謝九艷 翟磊 宋振 楊玉新 程池 姚粟

（1. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100027；2. 新疆中亞食品研發(fā)中心（有限公司），烏魯木齊 830001）

發(fā)酵辣椒（又稱剁辣椒）是我國的傳統(tǒng)食物，主要利用乳酸菌的自然發(fā)酵和高濃度食鹽的保存作用進(jìn)行加工。工業(yè)發(fā)酵辣椒常在辣椒中加入約20%食鹽進(jìn)行鹽醅發(fā)酵來保持辣椒的色澤、辣味和抑制發(fā)酵過程中雜菌的生長，但是也造成了亞硝酸鹽含量過高［1］，抑制乳酸菌等益生菌生長［2］等副作用。目前發(fā)酵辣椒經(jīng)常通過調(diào)節(jié)食鹽的用量，控制發(fā)酵時(shí)間，調(diào)節(jié)初始pH值，使用純種乳酸菌發(fā)酵等方法來改善發(fā)酵辣椒的質(zhì)量［3］。其中選育優(yōu)質(zhì)乳酸菌對(duì)辣椒發(fā)酵有著十分重要的作用，王雪雅等［4］通過純種發(fā)酵研究表明，發(fā)酵乳桿菌和食果糖乳桿菌是辣椒發(fā)酵過程中綜合品質(zhì)較好的發(fā)酵優(yōu)良菌株。鄧放明等［5］發(fā)現(xiàn)Lact.chili6和Lact.chili8在低鹽發(fā)酵過程中有著良好的優(yōu)勢(shì)。發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌等應(yīng)用于辣椒發(fā)酵的研究較多［1］。所以研究具有良好特性的乳酸菌及其在果蔬發(fā)酵中的應(yīng)用十分的必要。

產(chǎn)馬乳酒乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）屬于厚壁菌門（Firmicutes），芽胞桿菌綱（Bacilli），乳桿菌目（Lactococcus），乳桿菌科（Lactobacillaceae），乳桿菌屬（Lactobacillus），是一類革蘭氏陽性、兼性厭氧、同型發(fā)酵的桿狀乳酸菌，最初分離于開菲爾粒中，是開菲爾粒中的主要微生物［6］。目前含有Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens和Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum兩個(gè)亞種［7］。

產(chǎn)馬乳酒乳桿菌作為益生菌具有治療疾病、調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫水平的功能。具有抗結(jié)腸炎的功能、調(diào)節(jié)腸道功能紊亂［8］、有效的抑制EHEC感染［9］、緩解哮喘癥狀等功能［10］。產(chǎn)馬乳酒乳桿菌具有非常好的益生素活性，能夠很好的吸附在腸道快速繁殖，產(chǎn)生益菌素，調(diào)節(jié)腸道微生物的菌群，是未來功能食品的重要選擇［11］。但是目前產(chǎn)馬乳酒乳桿菌主要應(yīng)用于乳制品發(fā)酵，國內(nèi)外關(guān)于產(chǎn)馬乳酒乳桿菌做為果蔬發(fā)酵菌株研究的報(bào)道較少。本研究主要對(duì)CICC 6287進(jìn)行鑒定和生物學(xué)特性研究，并將該菌株用于新疆特色辣椒發(fā)酵，評(píng)估 CICC 6287的發(fā)酵生物學(xué)特性對(duì)辣椒發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與培養(yǎng)條件 菌株CICC 6287分離于新疆特色乳制品樣品，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。菌株CICC 6287在MRS培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h。

用于抑菌試驗(yàn)的菌種大腸桿菌（Escherichia coli）O157：H7 CICC 10907，腸沙門氏菌（Salmonella enteric）CICC 10871，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CICC 10790 和 單 增 李 斯 特 菌（Listeria monocytogenes）CICC 21635 均來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備 MRS培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、革蘭氏染色試劑盒均購自北京陸橋技術(shù)有限公司；API試劑條購于生物梅里埃公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購于OMEGA公司；GoldView購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；溶菌酶購自Sigma公司；蛋白酶購自Merk公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 marker購自北京天根生物有限公司。

pH計(jì)FE20購于梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；紫外分光光度計(jì)7200購于尤尼科（上海）儀器有限公司；溫度梯度PCR儀購于Biometra公司；恒溫培養(yǎng)箱BHG-8082型購于上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株CICC 6287多相分類學(xué)鑒定 利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株CICC 6287基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。以基因組DNA為模板，利用通用引物27F和1492R對(duì)該菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系按照PCR Mixture使用說明進(jìn)行配制（Tiangen公司）。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性 30 s，72℃延伸 1 min 30 s，30 個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖進(jìn)行檢測后，送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序。使用ContigExpress軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析，將分析后結(jié)果遞交到EzBioCloud和NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，確定菌株CICC 6287與已知菌株的同源關(guān)系。采用MEGA 4軟件中的Clustal 功能對(duì)菌株CICC 6287與近緣種菌株的16S rRNA基因和pheS基因進(jìn)行多序列比對(duì)，并使用Neighbour-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育及分子進(jìn)化分析［12］。

菌株CICC 6287接種到MRS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)特征。收集新鮮菌體，加入2.5%戊二醛4℃固定過夜。離心收集菌體，100 mmoL/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）漂洗3次。50%，70%，85%，95%乙醇梯度脫水后100%乙醇脫水3次。脫水后使用儀器BAL-TEC CPD030進(jìn)行二氧化碳臨界點(diǎn)干燥。噴金-離子濺射儀 BAL-TEC SCD005進(jìn)行噴金后，使用掃描電鏡Hitachi SU8010進(jìn)行菌體形態(tài)觀察。使用API 50 CH 鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株CICC 6287底物利用特征進(jìn)行測定［13］。

1.2.2 菌種CICC 6287生物學(xué)特性研究 挑取新鮮培養(yǎng)的單菌落接種到4 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)18 h后作為接種種子液。

生長及產(chǎn)酸能力測定：將種子液按1%接種量接種于200 mL MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以不接種培養(yǎng)基作為對(duì)照，每隔2 h取樣測定測定600 nm下吸光值（OD600），同時(shí)測定發(fā)酵液的pH值［14］。

耐鹽耐酸特性測定：將種子液按1%接種量接入分別含2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L和10 g/L NaCl以及入pH 2、3、4、5、6和7的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48 h，測定600 nm下吸光值（OD600），并記錄結(jié)果［15］。

亞硝酸鹽降解能力測定：將種子液按1%接種量接種于含125 μg/mL NaNO2的200 mL MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，每隔24 h定時(shí)取樣測定NaNO2含量。參考GB/T 5009.33-2003中的鹽酸萘乙二胺法進(jìn)行測定，不接種的MRS培養(yǎng)基（含125 μg/mL NaNO2）作為空白對(duì)照［16］。

氨基酸脫羧酶試驗(yàn)：挑取新鮮培養(yǎng)的單菌落于3 mL無菌生理鹽水中研磨，制備成0.5 McFarland懸液，分別滴入氨基酸脫羧酶試驗(yàn)的安培瓶中，每瓶三滴，并加無菌液體石蠟覆蓋培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)24 h后，觀察試驗(yàn)管與對(duì)照管顏色變化，試驗(yàn)管為紫色，對(duì)照管為黃色，結(jié)果為陽性；試驗(yàn)管與對(duì)照管均為黃色，結(jié)果為陰性。

抑菌試驗(yàn)：采用濾紙片法測定目標(biāo)菌株的抑菌性能。挑取新鮮培養(yǎng)的指示菌株大腸桿菌 O157：H7（Escherichia coli，CICC 10907）， 腸 沙 門 氏 菌（Salmonella enteric，CICC 10871），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CICC 10790）和單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，CICC 21635），將菌懸液濃度調(diào)至0.5 麥?zhǔn)蠞岫炔⒕鶆蛲坎荚赥SA培養(yǎng)基上，然后將濾紙片浸泡在200 μL培養(yǎng)48 h的菌株CICC 6287發(fā)酵液中，置于上述培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h，記錄結(jié)果［17］。

1.2.3 發(fā)酵辣椒特性測定 將新疆辣椒清洗干凈打漿破碎后，將種子液按1%接種量接種于破碎辣椒中，同時(shí)加入3%糖和3%鹽，以不接乳酸菌的自然發(fā)酵辣椒為對(duì)照組，30℃恒溫連續(xù)發(fā)酵7 d。每天取樣測定發(fā)酵辣椒的pH值。按照GB/T 12456-2008：《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法測定發(fā)酵辣椒的總酸含量［18］。使用HPLC法測定有機(jī)酸的種類和含量。按照GB 5009.33-2010：《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定發(fā)酵辣椒的亞硝酸鹽含量［19］。按照GB/T 5009.208-2008：《食品中生物胺含量的測定》使用HPLC法對(duì)發(fā)酵7 d的辣椒中生物胺的種類和含量進(jìn)行測定［20］。

2 結(jié)果

2.1 菌種CICC 6287的形態(tài)學(xué)特征

從新疆特色乳制品中分離得到一株細(xì)菌，在MRS瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)48 h，菌落為乳白色，圓形，光滑，濕潤，不透明，邊緣不整齊。菌體呈桿狀，大小為（0.5-0.6）μm × （1.6-5.1）μm，單個(gè)或成對(duì)排列，革蘭氏陽性，表現(xiàn)為典型的乳桿菌菌落特征。電鏡照片見圖1，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，菌株編號(hào)為CICC 6287。

2.2 菌種CICC 6287作為發(fā)酵菌株的生物學(xué)特征

為了解菌種CICC 6287的生長特征和作為辣椒發(fā)酵菌株的生物學(xué)特性，測定CICC 6287的生長曲線和不同生長時(shí)間的產(chǎn)酸能力。從圖2-A中看出，菌株CICC 6287培養(yǎng)8 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)36 h進(jìn)入穩(wěn)定期。在對(duì)數(shù)期產(chǎn)酸速度較快，培養(yǎng)28 h pH值就降到4。表明產(chǎn)酸速率和生長速率成正比。進(jìn)入穩(wěn)定期后兩者都相對(duì)保持穩(wěn)定?？赡苁禽^低的pH 值抑制了CICC 6287的生長，使其較早的進(jìn)入穩(wěn)定期。通過測定菌株對(duì)酸和鹽的耐受性，結(jié)果表明，CICC 6287生長最適pH值為6。隨著pH值降低，菌株CICC 6287生長受到明顯的抑制（圖2-B）。菌株CICC 6287 對(duì)NaCl耐受范圍為0-80 g/L，隨著NaCl濃度的升高，乳酸菌的生長受到明顯的抑制，在含80 g/L NaCl培養(yǎng)基中最終生長的OD600能夠達(dá)到0.4（圖2-B）。

圖1 菌株CICC 6287掃描電鏡圖

圖2 菌株CICC 6294生長和產(chǎn)酸特性（A）及耐酸和耐鹽性（B）

亞硝酸鹽降解能力測定試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，CICC 6287隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌株降解的亞硝酸鹽越多。培養(yǎng)24 h后，菌株CICC 6287的亞硝酸鹽降解率可達(dá)到94.8%；培養(yǎng)36 h后，可達(dá)到100%。通過測定氨基酸脫羧酶的活性研究CICC 6287試驗(yàn)結(jié)果表明，CICC 6287四種脫羧酶活性為陰性，表明菌株CICC 6287對(duì)游離氨基酸的脫羧酶活性弱，能夠較少的產(chǎn)生生物胺，減少發(fā)酵食品中的生物胺危害。抑菌試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，菌株CICC 6287對(duì)致病菌腸炎沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑、單增李斯特菌都有抑制作用。

表1 菌株CICC 6287的氨基酸脫羧酶活性

表2 菌株CICC 6287的抑菌試驗(yàn)

2.3 菌株CICC 6287多相分類學(xué)鑒定

通過擴(kuò)增菌株16S rRNA基因序列并經(jīng)過序列比對(duì)，確定與Lactobacillus kefiranofaciens的兩個(gè)亞種Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens LMG 19149T和Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefirgranum DSM 10550T的同源性最高。與其他菌株的同源率都低于98.65%，因此將該細(xì)菌鑒定為定為產(chǎn)馬乳酒乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）（圖3），其16S rRNA 基因序列登錄號(hào)為KY694991。利用API 50 CH測定其對(duì)碳源的利用，CICC 6287可以利用D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖等產(chǎn)酸（表3）。

圖3 菌株CICC 6287 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 菌株CICC 6287的碳源發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)

2.4 發(fā)酵辣椒特性測定

將CICC 6287作為辣椒發(fā)酵的菌種，測定其對(duì)辣椒發(fā)酵過程的影響。辣椒發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵辣椒的pH值不斷下降，發(fā)酵7 d后，pH值不再明顯下降，接種CICC 6287的辣椒最終pH值為3.03。自然發(fā)酵辣椒的最終pH值在3.26，明顯低于自然發(fā)酵?？偹岷亢蚿H值測定結(jié)果相一致，自然發(fā)酵辣椒的總酸含量僅為20.9 g/kg，接種菌株CICC 6287的發(fā)酵辣椒最終的酸含量能夠達(dá)到25.4 g/kg。接種菌株CICC 6287的發(fā)酵辣椒高于自然發(fā)酵的乳酸含量（表4），表明CICC 6287在辣椒發(fā)酵過程中對(duì)于酸的含量有重要作用。

辣椒發(fā)酵過程中，亞硝酸鹽的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，發(fā)酵第2天亞硝酸鹽的含量達(dá)到峰值，含量在5.7-6.5 mg/kg。最終入菌株CICC 6287的辣椒中亞硝酸的含量僅為1.06 mg/kg，遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵中亞硝酸鹽含量（2.63 mg/kg）。

生物胺測定結(jié)果表明，發(fā)酵辣椒中的生物胺主要為腐胺。腐胺是由鳥氨酸脫羧酶生成，接入菌株CICC 6287能夠顯著的降低發(fā)酵辣椒中腐胺的含量，腐胺的含量僅為5.62 μg/mL，遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵辣椒的19.36 μg/mL，這表明菌株CICC 6287的接入能很大程度的提高發(fā)酵辣椒的安全性。

圖4 發(fā)酵辣椒性能測定（A）：pH和總酸（B）亞硝酸鹽含量

表4 發(fā)酵辣椒指標(biāo)測定

3 討論

CICC 6287作為發(fā)酵菌株，在辣椒發(fā)酵過程中有優(yōu)于其它菌株的發(fā)酵特性。根據(jù)不同乳酸菌菌株發(fā)酵特性測定的報(bào)道，在菌株對(duì)食鹽耐受能力方面，CICC 6287遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于瑞士乳桿菌、植物乳桿菌等菌株［2］。在產(chǎn)酸能力和發(fā)酵辣椒的總酸含量方面，其產(chǎn)酸性能優(yōu)于戊糖乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種等菌種。在降解亞硝酸鹽方面，CICC 6287的降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)于乳酸片球菌等菌種［4］。CICC 6287的發(fā)酵特性優(yōu)于先前報(bào)道的菌株，是提高辣椒發(fā)酵綜合品質(zhì)的優(yōu)良菌種。在后期可應(yīng)用于工業(yè)化辣椒生產(chǎn)，提高了辣椒發(fā)酵的品質(zhì)和市場競爭力。

食用安全性是目前發(fā)酵食品關(guān)注的重要問題，其中亞硝酸鹽和生物胺是影響發(fā)酵果蔬安全性的重要指標(biāo)。攝取過量的亞硝酸鹽會(huì)引起癌變、抵抗甲狀腺素和智障等危害。生物胺會(huì)導(dǎo)致腎上腺素和胃酸過量分泌、心跳加快、血糖含量增加或血壓升高等癥狀［21］。亞硝酸鹽和生物胺同時(shí)存在有可能生成亞硝酸銨，從而引發(fā)肝癌的可能性［22］。本研究結(jié)果表明，菌株CICC 6287具有較強(qiáng)的亞硝酸鹽降解能力，接種該菌株的辣椒在發(fā)酵過程中表現(xiàn)為發(fā)酵初期亞硝酸鹽含量升高，后期亞硝酸鹽含量迅速降低。因?yàn)閬喯跛猁}降解分為酶降解和酸降解兩部分，在發(fā)酵初期較高pH的情況下主要進(jìn)行酶降解。在發(fā)酵后期，pH降低到一定程度的情況下酸降解占主要部分［23］。所以在發(fā)酵初期微生物的數(shù)量較少，亞硝酸含量初步升高，隨著后期乳桿菌生物量的增大，產(chǎn)酸能力的增強(qiáng)，亞硝酸含量降解速度變快。接種菌株CICC 6287的辣椒發(fā)酵生物胺含量顯著降低。生物胺含量的降低，一方面與氨基酸脫羧酶活性相關(guān)，菌株CICC 6287多種氨基酸脫羧酶活性呈陰性，產(chǎn)生生物胺的能力降低；另一方面與乳桿菌中的SufI蛋白相關(guān)，據(jù)報(bào)道該蛋白能夠降解生物胺［24］。對(duì)于菌株CICC 6287降解生物胺的機(jī)理在今后的工作中可以進(jìn)一步研究。

此外，菌株CICC 6287的生長和產(chǎn)酸特性也是其作為果蔬發(fā)酵菌種的重要條件。研究表明，接種菌株CICC 6287的發(fā)酵辣椒產(chǎn)酸速率快，乳酸含量相對(duì)較高，這與菌株CICC 6287生物學(xué)特性一致，CICC 6287前期生長速度快，產(chǎn)酸速度快，發(fā)酵前期成為辣椒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌種，在發(fā)酵后期由于乳酸的積累抑制乳酸菌的生長，使發(fā)酵辣椒的pH保持在穩(wěn)定的水平［25］，其中乳酸對(duì)發(fā)酵食品的風(fēng)味具有重要作用［26］。在發(fā)酵辣椒生產(chǎn)過程中，可通過調(diào)節(jié)乳酸鈣的含量調(diào)控辣椒中乳酸的含量［27］。

4 結(jié)論

通過對(duì)新疆特色乳制品中的菌株進(jìn)行分離篩選，得到一株發(fā)酵生物性能較好的菌株CICC 6287。經(jīng)鑒定為產(chǎn)馬乳酒乳桿菌，該菌種具有生長速度快、產(chǎn)酸效率高、鹽耐受力強(qiáng)、降解亞硝酸鹽等良好的發(fā)酵生物學(xué)特性。把菌株應(yīng)用到辣椒發(fā)酵過程中，提高了發(fā)酵辣椒的酸度，降低了發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽、生物胺的含量。CICC 6287是未來果蔬發(fā)酵菌株的重要選擇。

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