線栓法制備大鼠大腦中動脈腦缺血模型的改進(jìn)與經(jīng)驗探討

俞璐，曹曉華，趙政，賀文迪，夏明

急性缺血性腦卒中以其高發(fā)病率，高致殘率和高致死率的疾病特點[1]，嚴(yán)重危害人類生命健康。動物腦缺血模型可以模擬人類相應(yīng)的腦缺血疾病，在眾多局灶性腦缺血模型制備方法中，以Zea Longa于上世紀(jì)發(fā)明的大腦中動脈線栓法[2]（middle cerebral artery occlusion，MCAO）應(yīng)用最為廣泛，其特點及優(yōu)勢在于：無需開顱，創(chuàng)傷較??；缺血部位相對固定，可控性好；可實現(xiàn)腦缺血后再灌注，是理想的標(biāo)準(zhǔn)局灶性腦缺血動物模型[3]。但在模型制備過程中，易受眾多因素影響，模型成功率、梗死體積大小、蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生率不盡相同，且該手術(shù)對人員操作技術(shù)要求較高，不同實驗室、不同實驗員制備的模型差異較大。筆者將通過自身操作經(jīng)驗結(jié)合既往文獻(xiàn)報道，對線栓法制備MCAO模型談幾點個人體會。

1 動物選擇

1.1 動物品系

目前MCAO動物模型多選用嚙齒類小動物，其具有購買及飼養(yǎng)費較低，大、小鼠均具有神經(jīng)功能損傷的評判標(biāo)準(zhǔn)，較易得到不同特性的轉(zhuǎn)基因動物等優(yōu)點[4]。大鼠基因具有與人類基因98%的同源性，遺傳差異小，品種一致性好，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)達(dá)，腦血管解剖結(jié)構(gòu)與人類相似度高，其生理機能變異小，且具有較強的抗感染能力和生命力，是腦缺血研究中應(yīng)用最為廣泛的動物模型。Fischer-334、SD、Nistar等品系大鼠均可用于MCAO的動物模型，但不同品種大鼠在阻斷大腦中動脈后體積大小和穩(wěn)定性不同。國外研究者發(fā)現(xiàn)，Nistar大鼠MCAO平均腦梗死體積最小，梗死灶變異大；Fischer-334大鼠梗死體積最大，大腦中動脈變異小，動脈阻塞后形成的梗死體積一致性好，而SD大鼠居于兩者之間[5]。但因鼠源問題，目前多選用性情溫和、生長快、價格便宜的SD大鼠。SD大鼠在MCAO手術(shù)后，梗死體積較Nistar大鼠大，恒定性好，缺血半暗帶所占體積明顯小于Nistar大鼠。同時，考慮到大鼠雌激素水平對腦缺血損傷可能的神經(jīng)保護(hù)機制[6，7]及激素水平的生理性波動對大鼠情緒的影響，筆者采用血管解剖結(jié)構(gòu)更為清晰的雄性SD大鼠作為MCAO的動物模型。

1.2 體重和鼠齡

研究表明，大鼠大腦中動脈的長度和粗細(xì)與其體重形成正比[8]。目前多主張大鼠體重控制在250～300 g。筆者在實驗中采用260～280 g大鼠，理由如下：鼠齡小，體重輕，對造模手術(shù)耐受性差；體重較輕的大鼠血管更細(xì)，手術(shù)時線栓不易插入，增加手術(shù)創(chuàng)傷；體重＞300 g的大鼠，血管增粗，線栓不能充分阻斷血流，梗死效果不佳，而且術(shù)后能快速建立側(cè)枝通路循環(huán)，不利于評估藥物療效。

2 術(shù)前準(zhǔn)備

2.1 術(shù)前飲食

對于術(shù)前飲食，國內(nèi)主流的觀點是禁食不禁水，一般禁食時間為12 h[9]，其目的是防治麻醉狀態(tài)下食物的返流和誤吸。筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)，大鼠在禁食過程中體重可下降10～12 g，禁食后的大鼠在造模完成后3 d內(nèi)精神狀態(tài)差，食物攝入量少，容易因營養(yǎng)不良出現(xiàn)衰竭死亡。更有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，葡萄糖/能量代謝障礙是引起缺血性腦損傷的主要原因[10]。因此，筆者主張在術(shù)前自由飲食以提高大鼠對手術(shù)耐受力，降低術(shù)后死亡率；手術(shù)時，將大鼠頭部偏向一側(cè)能防止食物返流和誤吸引起的窒息。

2.2 麻醉

動物實驗中較常用的麻醉劑包括乙醚、異氟烷、戊巴比妥鈉和水合氯醛等。乙醚和異氟烷屬于吸入性麻醉劑，作用時間較短，需要持續(xù)性給藥，給藥劑量不易控制，對呼吸道刺激較大，影響肌張力，需要借助氣體麻醉設(shè)備，且異氟烷對腦缺血再灌注損害具有保護(hù)作用[11]，故腦缺血動物模型一般不予采用。戊巴比妥鈉和水合氯醛均可通過腹腔注射，操作簡單，是實驗操作中使用最多的麻醉劑。研究證實，戊巴比妥鈉在麻醉潛伏期有較劇烈的四肢強直、痙攣等表現(xiàn)，需要進(jìn)入深度麻醉期后上述癥狀才能消失，而水合氯醛的麻醉潛伏期短于戊巴比妥鈉，起效較迅速，同時對大鼠體溫和呼吸運動的抑制作用小于戊巴比妥鈉，但兩藥均有抑制心肌收縮的作用[12]。因水合氯醛價格低廉，起效較快，對大鼠呼吸、心率影響較小，故筆者在實驗中采用10%水合氯醛（0.40 mL/100g）腹腔注射麻醉。但在麻醉過程中需要注意以下幾點：按照比例現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存；抓取大鼠時避免過度掙扎，應(yīng)輕柔有效；在左側(cè)腹直肌旁側(cè)0.5 cm進(jìn)針，通常呈30～40°進(jìn)針，深度為1.5～2.0 cm，避免右腹進(jìn)針，以防刺中肝臟；當(dāng)出現(xiàn)因麻醉劑過量致口鼻分泌物增多現(xiàn)象，可用鑷子將舌頭拉出置于偏側(cè)防止誤吸；嚴(yán)格按照動物體重計算麻藥劑量，若首次劑量未完全麻醉，可根據(jù)麻醉程度逐步加量，一般加0.1～0.2 mL，1～2次，直至大鼠全身松軟，不能自主活動，生命體征平穩(wěn)，逐量給藥亦能減少其對心功能的抑制作用，但麻藥過量可致大鼠死亡；水合氯醛在臨床上亦可用于治療高熱驚厥[13]，故使用該藥麻醉特別需要注意術(shù)中及術(shù)后保暖，待大鼠蘇醒后撤除保暖設(shè)備可降低死亡率。

3 線栓制備和插線深度

3.1 線栓的制備

線栓是制備MCAO模型的關(guān)鍵材料，Longa和koizumi作為最早采用線栓法阻塞大腦中動脈的研究者，兩者在線栓頭的處理上各有不同，Longa把小段尼龍線的一端在酒精燈火焰上燒灼使其融化成一個膨大的球狀[2]，而Koizumi在尼龍線上均勻涂上硅樹脂[14]，但由于技術(shù)要求高，線栓頭處理標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，易造成模型制作失敗。線栓的材質(zhì)、粗細(xì)、線頭的形狀和包被均影響到模型制備效果。為保證線栓規(guī)格的一致性，減少線栓對模型制備的影響，筆者在實驗中采用北京西濃科技有限公司制作的成品線栓，線栓采用柔韌適度的單絲尼龍線（線直徑0.26 mm，線長40 mm），經(jīng)顯微操作燒制而成，頭端燒熔為半球形，頭部直徑（0.36±0.02）mm，前端20 mm包被多聚-L-賴氨酸，不改變線栓直徑，距頭端19～20 mm處黑色標(biāo)記，頭部形狀圓潤的線栓易于進(jìn)入顱內(nèi)而不刺破血管，同時也易于掌握插入深度，從而形成較穩(wěn)定的腦梗死面積，大鼠死亡率較低。

3.2 線栓插入

體重250～300 g的大鼠目前較多采用線栓插入深度為從頸總動脈分叉部起18～20 mm[15]。筆者的操作經(jīng)驗，線栓插入深度為從頸總動脈分叉處插入約20 mm，即將線栓送入頸內(nèi)動脈后，黑色標(biāo)記點過分叉點約1 mm，感覺稍有阻力時即停止插入。同時線栓插入血管時，應(yīng)注意以下幾方面：由于目前采用盲插法居多，當(dāng)線栓由頸總動脈進(jìn)入頸內(nèi)動脈后，極易誤插入頸內(nèi)動脈的分支翼腭動脈造成模型失敗。筆者的操作經(jīng)驗是，當(dāng)線栓進(jìn)入頸總動脈分叉點后，應(yīng)適當(dāng)將其壓低，保持線栓與水平線夾角15°左右，可有效降低插入翼腭動脈幾率；頸總動脈分叉點的位置并不恒定，不應(yīng)將分叉點的位置作為插入線栓深度的測量標(biāo)志；當(dāng)線栓插入阻力過大時，或由于血管扭曲所致，此時切不可猛插強插，可將線栓緩慢退出，讓血管回復(fù)到解剖結(jié)構(gòu)，待恢復(fù)血流后可再次嘗試線栓插入；線栓插入過程中盡量不要多次的來回抽插，避免血管內(nèi)膜損傷。

4 模型制備

4.1 手術(shù)器械

由于大鼠的血管和神經(jīng)十分纖細(xì)，MCAO模型制備需要精密度較高的手術(shù)器械來完成。筆者在分離血管時選用顯微鑷，各型號頭寬0.1～0.3 mm，能夠有效分離頸總動脈、頸內(nèi)和頸外動脈；為避免顯微鑷多次分離組織后頭端毛糙，在分離肌肉組織時采用普通眼用鑷。同時采用1 mL注射器的針頭刺破頸總動脈留下大小合適的針孔便于線栓插入，注射器針頭鋒利且尖銳，刺破血管同時又避免割斷血管。手術(shù)器械的選用在MCAO手術(shù)中尤為重要，恰當(dāng)?shù)钠餍悼墒共僮鬟^程中血管損害降到最低，減少出血量和手術(shù)時間，提高造模成功率。

4.2 手術(shù)切口

手術(shù)一般以頸側(cè)部作為切口，為避免傷及左側(cè)迷走神經(jīng)造成對心臟的影響[16]，手術(shù)時以右頸側(cè)為切口，長約2.0～2.5 cm，切口往下依次為：頜下腺、下頜淋巴結(jié)、胸鎖乳突肌、胸骨舌骨肌等，右頸側(cè)較易于進(jìn)行肌肉和血管分離，視野暴露較好；如尋找血管困難，可適當(dāng)擴展切口至3.0 cm，但操作時避免反復(fù)撥弄神經(jīng)或探入切口過深損傷氣管。

4.3 線栓插入位置與走向

線栓插入位置有自頸外動脈插入和自頸總動脈插入2種。但頸外動脈較細(xì)，插入過程中容易扯斷或誤剪斷血管，操作難度大，故而筆者采用頸總動脈插入線栓法，其插入手法簡單易行，且血管不易扯斷，對氣管刺激性小，血管損害僅在頸總動脈局部[17]。操作時，為避免術(shù)中出血及線栓插入頸外動脈，筆者先將頸外動脈結(jié)扎，在頸總動脈和頸內(nèi)動脈各放置一根活線，以備線栓插入后固定線栓用。線栓走向即進(jìn)入頸總動脈后，由頸內(nèi)動脈入顱，進(jìn)入大腦前動脈后回抽1～2 mm即插入大腦中動脈，此時，線栓黑色標(biāo)記點滑入頸總動脈分叉點1 mm，腦缺血計時開始。值得注意的是，如果線栓進(jìn)入頸內(nèi)動脈約10 mm就感到阻力明顯，則提示線栓極大可能誤入頸內(nèi)動脈上唯一的分支翼腭動脈，此時需要將線栓緩緩抽回，調(diào)整角度后重新插入。筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)，將線栓反復(fù)調(diào)整角度，仍極易插入翼腭動脈，考慮可能由于線栓本身彎度引起誤插，此時建議換取新線栓再次插入，這也是制備該模型最常見的失敗原因，需要術(shù)者付之耐心與細(xì)心。

4.4 縫合

術(shù)后縫合關(guān)于多余線栓的處理一般有2種，一種是埋在大鼠體內(nèi)，另一種是留在大鼠體外。將線栓埋在體內(nèi)是為了避免麻醉不充分的大鼠術(shù)后過度活動導(dǎo)致線栓脫出而致模型失敗，但在拔線栓時，需要再次暴露和二次縫合切口。筆者發(fā)現(xiàn)大鼠麻醉逐漸蘇醒過程中活動量明顯減小，在操作中采用將多余線栓留于體外的方法，同時將線栓用記號筆涂黑標(biāo)記便于識別。

5 術(shù)后再灌

國內(nèi)研究者在術(shù)后24 h分別對腦缺血后30 min、60 min和90 min再灌注大鼠進(jìn)行梗死面積評估，實驗發(fā)現(xiàn)缺血后30 min再灌注損傷較輕；缺血后60 min基底核損傷較前者重，皮質(zhì)有很輕微改變或無改變，病變不恒定；而缺血后90 min再灌注則在額頂葉皮質(zhì)及基底核區(qū)形成面積相對恒定的梗死灶，術(shù)后神經(jīng)缺損表現(xiàn)明顯[18]，能夠較好地模擬人腦局灶缺血后狀態(tài)。國外研究者亦多采用缺血后90 min作為缺血再灌注損傷模型[19]。因此，筆者選擇缺血后90 min再灌注，在大鼠體外傷口縫合處找到線頭，輕輕拔出線栓2～3 cm剪斷，若此時大鼠已完全清醒，可注射少量麻藥后再將線栓拔出，以防拔線栓時大鼠過度掙扎加大損傷。

6 術(shù)后護(hù)理與并發(fā)癥

術(shù)后更換干凈墊料并將大鼠放回鼠籠，用60N白熾燈距離大鼠25～35 cm處持續(xù)照射直至其蘇醒后再撤除，期間可將大鼠頭部微微墊高，以防側(cè)枝循環(huán)過快恢復(fù)。大鼠在術(shù)后1～3 d內(nèi)并發(fā)癥多，死亡率高，最常見的死亡原因包括：腦水腫；插線栓時用力過猛刺破血管致蛛網(wǎng)膜下腔出血；術(shù)中損傷迷走神經(jīng)致呼吸抑制。因此，術(shù)者在操作中一定要動作輕柔靈活，切不可使用蠻力。眼部感染和癲癇是術(shù)后最常見的并發(fā)癥，筆者使用金霉素眼膏在眼部感染處進(jìn)行外涂，1次/d，3～5 d可緩解；癲癇是由于腦缺血致?lián)p傷神經(jīng)元過多引起神經(jīng)元異常放電，癲癇大鼠均不納入實驗。同時，筆者密切關(guān)注大鼠飲水量變化，對于術(shù)后極度虛弱，飲水量明顯減少的大鼠，可予1%葡萄糖水灌胃，5 mL/只，2次/d，防止大鼠營養(yǎng)不良而致死亡。另外，應(yīng)盡量保持墊料干燥，每日更換墊料，控制室溫在25°C左右，可將食物放于籠中便于攝取，避免籠中大鼠只數(shù)過度、密度過高，這些因素均有利大鼠術(shù)后恢復(fù)。

7 模型評價

MCAO模型評價方法有多種，如神經(jīng)功能評分、TTC染色、腦組織含水量、局部腦血流測定和頭顱磁共振等。其中腦血流測定和頭顱磁共振檢查需要特定的儀器設(shè)備，費用高昂，其應(yīng)用具有一定局限性。TTC染色和腦組織含水量測定需要處死大鼠，能夠直觀地了解大鼠腦缺血情況，且實驗步驟簡單易行，是MCAO模型最常用的評價方法。神經(jīng)功能評分包括Bederson評分、Belayev評分、Clark評分等，其中Bederson評分是引用頻率最高的神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)[20]。神經(jīng)功能評分法直觀、簡便，可以從整體角度觀察動物神經(jīng)損傷程度，無需借助特殊儀器設(shè)備，但相對于其他評價方法，該法主觀、粗糙，無法準(zhǔn)確描述神經(jīng)損傷及恢復(fù)情況，故應(yīng)用時，常常聯(lián)合TTC染色和腦組織含水量測定評估模型而不將神經(jīng)功能評分作單獨使用。

8 結(jié)語

線栓MCAO模型的制備是目前研究腦缺血疾病最重要的手段之一，該模型也在不斷完善與改進(jìn)中。在模型制備中大體需要注意以下幾點：①一般選用260～280 g SD雄性大鼠作為動物模型；②合理選用麻醉藥物，現(xiàn)配現(xiàn)用，嚴(yán)格掌握藥物不良反應(yīng)與麻醉劑量；③手術(shù)操作規(guī)范化，采用合適的線栓，注意線栓插入的角度、深度與走向；④常采用缺血后90～120 min再灌注；⑤注意術(shù)后護(hù)理與并發(fā)癥的發(fā)生；⑥選擇合理的模型評價方法。在MCAO模型制備中，筆者發(fā)現(xiàn)該模型存在著一些局限性，包括同一體重范圍的大鼠血管構(gòu)造存在差異，導(dǎo)致線栓插入相同角度和深度，卻造成不同程度的神經(jīng)功能缺損；大鼠耐受性的不同會造成手術(shù)后缺血程度的不同。MCAO大鼠模型制備是一類精細(xì)手術(shù)，每一個環(huán)節(jié)都需要認(rèn)真仔細(xì)的對待，作為腦缺血研究的實驗基礎(chǔ)，必須重視操作的每一個步驟，反復(fù)練習(xí)，同時不斷地總結(jié)經(jīng)驗，這樣才能提高M(jìn)CAO模型制備的成功率。

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