巖藻低聚糖的酶法制備及活性分析

王鳳舞，闕 斐，寇玲赟，遲 方，王 瑩,*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，山東 青島 266109；2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

巖藻聚糖硫酸酯又稱巖藻多糖、褐藻糖膠，是一種高分子質(zhì)量硫酸雜多糖。經(jīng)研究表明，它具有廣泛的藥理學(xué)活性，包括抗氧化、抗凝血、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗菌抗病毒、降血糖血脂、促益生菌生長[1-4]等。巖藻聚糖硫酸酯在治療癌癥、糖尿病、肥胖等領(lǐng)域也具有良好的應(yīng)用前景，目前已經(jīng)成為海洋藥物研究的熱點之一[5-8]。在美國、日本、德國和挪威，該糖均已經(jīng)作為治療的候選藥物進入臨床研究[9]；在俄羅斯已作為一種多功能保健食品于2006年上市[10]；在中國作為一種治療慢性腎病[8]的海洋藥物的主要成分，也已經(jīng)成功開發(fā)上市[11-12]。

巖藻聚糖硫酸酯的相對分子質(zhì)量從幾萬到幾十萬不等，而大分子多糖口服生物利用度較低，對其進行降解獲得低分子質(zhì)量的產(chǎn)物是提高其生物利用度的有效手段[13-15]。研究報道，分子質(zhì)量在5～50 kDa的巖藻聚糖硫酸酯具有更高的生物活性[16]，比如：對于抗氧化、抗血栓、抗炎、抗補體、抑制癌細胞等方面都比大分子多糖具有優(yōu)勢[17-22]。低分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯的抗氧化活性不僅與分子質(zhì)量有關(guān)系，還與硫酸根的含量、取代基位置等因素有密切關(guān)系[23-26]。目前，在巖藻聚糖硫酸酯的降解方法中，酶法降解由于其專一性強、條件溫和、不損失硫酸根、重復(fù)性好等優(yōu)勢，被公認為最理想的方法。

目前，有關(guān)巖藻聚糖硫酸酯酶解產(chǎn)物抗氧化活性的報道較少，少數(shù)的研究也都是在實驗選定的水平中進行比較尋優(yōu)，沒有實現(xiàn)在整個范圍內(nèi)進行最優(yōu)化。鑒于上述方法過程高度的復(fù)雜性，實驗運用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與遺傳算法[27-28]聯(lián)合對酶解過程進行最優(yōu)化，從而實現(xiàn)在指定范圍內(nèi)得到最高抗氧化活性的酶解產(chǎn)物。為進一步驗證人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法聯(lián)合對酶解條件的預(yù)測與優(yōu)化是否準確，對酶解產(chǎn)物的抗氧化活性進行體內(nèi)實驗對比驗證，為生產(chǎn)應(yīng)用提供一定實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)酶菌MD3由山東省中韓食品生物技術(shù)研究中心前期篩選獲得；SPF級雄性小白鼠，8 周齡，由青島大任富城畜牧有限公司提供。

巖藻聚糖硫酸酯 日照潔晶海洋生物技術(shù)開發(fā)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；VC青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院；丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抑制羥自由基能力以及蛋白質(zhì)定量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；C-buffer（20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl溶液，含0.2 mol/L NaCl）。

種子培養(yǎng)基：巖藻聚糖質(zhì)量分數(shù)0.2%，蛋白胨質(zhì)量分數(shù)0.4%，用過膜海水配制；產(chǎn)酶培養(yǎng)基：巖藻聚糖質(zhì)量分數(shù)0.2%，蛋白胨質(zhì)量分數(shù)0.2%，用過膜海水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；UH-1200B超聲波細胞破碎儀 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；FD-1D-80冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；DU-800型紫外-可見分光光度計 美國貝克曼公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；1100高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；PPM-18S/T膜分離設(shè)備 三達膜（廈門）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 巖藻聚糖硫酸酯酶的制備

將活化后的菌種MD3接種于種子培養(yǎng)基，25 ℃、180 r/min水浴恒溫振蕩器培養(yǎng)12 h制備一級種子液。隨后按照體積分數(shù)10%接入250 mL三角瓶（裝50 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基），25 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，獲得發(fā)酵產(chǎn)物。隨后將培養(yǎng)液在10 000 r/min冷凍離心10 min，收集菌體。每2 g濕菌體用50 mL冷凍C-buffer復(fù)溶，在冰浴保護下于500 W進行超聲破碎15 min（工作5 s，停止5 s），10 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液得到粗酶液，將其冷凍干燥成粉末備用，在使用時用蒸餾水復(fù)溶至凍干前的體積。

1.3.2 酶活力測定

酶活力的測定采用鐵氰化鉀法，具體步驟參考王瑩[30]方法。

1.3.3 基本酶解工藝條件優(yōu)化

量取2 mg/mL巖藻聚糖樣液（用C-buffer溶解）4 mL，按加酶量12 U/mg加入巖藻聚糖硫酸酯酶，調(diào)節(jié)C-buffer用量，使反應(yīng)體系總體積為10 mL，在25 ℃、120 r/min水浴振蕩器酶解2 h，所得酶解液于80 ℃滅酶20 min，10 000 r/min離心15 min，取上清液，備用?？疾旒用噶浚?、6、12、18、24、30、36 U/mg）、酶解時間（0、5、10、15、20、25 h）、酶解溫度（20、25、30、35、40、45、50 ℃）3 個因素對酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布及DPPH自由基清除率的影響，確定后續(xù)試驗的優(yōu)化范圍。并在此優(yōu)化范圍內(nèi)，參照均勻設(shè)計和正交試驗原理，設(shè)計122 組試驗，從而為BP網(wǎng)絡(luò)的建模提供“教師信號”，并為后續(xù)遺傳算法的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1.3.4 分子質(zhì)量分布測定

以高效凝膠排阻色譜方法檢測分子質(zhì)量的變化。色譜條件如下：色譜柱：TSK-gel G4000 PWXL（30 cm×7.8 mm，10 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：0.2 mol/L NaCl溶液；流速：0.5 mL/min；檢測器：示差檢測器。以分子質(zhì)量為4.11、5、66.9、140、148 、410、670 kDa的葡聚糖系列為標準品。采用Agilent GPC軟件分析分子質(zhì)量分布。

1.3.5 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模

使用3 層前向神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬酶解條件與產(chǎn)物抗氧化活性的關(guān)系，學(xué)習(xí)方法采用BP算法[29]。建模過程選用前饋式3 層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，輸入層有3 個神經(jīng)元，分別為酶解時間、加酶量、酶解溫度。隱含層為一層，并通過試行誤差法確定神經(jīng)元個數(shù)，輸出層有1 個神經(jīng)元，代表酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。參照均勻設(shè)計和正交設(shè)計的思想，在試驗考察范圍內(nèi)，設(shè)計實施122 組試驗，隨機選取其中的107 組數(shù)據(jù)作為BP網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練樣本，剩余的15 組數(shù)據(jù)作為檢驗樣本。上述建模過程利用Matlab軟件實現(xiàn)，輸出層采用Purelin函數(shù)作為傳遞函數(shù)，訓(xùn)練函數(shù)為Traingdm，設(shè)定BP網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練步數(shù)為2000，網(wǎng)絡(luò)性能的目標誤差為0.01。

1.3.6 遺傳算法優(yōu)化

利用Matlab軟件的遺傳算法工具箱對上述BP網(wǎng)絡(luò)模型進行尋優(yōu)。以BP網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測結(jié)果的相反數(shù)作為適應(yīng)度函數(shù)返回值編寫成M文件，作為遺傳算法的調(diào)用函數(shù)，進行尋優(yōu)。初始種群數(shù)目設(shè)定20，變異概率0.05，交叉概率0.75，最大傳代數(shù)為100 代，其他參數(shù)設(shè)定為軟件默認。

1.3.7 體內(nèi)實驗樣品的制備

在1.3.3節(jié)基本酶解工藝條件下，選用遺傳算法尋優(yōu)獲得的最優(yōu)酶解條件，在此條件下對巖藻聚糖硫酸酯進行酶解。將上清液經(jīng)截留分子質(zhì)量為250 Da的超濾膜過濾，除去小分子鹽類。截留液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮后冷凍干燥，得到巖藻低聚糖組；巖藻聚糖硫酸酯組為提前將酶于80 ℃滅酶20 min后，其余制備流程與巖藻低聚糖組相同。

1.3.8 小鼠的分組與飼養(yǎng)

將40 只標記好的小鼠分成5 組，分別為：空白組、模型組、陽性組、巖藻聚糖硫酸酯組和巖藻低聚糖組。將小鼠在溫度（20±2）℃進行飼養(yǎng)，讓小鼠自由取食3 d，以適應(yīng)環(huán)境。3 d后，用200 mg/（kg·d）（以體質(zhì)量計，下同）的D-半乳糖（20 mg/mL）皮下注射各組小鼠（空白組用等量生理鹽水注射），建立小鼠衰老模型。空白組和模型組小鼠灌胃0.1 mL/（10 g·d）的生理鹽水，陽性組小鼠灌胃等體積VC，劑量為200 mg/（kg·d），巖藻聚糖硫酸酯組和巖藻低聚糖組分別灌胃等體積劑量為200 mg/（kg·d）凍干樣品（用生理鹽水溶解）。每天定時灌胃1 次，皮下注射1 次，持續(xù)42 d。

1.3.9 小鼠的血漿和肝臟組織上清液的制備

在處死小鼠之前的24 h，停止喂食，保障自由飲水。取小鼠眼球血1～2 mL于預(yù)先加入10 μL 50%檸檬酸鈉的2 mL離心管內(nèi)，4 000 r/min、4 ℃低溫離心5 min，取上清液，備用。脫頸處死小鼠，解剖取肝臟，-20 ℃保存。使用時用組織研磨器研磨均勻，制成10%肝臟組織勻漿，5 000 r/min、4 ℃低溫離心5 min，取上清液備用。1.3.10 抗氧化能力的測定

體外實驗抗氧化能力采用DPPH自由基清除率測定方法，參照王瑩[30]方法。體內(nèi)抗氧化能力依據(jù)CAT活性、抑制羥自由基能力及MDA含量測定，參見試劑盒說明書。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 加酶量對產(chǎn)物分子質(zhì)量分布和DPPH自由基清除率的影響

圖1 加酶量對酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布和DPPH自由基清除率的影響Fig. 1 Effects of enzyme concentration on molecular weight distribution and DPPH scavenging activity of hydrolysates

在不同加酶量條件下，會獲得不同分子質(zhì)量的巖藻聚糖硫酸酯，同時，其分子質(zhì)量與其生物活性存在著很大的相關(guān)性[18,20,31-32]。由圖1可知，在25 ℃酶解2 h的條件下，加酶量達到24 U/mg以上時，酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量均不存在顯著差異（P＞0.05），說明酶的作用完全；且當加酶量在0～24 U/mg范圍內(nèi)時，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率出現(xiàn)了顯著變化，涵蓋了最小值16.32%和最大值70.44%，這個范圍屬于酶的有效降解范圍，因此，綜合分子質(zhì)量的變化結(jié)果，選擇加酶量范圍為0～24 U/mg。

2.2 酶解時間對產(chǎn)物分子質(zhì)量分布和DPPH自由基清除率的影響

圖2 酶解時間對酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布和DPPH自由基清除率的影響Fig. 2 Effects of hydrolytic time on molecular weight distribution and DPPH scavenging activity of hydrolysates

由圖2A可知，在加酶量12 U/mg、酶解溫度25℃條件下，酶解5、10、15、20、25 h時酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布沒有顯著性差異（P＞0.05），說明酶解5 h酶已經(jīng)作用完全，且在5 h以內(nèi)產(chǎn)物的DPPH自由基清除率就涵蓋了最高值（51.18%）和最低值（16.50%），因此應(yīng)該繼續(xù)補充8 h以內(nèi)的酶解實驗。由圖2B可知，酶解4 h以后產(chǎn)物分子質(zhì)量分布沒有顯著性差異，且0～4 h內(nèi)酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率出現(xiàn)整個范圍內(nèi)的最高值（66.13%）和最低值（16.50%），屬于酶的有效降解范圍，因此后續(xù)優(yōu)化試驗范圍設(shè)定在0～4 h。

2.3 酶解溫度對產(chǎn)物分子質(zhì)量分布和DPPH自由基清除率的影響

圖3 酶解溫度對酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布和DPPH自由基清除率的影響Fig. 3 Effects of hydrolytic temperature on molecular weight distribution and DPPH scavenging activity of hydrolysates

由圖3可知，在加酶量12 U/mg、酶解時間2 h條件下，酶解溫度達到40 ℃以上，對酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量沒有顯著影響（P＞0.05），在20～40 ℃內(nèi)，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率涵蓋了最低值（30.68%）和最高值（75.40%），屬于酶的有效降解范圍，因此，綜合分子質(zhì)量的變化結(jié)果，將酶解溫度設(shè)定為20～40 ℃。

綜合上述單因素試驗結(jié)果，選擇加酶量0～24 U/mg、酶解時間0～4 h、酶解溫度20～40 ℃作為人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的模擬范圍。

2.4 BP網(wǎng)絡(luò)模型的建立

在優(yōu)化范圍內(nèi)實施122 組試驗作為BP網(wǎng)絡(luò)的教師信號，數(shù)據(jù)見表1，檢驗樣本數(shù)據(jù)見表2。通過Matlab軟件，利用教師信號對上述BP網(wǎng)絡(luò)模型對DPPH自由基清除率進行訓(xùn)練。試錯法確定BP網(wǎng)絡(luò)模型隱含層神經(jīng)元個數(shù)為20 個，BP網(wǎng)絡(luò)模型經(jīng)過不到50 步訓(xùn)練后，網(wǎng)絡(luò)性能達到穩(wěn)定。15 個檢驗樣本的預(yù)測誤差總和為49.8，其中最大誤差小于8%（圖4），說明該BP網(wǎng)絡(luò)模型能夠很好地模擬酶解過程產(chǎn)物的DPPH自由基清除率，該模型訓(xùn)練總時間僅為3.3 s，說明建模過程十分快速。

表1 BP網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練樣本Table1 Training samples for BP network

表2 BP網(wǎng)絡(luò)檢驗樣本Table2 Test samples for BP network

圖4 BP網(wǎng)絡(luò)預(yù)測與期望輸出Fig. 4 Predicted and expected output of BP network

2.5 應(yīng)用GA對酶解條件進行尋優(yōu)

圖5 GA的尋優(yōu)進化曲線Fig. 5 Evolutionary curve of GA optimization

利用Matlab軟件GA工具箱，經(jīng)過51 代進化，由圖5可知，GA尋優(yōu)得到最大DPPH自由基清除率85.1%，對應(yīng)的酶解條件為酶解溫度26.4 ℃、酶解時間2.3 h、加酶量20.7 U/mg。

2.6 最優(yōu)結(jié)果驗證

以最優(yōu)條件為基礎(chǔ)，在酶解溫度26 ℃、酶解時間2.3 h、加酶量20.7 U/mg的條件下進行巖藻聚糖硫酸酯的酶解，測定酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達到83.7%，與預(yù)測值85.1%誤差僅1.4%，說明利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與遺傳算法聯(lián)合的方法對酶解過程進行尋優(yōu)是可行的。并利用高效凝膠排阻色譜測定酶解產(chǎn)物的重均分子質(zhì)量為18.2 kDa。

2.7 體內(nèi)抗氧化實驗結(jié)果

表3 小鼠血漿和肝臟組織中CAT活性、MDA含量、羥自由基抑制能力Table3 CAT activity, MDA content and hydroxyl radical scavenging activity in rat serum and liver tissues

由表3可知，模型組與空白組相比，模型組小鼠的肝臟組織和血漿的CAT活性、羥自由基抑制能力有顯著性下降，MDA含量顯著升高說明模型建立成功。與模型組相比，巖藻聚糖硫酸酯組和巖藻低聚糖組小鼠的肝臟組織和血漿的CAT活性和羥自由基抑制能力都有顯著提高，MDA含量顯著降低，說明巖藻聚糖硫酸酯和巖藻低聚糖都具有抗氧化能力。且?guī)r藻低聚糖組肝臟和血漿的CAT活性、羥自由基抑制能力顯著高于巖藻聚糖硫酸酯組，MDA含量顯著低于巖藻聚糖硫酸酯組，說明小分子的巖藻低聚糖有更好的抗氧化效果。與陽性對照組VC相比，巖藻聚糖硫酸酯組抗氧化能力較弱，巖藻低聚糖組與其相當（除血漿中抑制羥自由基能力以外）；上述結(jié)果可以說明，巖藻低聚糖組比巖藻聚糖硫酸酯組具有更顯著的抗氧化活性，進一步印證BP網(wǎng)絡(luò)模型與遺傳算法聯(lián)合優(yōu)化效果顯著，所獲得的巖藻聚糖硫酸酯酶法降解產(chǎn)物抗氧化活性顯著增強。

3 討 論

本實驗運用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法，以產(chǎn)物抗氧化活性為指標優(yōu)化酶解條件，實現(xiàn)了整個酶解范圍內(nèi)的優(yōu)化。宋亮[33]、王共明[34]、楊青丹[35]等都是通過使用單因素試驗、正交試驗等來優(yōu)化酶解工藝；文獻[36-37]研究發(fā)現(xiàn)DPPH自由基清除率與其分子質(zhì)量有關(guān)，且分子質(zhì)量越小抗氧化活性越好；Millet等[38]從鉤角藻巖藻多糖中得到了低分子質(zhì)量（8 kDa）的組分，發(fā)現(xiàn)其具有很高的抗血栓活性；Zhuang Cun等[39]從鼠尾藻中分離出多個不同分子質(zhì)量的巖藻低聚糖組分，并發(fā)現(xiàn)巖藻低聚糖組分顯著延長了患癌小鼠的存活時間，存活率分別比對照組高了3.49 倍和2.15 倍。但上述所有的研究都是在很小的實驗范圍內(nèi)進行比較尋優(yōu)，沒有實現(xiàn)多維空間內(nèi)的最優(yōu)化。本實驗發(fā)現(xiàn)當酶解溫度、加酶量、酶解時間分別為20～40 ℃、0～24 U/mg、0～4 h時，酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量會發(fā)生顯著變化，以此作為優(yōu)化范圍。通過107 組試驗數(shù)據(jù)作為教師信號的訓(xùn)練樣本，建立了模擬巖藻聚糖硫酸酯酶解過程的BP網(wǎng)絡(luò)模型，并利用15 組數(shù)據(jù)對模型進行檢驗，所建模型預(yù)測值與實際輸出誤差小于8%，該模型訓(xùn)練總時間僅為3.3 s，可以用于對酶解過程的模擬。利用遺傳算法對上述模型進行尋優(yōu)，得到酶解產(chǎn)物的最大DPPH自由基清除率為85.1%，此時對應(yīng)的酶解條件為酶解溫度26.4 ℃、酶解時間2.3 h、加酶量20.7 U/mg，測得上述酶解產(chǎn)物的重均分子質(zhì)量為18.3 kDa?？紤]到實際生產(chǎn)，在酶解溫度26 ℃、酶解時間2.3 h、加酶量20.7 U/mg時進行酶解，測得其DPPH自由基清除率為83.7%。并測得上述酶解產(chǎn)物的重均分子質(zhì)量為18.2 kDa。體內(nèi)動物實驗結(jié)果表明，巖藻低聚糖比巖藻聚糖硫酸酯在清除羥自由基、降低MDA含量及CAT活性方面具有更顯著的抗氧化作用，為工業(yè)化制備高抗氧化活性巖藻聚糖硫酸酯酶解產(chǎn)物提供了實驗支撐。同時，利用BP網(wǎng)絡(luò)并聯(lián)合GA進行尋優(yōu)的模式，可以推廣到酶解產(chǎn)物的任意一種生物活性，只要實驗誤差在合理的范圍內(nèi)，便可期待進行模擬和尋優(yōu)。

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