針藥誘導骨髓間充質干細胞分化的研究進展※

符夢彬 陳恒偉 張玉溪 魏江艷 黎小僑 張 敏 趙 晶 劉英蓮 孫 曌

（海南醫(yī)學院中醫(yī)學院，海南 ?？?570100）

骨髓間充質干細胞（bone messenchymal stem cells，BMSCs）是一種來源于骨髓的具有多向分化潛能的原始細胞，近年來成為研究的熱點。在一定條件下BMSCs能分化成為軟骨細胞，神經元樣細胞，成骨細胞，心肌細胞等，且具有來源充足，取材方便，使用安全等特點[1]。許多研究表明針刺和中藥可能影響B(tài)MSCs的分化方向，本文通過分析文獻著重對針刺和中藥誘導骨髓間充質干細胞分化的研究進行綜述。

1 針藥誘導BMSCs分化為軟骨細胞

創(chuàng)傷和骨關節(jié)炎常常導致關節(jié)軟骨的退變，關節(jié)軟骨缺乏血管和神經，自身修復能力有限。研究發(fā)現(xiàn)在特定的條件下，能夠誘導BMSCs分化為軟骨細胞[2]。軟骨主要有膠原纖維和蛋白聚糖構成，而軟骨細胞的主要功能是分泌膠原蛋白的酸性黏多糖[3]，其中Ⅱ型膠原占大部分，它和糖胺聚糖是軟骨細胞的特征性標志[4]。

周信[5]采用針藥結合誘導大鼠BMSCs向軟骨細胞分化，通過分組實驗發(fā)現(xiàn)，針刺血清配合復方丹參注射液能有效促進BMSCs增殖和誘導其向軟骨細胞分化，但是單獨使用針刺血清并沒有這種作用。電針治療兔膝關節(jié)炎可見軟骨層增厚，細胞重排，延長治療時間可促使軟骨修復[6]。

張清林等[7]用TGF-β1、BMP-2聯(lián)合誘導BMSCs向軟骨細胞分化，細胞由長梭形變?yōu)槎嘟切?，分泌糖胺聚糖，有Ⅱ型膠原表達，說明該2種細胞因子均可單獨誘導BMSCs向軟骨細胞分化。黃荷等[8]采用淫羊藿甙體外誘導因骨關節(jié)炎行全髖關節(jié)置換手術的病人骨髓向軟骨細胞分化，糖胺聚糖含量豐富，Ⅱ型膠原含量多，淫羊藿甙可誘導hMSCs向軟骨細胞分化。馬篤軍等[9]則是用牛膝醇提物體外誘導兔BMSCs向軟骨細胞分化，Ⅱ型膠原熒光染色陽性明顯。牛膝性味平和，適于各種體質患者，適于長期服用；有明顯的引經作用，適于軟骨損傷的高發(fā)部位——膝關節(jié)；能標本兼顧，適于OA的各種類型；能同時治療多種中老年人常見病，適于OA的高發(fā)人群；藥物來源廣、價格低廉。湯治黎等[10]將大鼠BMSCs加入高糖DMEM培養(yǎng)液（含0.5%的復方丹參注射液、10%胎牛血清）誘導其向軟骨細胞分化，各組Ⅱ型膠原的陽性率呈弱陽性，表明丹參對大鼠BMSCs具有定向誘導作用和輔助改善作用。修忠標等[11]以鹿茸多肽體外誘導第3代兔BMSCs向軟骨表型分化，糖胺多糖含量及Ⅱ型膠原mRNA表達隨培養(yǎng)時間延長而增多，表明鹿茸多肽對BMSCs定向軟骨分化有明顯促進作用。

2 針藥誘導BMSCs分化為心肌細胞

目前，心臟疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅人類的生命健康，圍繞心血管疾病防治機制及相關藥物的研究越來越深入，體外培養(yǎng)心肌細胞既能保持原有結構及功能特點，又能排除神經-體液等因素影響，是一種較為理想的體外試驗方法[12]。心肌細胞呈短圓柱形，有分支，細胞核位于細胞中央，一般只有一個。檢測到有肌管的形成并表現(xiàn)出收縮特性；有竇房結樣和纖維細胞生長因子（bFGF），心肌特異性蛋白T（cTnT）、連接蛋白（Connexin43） 和α-肌動蛋白等心肌細胞特殊的表達標志，才能證實BMSCs向心肌細胞的分化[13]。

針刺手厥陰心包經對PKC表達、鈣超載均有抑制作用，而且通過心腦通絡液預處理、針刺后處理可減輕缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡，能夠降低再灌注損傷程度，對心肌有良好的保護作用[14-16]。李記泉等[17]證實了針刺手厥陰心包經內關穴保護缺血心肌具有循經特異性，內關穴和列缺穴可逆轉KChIP2 mRNA表達的下調，但內關穴較列缺穴療效顯著。電針內關穴還可以使失血性低血壓大鼠血壓顯著升高、心肌細胞PKA含量發(fā)生明顯變化[18]。

黃芪是用于防治心腦血管疾病的傳統(tǒng)中藥，黃芪甲苷是從黃芪中分離提純的一種皂苷，具有良好的強心作用，對缺血心肌細胞具有保護作用，能有效保護缺氧的心肌細胞，降低損傷程度，且對心肌肥大具有抑制作用。近年來不乏學者研究黃芪誘導BMSCs成為心肌細胞。趙靜苗等[19]和冼紹祥等[20]皆采用黃芪甲苷體外誘導BMSCs成為心肌細胞，誘導后細胞呈梭形，并出現(xiàn)肌管；BMSCs表面抗原CD44表達陽性， BMSCs不僅表達心肌特異性蛋白Desmin和cTnI，而且表達成熟的心肌特異性蛋白α-MHC和β-MHC。宋雪云等[21]在黃芪甲苷的基礎上聯(lián)合丹參酮IIa誘導BMSCs向心肌樣細胞分化。各組均表達肌鈣蛋白T，尤其丹參酮IIa和黃芪甲苷聯(lián)合組高于單一藥物組，說明兩者聯(lián)合誘導效果優(yōu)于單一成分，體現(xiàn)了中藥配伍多因多效多靶點的效應。除黃芪外，還有王新華等[22]用地黃低聚糖誘導BMSCs向心肌樣細胞分化，地黃低聚糖誘導后BMSCs細胞裂解液中cTnI、CK和CK-MB水平升高，與5-氮胞苷聯(lián)合應用后其誘導BMSCs內心肌特異性物質表達的作用較單藥更強。張金生等[23]在體外模擬心肌微環(huán)境的條件下使用益氣活血化瘀方藥誘導BMSCs向心肌樣細胞分化，實驗結果表明活血化瘀法與益氣活血法、益氣法均有促進BMSCs中的CD105陽性細胞分裂并向心肌樣細胞分化的作用，其中活血化瘀法效果最為明顯。

3 針藥誘導BMSCs分化為神經元樣細胞

臨床上常選用BMSCs作為種子細胞來治療缺血性腦疾病、帕金森病和脊髓損傷等神經系統(tǒng)疾病。1999年Kopen等[24]在對MSCs移植給正常新生小鼠的研究表明MSCs具有多向分化的潛能，不但分化為成熟的星形膠質細胞，而且分化為神經元，對于中樞神經系統(tǒng)疾病如腦缺血具有廣闊的治療前景。BMSCs對損傷腦的環(huán)境變化比較敏感，與缺血腦組織共培養(yǎng)的細胞可以產生BDNF、NGF、VEGF、HGF等神經營養(yǎng)因子和血管生長因子，BMSCs能夠提高神經營養(yǎng)因子表達也有可能是缺血腦卒中功能恢復的關鍵趨勢。

針刺在促進誘導神經元細胞的修復與再生已有一定的研究基礎，對內源性NSC的增殖活化，并定向分化形成新生的神經元。如“醒腦開竅”針法[25]可促進腦梗死神經功能恢復，通過誘導保護性基因表達，增強相關生長蛋白表達，促進神經網絡重建發(fā)揮促神經元重塑作用。針刺能促進骨髓間充質干細胞遷移和分化。涂江義等[26]利用電針刺激對外源性骨髓間充質干細胞在腦出血大鼠腦內分化的研究表明在同一時間點電針組與單純BMSCS組相比，NF-200與GFAP陽性細胞的陽性細胞率顯著上升。督脈電針和神經干細胞移植聯(lián)合應用使受損傷脊髓組織產生神經生長活性物質[27]。

近年來國內學者做了許多中藥及復方誘導BMSCs向神經元樣細胞分化的實驗研究，并取得了可喜的結果。王新生等[28]和曹慧等[29]皆采用不同濃度的黃芪注射液分組誘導BMSCs，免疫細胞學顯示NSE、NF均呈陽性，NSE基因表達明顯升高。黃芪首先誘導BMSCs向神經干細胞分化，然后促進其向神經元或神經膠質細胞的非特異性分化，并促進已分化的細胞進一步成熟、老化。侯陽等[30]運用黃芪多糖為誘導劑，BMSCs出現(xiàn)形態(tài)學變化，Tuj1陽性表達，逐步形成典型的神經元樣細胞。且實驗中表明應用化學誘導劑存在細胞只能短期存活的問題。常宏等[31]證實丹參注射液在體外可將大鼠骨髓間充質干細胞誘導分化為神經元樣細胞，免疫細胞學顯示巢蛋白、NSE、NF-M表達陽性。胡琳燕等[32]在此基礎上研究發(fā)現(xiàn)細胞在高鉀刺激下細胞內鈣流增加，細胞突觸發(fā)生胞吞胞吐，具有正常的突觸循環(huán)功能。杜紅陽等[33]使用地黃多糖誘導30分鐘后即可出現(xiàn)神經元樣細胞，表現(xiàn)為細胞胞質收縮，有突起長出，神經樣細胞神經標志物nestin，NSE，GFAP均有表達，且高于其他組。紅景天苷可通過抑制Ca2+/CaM信號通路或者激活ERK1/2和PI3K/mTOR信號通路，促進BMSCs向神經樣細胞定向分化[34-35]。

4 針藥誘導BMSCs分化為成骨細胞

由于各種原因造成的骨缺損的后期修復一直是骨科領域的難題之一。隨著細胞生物學和生物材料科學的發(fā)展，骨缺損的修復進入了組織工程學修復研究時代[36]。BMSCs在多種細胞因子和微環(huán)境的影響下能產生骨前細胞，然后形成骨原細胞、前成骨細胞、功能性骨形成細胞，最后形成成骨細胞[37]。成骨細胞是起源于間充質的骨祖細胞，培養(yǎng)細胞的形狀不能作為鑒別細胞類型的主要標志，堿性磷酸酶（AKP）是成骨細胞分化成熟標記酶，AKP染色強陽性是成骨細胞的重要特性之一[38]。此外，成骨細胞表型標志如骨鈣素、骨橋蛋白、Ⅰ型膠原和ALB及以體外礦化等功能特征，可作為成骨細胞鑒定標準[39]。

去卵巢大鼠針刺后血清能從基因水平影響成骨細胞OPG，RANKL的表達，具有促進破骨細胞凋亡、抑制破骨細胞骨吸收功能的作用，從而治療絕經后骨質疏松癥[40-41]。電針刺激“百會穴”可以在骨折的各個時期促進骨折愈合，加速骨折部位神經修復；持續(xù)電針刺激不僅可使破骨細胞、成骨細胞、成纖維細胞、軟骨細胞增多，還可使骨痂生成時間提前、體積增大，促進骨折愈合[42]。

杜仲是中國名貴滋補中藥，主入肝、腎經，具有補益肝腎、強筋壯骨、防止肌肉骨骼老化等功效。朱麗華等[43]應用醇提、沉淀、層析和色譜方法初步分離了杜仲誘導BMSCs成骨分化的有效成分，高效液相色譜儀獲得的其中2個組具有顯著刺激BMSCs成骨分化標志基因堿性磷酸酶表達的作用，但2個組分還不能確定已經為化學單體。張賢等[44]實驗提示杜仲中含有多種復雜成分會導致誘導后形成鈣化結節(jié)的細胞與成脂分化的細胞共存于同一培養(yǎng)板中，成骨標志基因堿性磷酸酶和成脂標志基因過氧化酶體增殖物激活受體均上調。陳偉才等[45]發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物能誘導BMSCs分化為成骨細胞，同時抑制其向脂肪細胞分化，其中10-4，10-5g/mL的杜仲葉提取物作用明顯。曾建春等[46]實驗證實肉蓯蓉含血清可誘導BMSCs向成骨細胞分化，松果菊苷作為肉蓯蓉中的一種生物活性成分，可能是肉蓯蓉中發(fā)揮誘導BMSCs向成骨細胞分化的有效成分。尉大為等[47]就這一方向進行探索，并取得實驗結果，松果菊苷可以促進體外培養(yǎng)的BMSCs向成骨細胞分化，其作用機制與BMP2、Smad1、Runx2表達增加有關。武密山等[48]實驗結果認為川續(xù)斷皂苷VI具有促進BMSCs增殖和向成骨細胞分化的能力，并在基因水平上為篩選促進骨形成的有效藥物提供了作用靶點。李樹強等[49]實驗結果表明土鱉蟲防治激素性股骨頭缺血壞死的機制不僅是改善股骨頭的微循環(huán)，同時還與其抑制激素誘導下的BMSCs成骨分化減少有關。除單味中藥外，還有許多學者應用方劑進行誘導BMSCs骨向分化。其中，顏春魯?shù)萚50]應用補腎方劑加味左歸丸可明顯促進大鼠BMSCs向成骨細胞分化，改善骨組織的質量，促進骨組織再生。

骨髓間充質干細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復，特別是對于治療血液系統(tǒng)、心腦血管、骨缺損、骨折不可自愈等疾病尤為重要。針刺屬于較為環(huán)保的治療方法，對人體基本無影響，通過疏通經絡、行氣活血，達到調理人體機能的作用。針刺療法對外科病有較好的治療作用，如骨質增生、勞損均有較好的療效。尤其骨折后出現(xiàn)的強直性關節(jié)炎，通過針灸、中藥熏洗，可達到較好的效果，且無毒、副作用。但是有關針刺誘導BMSCs分化為軟骨細胞和心肌細胞的報道鮮少。中藥同樣具有價廉、安全性高等多項優(yōu)點，通過對天然中藥以及其醇取物、復方誘導BMSCs的定向分化，可使其作為種子細胞治療更多疾病，開拓更為寬廣的領域。相信隨著對BMSCs的不斷深入研究，針刺和中藥誘導BMSCs的多向分化的重要作用將得到更好發(fā)展。