在體外成熟，且在體外皮膚模型中皮內(nèi)注射能激活人類皮膚分離的APCs，并能誘導T細胞趨化因子產(chǎn)生。在患者淋巴結分離的細胞懸液中，TLR2-L SLP能顯著增強體外Th細胞活化。結果表明，TLR2-L SLP可以激活循環(huán)系統(tǒng)或淋巴結中分離的腫瘤特異性T細胞，可以進一步研究這兩個軛合物在I / II期臨床試驗中的安全性和免疫原性。

3.2 其他HPV蛋白的相關研究

由于E6、E7能誘導機體產(chǎn)生高反應性的特異性的細胞免疫應答，所以，目前的治療性多肽疫苗多以E6、E7為靶抗原。另外，因為E6、E7是HPV主要的致癌蛋白，用其生產(chǎn)疫苗存在一定的致癌風險，所以需要對E6、E7進行修飾，去除其致癌性，或加強對其CTL表位肽的研究；因而，近年也有一些研究以HPV的其他蛋白如L1、L2、E2為靶抗原，研究其功能和免疫效果。

L1蛋白可以與L2蛋白在體外自行組裝形成VLP，目前主要用于預防性疫苗的研制，在預防HPV感染方面取得了巨大成功。近年來，有一些研究表明，L1也能誘導機體產(chǎn)生細胞免疫。因此，L1有可能成為治療性多肽疫苗的新的切入點。Yokomine等[45]在健康的女性中接種預防性雙價HPV16/18 L1 VLP疫苗，發(fā)現(xiàn)能增強機體對HPV16 L1來源肽的體液和細胞免疫反應。他們采用多元磁珠懸浮法測定對HPV16 L1來源肽發(fā)生反應的免疫球蛋白G(IgG)、IgE、IgA和IgM的水平，用IFN-γ-ELISPOT分析對HPV16 L1來源肽誘導的特異性T細胞反應進行評估。在第1次接種疫苗后的2、7和12個月后，在血漿中，針對位于HPV16 L1 的第293～312 和 300～319位的氨基酸序列(PTPSGSMVTSDAQIFNKPYW)發(fā)生反應的IgG、IgM和IgA水平得到顯著提高。通過詳細的抗原表位定位發(fā)現(xiàn)，位于HPV16 L1的第301～310位的氨基酸序列(TSDAQIFNKP)是免疫原性B細胞的一個抗原表位。此外，在免疫接種后，T細胞針對HPV16 L1的第305～313位的HLA-A2和HLA-A24限制的抗原表位(QIFNKPYWL)的反應增加，這表明HPV16/18 L1-VLP疫苗能夠同時誘導T和B細胞的特異性免疫反應。由此可見，L1可以誘導機體產(chǎn)生細胞免疫。但該研究的主要目的在于確定HPV16 L1來源的B細胞和T細胞的表位，以監(jiān)測HPV 16/18 L1 VLP疫苗接種后的免疫反應，并未對鑒定出的T細胞的新抗原表位是否可用于宮頸癌患者免疫治療進行探討。

E2蛋白可以調(diào)節(jié)病毒轉錄與復制，有B細胞和T細胞表位，當前已有部分E2疫苗進入臨床實驗階段，且取得了不錯的療效。ópez-Toledo 等[46]認為免疫接種HPV 16 L1和E2嵌合物，可在小鼠模型中引起細胞免疫反應和抗腫瘤活性。 他們將不同的HPV E2片段融合到L1蛋白中生成嵌合衣殼體，從而生成預防性和治療性疫苗，并評估它們誘導CTL對HPV 16 E2發(fā)生反應的能力，同時保護L1中和表位。在51Cr釋放的細胞毒性試驗中，c57BL/6免疫小鼠的脾細胞識別并溶解了表達并呈現(xiàn)內(nèi)生性處理的E2肽的TC-1/E2細胞。而且，這種E2特異的細胞毒性反應抑制了小鼠體內(nèi)TC-1/E2細胞的腫瘤生長。所以，他們確定了細胞毒性反應中涉及的E2的抗原表位(aa 292-301)。E2也可能誘導機體發(fā)生細胞免疫，產(chǎn)生抗腫瘤作用，這也為HPV治療性多肽疫苗的研究提供了新的思路。

4 HPV治療性多肽疫苗的不足和展望

活載體疫苗容易使機體產(chǎn)生中和抗體，造成重復免疫效果差的問題； DNA疫苗存在與宿主基因組整合的潛在危險；RNA疫苗穩(wěn)定性差；E5、E6和E7蛋白疫苗存在致癌風險。相比于其他以病毒、細菌、DNA、RNA等作為載體的合成HPV治療性疫苗，多肽疫苗治療效果理想，安全性更高，穩(wěn)定性也較強，且易于生產(chǎn)，但是其免疫原性較差，通常需要脂質(zhì)或其他佐劑，比如趨化因子、細胞因子、toll樣受體(TLR)配體增強疫苗的效力[47]。這些方法有助于提高疫苗激活先天和適應性免疫的能力,還能進一步提高CD8+T細胞的免疫反應。但是，多肽疫苗是MHC特異性的，這意味著為了產(chǎn)生有效的疫苗，需要確定每一個個體的HPV抗原的特定的免疫原性表位。由于多肽疫苗需要確定機體MHC的特異性，HPV治療性多肽疫苗面臨大規(guī)模生產(chǎn)和治療HPV相關疾病的挑戰(zhàn)[48]。目前，可能的解決方案是應用重疊長肽疫苗，這種方法在多個臨床前模型中已被證明能有效地誘導抗原特異的T細胞產(chǎn)生免疫應答[49-50]。

HPV治療性多肽疫苗未來的研究方向應著力于解決HLA型別限制，針對不同人群來篩選安全有效的CTL表位肽，同時需要解決其免疫原性低的問題，篩選合適的佐劑增強其免疫效果。另外，HPV治療性多肽疫苗的研究不應該只關注E6和E7蛋白，目前HPV其他蛋白的疫苗研究成果也很矚目，特別是用來研制預防性疫苗的L1和L2，均獲得了良好的細胞免疫效果。這說明HPV治療性多肽疫苗的研究應該向其他蛋白延伸，需要對HPV感染的免疫學機制以及其他蛋白的作用進行更深層次的研究。由于HPV各個蛋白的作用不同，各種疫苗都存在或多或少的不足，研究中可能還需要將多肽疫苗與其他疫苗聯(lián)合使用以取得更好的療效。用疫苗進行免疫治療是一種很有前景的癌癥治療方法，在宮頸病變及宮頸癌患者中,治療性疫苗的使用與癌變前損害的轉歸以及臨床預后密切相關。與傳統(tǒng)治療相比，治療性多肽疫苗有巨大優(yōu)勢和可行性[42-43]，具有良好的發(fā)展前景。

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