陳科　李乾　郭添　李晨　楊小琳　趙金禮

【摘 要】目的：本文介紹一種抗炎寡肽EA-230（氨基酸序列為Ala-Gln-Gly-Val）的固相合成方法。實(shí)驗(yàn)在無(wú)水體系中以2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂為載體以Fmoc-保護(hù)的氨基酸為原料在DIC/HOBt體系中合成EA-230。目標(biāo)產(chǎn)物收率高，雜質(zhì)少，結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照一致。本文的合成方法操作簡(jiǎn)單，副產(chǎn)物少，重復(fù)性高，適用于批量生產(chǎn)制備。

【關(guān)鍵詞】EA-230；寡肽；2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂；固相合成

[Abstract] in this paper，an anti-inflammatory oligopeptide （EA-230）is introduced，which is based on 2-CTC resin with a peptide solid phase，and protected Fmoc-amino acid in DIC/HOBt solution. The synthesized target has high yield and purity， and the structure is right by LC-MS with the standard. It is simple and suitable to synthesize the product for much batches with this method and has little impurities.

[Key words] EA-230；oligopeptide；2-CTC resin；solid phase

【中圖分類號(hào)】R979.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-6851（2018）01-0-01

寡肽EA-230，又稱AQGV或者NMPF-46或者peptide-46，其氨基酸序列位Ala-Gln-Gly-Val，是一種具有抗炎作用的人絨毛膜促性腺激素相關(guān)的寡肽[1]，在膿毒癥和膿毒性休克以及缺血性修復(fù)方面有很好的療效[1][2]，正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)表明，其在腎衰竭方面的治療具備很好的效果。

日臻成熟并不斷發(fā)展的生物技術(shù)與多肽合成技術(shù)使得越來(lái)越多的多肽藥物被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于臨床。多肽藥物因其適應(yīng)癥廣、安全性高且療效顯著的特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病、心腦血管等疾病的預(yù)防、診斷和治療，多肽藥物的開(kāi)發(fā)已經(jīng)發(fā)展到疾病防治的各個(gè)領(lǐng)域，具有廣闊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。隨著新藥研發(fā)的不斷深入，目前多肽藥物的開(kāi)發(fā)已經(jīng)發(fā)展到疾病防治的各個(gè)領(lǐng)域如抗腫瘤、抗病毒、多肽疫苗、細(xì)胞因子模擬、抗菌、診斷、減肥等諸多方面。

寡肽是指氨基酸數(shù)目在10個(gè)左右的小分子多肽，其可以如小分子那樣穿越細(xì)胞膜，通過(guò)生理屏障，穿過(guò)血腦屏障，因而被用作藥物載體來(lái)輔助這些藥物穿過(guò)細(xì)胞膜。同時(shí)，一些多肽可以用作非靶向特異性的小分子藥物的靶向載體，通過(guò)細(xì)胞表面的特定受體將藥物傳遞到受體特異性的特定靶點(diǎn)細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞內(nèi)。多肽由于其降解后的產(chǎn)物為氨基酸，一般不會(huì)在特定器官組織中累積，容易通過(guò)肝和腎從體內(nèi)很快被清除掉，目前幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)由于異物代謝引起的毒理學(xué)等問(wèn)題，因而，一般沒(méi)有副作用或者副作用很小。

大量的生物試驗(yàn)表明EA-230能有效減輕大鼠同種異體腎移植后急性腎損傷和缺血性損傷[3]，能有效改善因衰退性炎癥和肝損傷（創(chuàng)傷）的出血引起的沖擊和復(fù)蘇[4]，減少鼠和恒河猴的膿毒性休克引起的死亡率[2]，對(duì)腎缺血再灌注損傷有較好的改善作用[1]，有文獻(xiàn)研究表明其于大鼠的妊娠有關(guān)系[5]。由于其在由腎衰竭引起的抗膿毒性休克和出血方面有優(yōu)異的效果，正處于臨床二期。由于其是“人源性肽”，安全性非常高。

目前，國(guó)際、國(guó)內(nèi)關(guān)于小分子多肽的研究比較多，然而關(guān)于寡肽EA-230的合成案例非常少。本文主要介紹一種固相合成寡肽EA-230的方法，以2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂為載體、以Fmoc保護(hù)的氨基酸為原料、按照其氨基酸序列逐個(gè)延伸縮合為方法，合成目標(biāo)肽鏈，將其酸解脫去樹(shù)脂可得到目標(biāo)產(chǎn)物的粗品，然后再對(duì)粗品進(jìn)行鑒定和純化得到最終產(chǎn)品[6]。

一、實(shí)驗(yàn)部分

1.主要的原料和試劑

Fmoc-Ala-OH（吉爾生化上海有限公司）；Fmoc-Gln（trt）-OH（吉爾生化上海有限公司）；Fmoc-Gly-OH（吉爾生化上海有限公司）；Fmoc-Val-OH（吉爾生化上海有限公司）；DMF（分析純，西安浩業(yè)化工有限公司）；DIC（吉爾生化上海有限公司）；HOBt（吉爾生化上海有限公司）；DIEA（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DCM（分析純，西安浩業(yè)化工有限公司）；異丙醇（分析純，西安浩業(yè)化工有限公司）；哌啶（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（分析純，西安浩業(yè)化工有限公司）；2-CTC Resin（天津南開(kāi)大學(xué)樹(shù)脂有限公司）。

2.主要儀器

超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司 KQ-500B）、循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司 SHB-Ⅲ）、電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司 SE6001F）、制備高效液相色譜儀（創(chuàng)新通恒LC3000）、分析高效液相色譜儀（日立全自動(dòng)L2000系列）、C18分析色譜柱（大連物理化學(xué)研究所4.6mm×250mm）、弱陰離子交換柱（自填體積為150mL 保賽生物科技公司填料 粒徑為45～165μm的DEAE高流速瓊脂糖微球）、C18制備色譜柱（成都科譜生物有限公司50mm×450mm）。

3.試驗(yàn)方法

（1）樹(shù)脂活化將3.0g 2-CTC-Resin樹(shù)脂（批號(hào)：G55S1133-2 ，交聯(lián)度：1%DVB 粒徑：100-200目， 取代度：1.05 mmol/g）加入反應(yīng)器中，加入50mL DCM，室溫?cái)嚢杞?-15分鐘使其充分溶脹活化；

（2）合成Fmoc-Val-2-CTC Resin肽樹(shù)脂endprint

在步驟（1）的樹(shù)脂中加入Fmoc-Val-OH（1.18g）、DIEA（2.1ml）、DCM 50ml，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，抽濾除去溶液，繼續(xù)加入Fmoc-Val-OH（1.07g）、HOBt（0.85g）、DIC（0.98ml）、DMF適量，室溫反應(yīng)1小時(shí)，抽濾除去溶液，樹(shù)脂用30ml異丙醇和30ml DMF各進(jìn)行洗滌兩次，得到FmoFmoc-Val-2-CTC Resin肽樹(shù)脂；

（3）將步驟（2）樹(shù)脂肽中加入30ml 20%哌啶的DMF溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30分鐘。抽濾去除溶液，再用50ml異丙醇和50ml DMF各進(jìn)行洗滌兩次，得到H-Val-2-CTC Resin肽樹(shù)脂，茚三酮檢測(cè)顯陽(yáng)性。

（4）合成Fmoc-Gly-Val-2-CTC Resin肽樹(shù)脂

在步驟（3）的樹(shù)脂中加入Fmoc-Gly-OH（1.88g，2當(dāng)量）、HOBt（1.28g，3當(dāng)量）、DIC（1.47ml，3當(dāng)量）、DIEA（2.1ml，4當(dāng)量 ）、DMF100ml，室溫反應(yīng)2小時(shí)，茚三酮檢測(cè)顯陰性，抽濾去除溶液，再用50ml異丙醇和50ml DMF各進(jìn)行洗滌兩次，得到Fmoc-Gly-Val-2-CTC Resin肽樹(shù)脂；

（5）將步驟（4）樹(shù)脂肽中加入50ml 20%哌啶的DMF溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30分鐘。茚三酮檢測(cè)顯陽(yáng)性，抽濾去除溶液，再用50ml異丙醇和50ml DMF各進(jìn)行洗滌兩次，得到H-Gly-Val-2-CTC Resin肽樹(shù)脂。

（6）合成H-Ala-Gln（Trt）-Gly-Val-2-CTC Resin肽樹(shù)脂

重復(fù)步驟（4）～（5），依次連接Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Ala-OH，得到Ala-Gln（Trt）-Gly-Val-2-CTC Resin肽樹(shù)脂；樹(shù)脂肽最后用50ml甲醇洗滌三次，干燥得4.5g H-Ala-Gln（Trt）-Gly-Val-2-CTC Resin肽樹(shù)脂。

（7）配制30ml樹(shù)脂切割液：將三氟乙酸、三異丙基硅烷、水、苯甲硫醚按體積比為88：5：3：4加入到燒杯內(nèi)攪拌混合；

樹(shù)脂切割：將4.5g樹(shù)脂加入到上述配置的30ml切割液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1.5小時(shí)，抽濾，濾液控制不高于40℃減壓脫除至基本無(wú)餾分，向其中加入30ml甲基叔丁基醚，超聲分散2小時(shí)后靜置1小時(shí)，過(guò)濾，固體用10ml甲基叔丁基醚洗滌，干燥得白色粗品肽1.5g。

二、結(jié)果討論

由圖中從分析圖可以看出純度>97%，得到純品1.12g，產(chǎn)率 95.72%。

三、結(jié)論

本文介紹了一種固相法合成EA-230的方法，具有操作簡(jiǎn)單快捷，純度高，易于分離純化，可重復(fù)性高的特點(diǎn)。相較于傳統(tǒng)的液相合成方案，解決了谷氨酰胺溶解性差和不穩(wěn)定的特點(diǎn)，合成時(shí)間短，操作步驟少，較大的減少了生產(chǎn)時(shí)間和純化成本，為以后批量生產(chǎn)提供了一種行之有效而又簡(jiǎn)單便捷的方法。endprint