韓愚弟，白 云，任 靜，韓 巖

解放軍總醫(yī)院 整形修復(fù)科，北京 100853

近年來(lái)研究表明，干細(xì)胞所發(fā)揮的作用在很大程度上是由其強(qiáng)大的旁分泌功能而實(shí)現(xiàn)的，而不是其在特定部位的增殖和分化[1]。1986年，Eberhard和Johnstone首次在體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞上清中發(fā)現(xiàn)了一種有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，將其命名為外泌體(exosome)。隨后的10年，外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的“排泄物”，并未受到重視。直到20世紀(jì)90年代，外泌體膜被發(fā)現(xiàn)可以攜帶Ⅰ型和Ⅱ型主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)抗原提呈分子(MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ)，參與淋巴細(xì)胞免疫[2]。21世紀(jì)初，Lotvall發(fā)現(xiàn)細(xì)胞之間可以通過(guò)外泌體中的RNA交換遺傳物質(zhì)，人們逐漸意識(shí)到到外泌體可能存在重要生理功能[3]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可能作為細(xì)胞與細(xì)胞之間的通訊工具而參與了旁分泌作用，并被發(fā)現(xiàn)在多種病理生理過(guò)程及疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，遂逐漸成為腫瘤免疫領(lǐng)域以及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[4-5]。本文將對(duì)外泌體的形成、作用機(jī)制以及間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來(lái)源外泌體在再生修復(fù)和抗衰老方面的作用以及未來(lái)研究方向做一綜述[6]。

1 外泌體的特點(diǎn)及其作用機(jī)制

外泌體(exosomes)是一種由細(xì)胞分泌的直徑為40 ～150 nm、密度范圍為1.09 ～ 1.18 g/ml的具有雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)的囊泡樣物質(zhì)。目前已經(jīng)從各物種、各類型的細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取出了外泌體，如神經(jīng)元細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨核細(xì)胞等。外泌體也被發(fā)現(xiàn)存在于人體的各類體液中，如血液、唾液、尿液、乳汁等[7]。存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清及各種體液中的囊泡并不完全相同，已有的研究顯示其大致分為三個(gè)亞群：直徑最小的為外泌體，以及微囊泡(microvesicles)和凋亡小體(apoptotic bodies)，后兩者的直徑均＞200 nm，且產(chǎn)生的機(jī)制與外泌體不同[8]。

現(xiàn)有研究認(rèn)為，不同類型細(xì)胞外泌體的產(chǎn)生大同小異[9]。首先，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)或細(xì)胞膜通過(guò)內(nèi)吞形成早期內(nèi)體(early endosomes)，經(jīng)胞內(nèi)運(yùn)輸演變?yōu)橥砥趦?nèi)體(late endosomes)，隨著某些病理生理過(guò)程的進(jìn)行，一些“貨物”(miRNA，熱休克蛋白，細(xì)胞因子等)被攜帶進(jìn)入。晚期內(nèi)體內(nèi)部產(chǎn)生許多小囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，最后形成具有蛋白運(yùn)輸與分揀中心功能的多囊泡體(multivesicular body，MVB)。隨后，這些小囊泡會(huì)被釋放到胞外，形成外泌體。此過(guò)程需要內(nèi)體運(yùn)輸分揀復(fù)合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)和液泡蛋白分選因子(vacuolar protein sorting 4，Vps4)的協(xié)助。被釋放入體液的外泌體，隨著循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)其他組織或器官，作用于其他靶細(xì)胞。不同來(lái)源的外泌體會(huì)通過(guò)3種機(jī)制和內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞：1)外泌體進(jìn)入受體細(xì)胞后，將“貨物”釋放進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)，并重新形成多泡體；2)外泌體將“貨物”釋放進(jìn)入胞質(zhì)，自身與細(xì)胞膜融合；3)外泌體上膜表面配體與靶細(xì)胞膜特殊受體結(jié)合，同時(shí)起到信號(hào)傳導(dǎo)以及將“貨物”運(yùn)入胞內(nèi)的作用。外泌體具體組成成分與其母細(xì)胞有關(guān)，但整體較保守，一般都含有下列物質(zhì)：四跨膜蛋白(CD9、CD81、CD63)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90)、MHCⅠ類和(或)Ⅱ類分子、整合素、細(xì)胞骨架蛋白(TSG101、ALIX)等[3,10]。這些分子與外泌體的生物學(xué)功能密不可分，同時(shí)也可以作為鑒定外泌體的標(biāo)記物。因細(xì)胞內(nèi)部囊泡(外泌體等)合成運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制的重要發(fā)現(xiàn)，美國(guó)科學(xué)家Rothman、Schekmam，以及德國(guó)科學(xué)家Sudhof聯(lián)合獲得了2013年的諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，他們的發(fā)現(xiàn)使外泌體的研究到達(dá)了全新的高度。

2 外泌體在組織損傷修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)中的作用

近年來(lái)大量文獻(xiàn)報(bào)道了外泌體在心肌缺血再灌注損傷及心肌梗死修復(fù)方面發(fā)揮重要作用[1,11]。2015年，心血管領(lǐng)域權(quán)威雜志Circulation Research首次證實(shí)胚胎干細(xì)胞在心梗中的治療作用[12]。該研究發(fā)現(xiàn)，小鼠心梗造模成功后在心梗邊緣區(qū)注射外泌體，4周后心臟超聲、心梗面積等各項(xiàng)指標(biāo)均明顯改善。組織病理切片證實(shí)外泌體同樣促進(jìn)了血管新生(毛細(xì)血管密度)和心肌細(xì)胞增殖。此外，基因芯片證實(shí)外泌體中攜帶的miRNA290在促進(jìn)心肌前體細(xì)胞的存活及增殖方面起到重要作用。除了干細(xì)胞外泌體，內(nèi)源性血漿外泌體也可為心臟提供保護(hù)作用。英國(guó)倫敦大學(xué)的研究者證實(shí)，大鼠心梗模型中，術(shù)前尾靜脈注射血漿外泌體，心肌梗死面積可以從48%降至25%[13]。該研究進(jìn)一步證明，外泌體通過(guò)其膜表面上的熱休克蛋白HSP70結(jié)合受體細(xì)胞膜表面的toll樣受體4，從而靶向介導(dǎo)了心肌保護(hù)的功能。在肌肉重塑和修復(fù)過(guò)程中，肌肉干細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞)和骨骼肌中的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)之間的相互作用至關(guān)重要。衛(wèi)星細(xì)胞激活后可以在ECM內(nèi)產(chǎn)生肌源性祖細(xì)胞(myogenic progenitor cells，MPCs)，反過(guò)來(lái)ECM在過(guò)度沉積和老化期間也影響衛(wèi)星細(xì)胞的活性。美國(guó)肯塔基大學(xué)的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，MPCs分泌攜帶miR-206的外泌體，可抑制成纖維細(xì)胞中膠原合成的主要調(diào)節(jié)劑Rrbp1，以防止ECM的過(guò)度沉積。揭示了骨骼干/祖細(xì)胞與其他類型細(xì)胞相互作用以調(diào)節(jié)外環(huán)境穩(wěn)態(tài)、維持自適應(yīng)[14]。

各種原因造成的難愈性創(chuàng)面和瘢痕形成是軟組織修復(fù)面臨的棘手問(wèn)題。近年研究證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，包括iPS誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞，都具有促進(jìn)動(dòng)物模型創(chuàng)面愈合的能力[15-16]。這些功能主要依賴外泌體攜帶的microRNAs，如miR31、miR125a，作為刺激信號(hào)，促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和血管生成[17-19]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)外泌體在皮膚缺損小鼠模型中，可減少瘢痕形成和肌成纖維細(xì)胞的增殖。高通量測(cè)序和功能分析證明，外泌體攜帶的miR-21、miR-23a、miR-125b和miR-145抑制了TGF-β2/SMAD2信號(hào)通路，從而抑制肌成纖維細(xì)胞的形成，進(jìn)而阻止了瘢痕形成[20]。

在骨組織修復(fù)方面，外泌體也可以單獨(dú)或與其他生物材料聯(lián)合應(yīng)用，起到修復(fù)骨及軟骨缺損的作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分泌的外泌體，能有效促進(jìn)雌激素去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠模型中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化[22]。在此基礎(chǔ)之上發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞外泌體+β-磷酸三鈣支架的組合，較單純?chǔ)?磷酸三鈣支架具有更好的骨缺損修復(fù)作用[23]。關(guān)節(jié)軟骨的乏再生能力是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)治療中的巨大挑戰(zhàn)。上海交大附屬第六人民醫(yī)院與華東理工大學(xué)的科研工作者合作研發(fā)了一種光敏水凝膠，液體狀態(tài)時(shí)可以復(fù)合干細(xì)胞外泌體，光照后變成凝膠狀，填充在軟骨缺損部位充當(dāng)外泌體載體以及軟骨再生的支架材料，促進(jìn)細(xì)胞沉積在軟骨缺損部位，最終促進(jìn)軟骨缺損修復(fù)[24]。其優(yōu)點(diǎn)為易于操作，具有極好的生物相容性。更有研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)腔滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體也可以增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)軟骨組織的再生能力[25]。

3 外泌體與抗衰老

有研究表明，小鼠下丘腦神經(jīng)干細(xì)胞(hypothalamic neural stem cell，htNSC)的損耗，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)了衰老的癥狀以及生命周期縮短。向衰老小鼠腦室注射神經(jīng)干細(xì)胞外泌體可以延緩腦衰老速度，延長(zhǎng)小鼠壽命[26]。研究還顯示，外泌體攜帶的miRNA能夠部分調(diào)節(jié)htNSC的抗老化效應(yīng)，并在htNSC進(jìn)入腦脊髓液后發(fā)揮相應(yīng)作用。在皮膚抗衰老方面，韓國(guó)的Kim等[27]研究發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以輕易穿透角質(zhì)層到達(dá)真皮，促進(jìn)人皮膚組織Ⅰ型膠原和彈力蛋白的生成，改善皮膚質(zhì)地。這些研究表明外泌體具有抗衰老應(yīng)用前景。

在早期發(fā)現(xiàn)機(jī)體衰老跡象方面，外泌體也有其臨床應(yīng)用價(jià)值。唾液里有很多分子物質(zhì)和微生物，可以作為局部或全身的有效生物指標(biāo)，血液來(lái)源的分子會(huì)通過(guò)跨細(xì)胞或細(xì)胞旁路進(jìn)入唾液腺進(jìn)而影響唾液的組成成分。日本岡山大學(xué)研究人員推測(cè)唾液外泌體的miRNA可作為衰老的生物標(biāo)記物[28]。有研究對(duì)青年人群和老年人群的唾液外泌體進(jìn)行miRNA的篩選和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-24-3p的表達(dá)有顯著差異，從而認(rèn)為miR-24-3p是一個(gè)新的衰老相關(guān)的生物標(biāo)記物。此結(jié)果表明，唾液外泌體檢測(cè)有希望作為一種標(biāo)記衰老的手段。

4 展望

除了上述特點(diǎn)與功能，外泌體作為一種天然的脂質(zhì)體，還是一種比較理想的藥物載體，憑借歸巢能力，可被靶細(xì)胞特異性吸收[29]。外泌體還能進(jìn)行膜修飾從而增強(qiáng)細(xì)胞特異性靶向作用。安德森癌癥中心Kalluri的最新成果顯示，修飾過(guò)后的外泌體可以遞送iRNA，用于胰腺癌的治療[30]。實(shí)驗(yàn)對(duì)外泌體進(jìn)行基因修飾(命名為iExosome)，裝載靶向胰腺癌細(xì)胞KRAS突變基因的RNA干擾藥物，結(jié)果表明iExosome比同樣經(jīng)過(guò)修飾的脂質(zhì)iLiposome遞送效果更好，能夠抑制侵襲性胰腺癌生長(zhǎng)。這得益于外泌體表面的CD47，它能夠阻止外泌體在血液循環(huán)系統(tǒng)中被單核細(xì)胞清除。這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，外泌體具有足夠時(shí)長(zhǎng)的循環(huán)半衰期和免疫逃逸能力，且能夠加載多種不同的藥物，是一種很有應(yīng)用前景的藥物治療新工具。