史以超，彭麗華，楊云生

解放軍總醫(yī)院 消化科，北京 100853

人類腸道中棲息著細(xì)菌、真菌、病毒以及原生生物群落，這些微生物和宿主共同組成復(fù)雜的腸道微生態(tài)系統(tǒng)，影響著人類健康[1]。腸道病毒對(duì)人體健康的影響，主要通過腸道病毒間的相互作用、腸道病毒與宿主以及其他細(xì)菌間的相互作用決定的[2]。最近的研究表明，健康嬰幼兒的腸道在不同發(fā)育階段有著不同的病毒組。此外，在嬰幼兒發(fā)育過程中，諸多因素如分娩方式、飲食、環(huán)境等均可影響腸道病毒組的組成[3]。本文針對(duì)當(dāng)前嬰幼兒的腸道病毒組學(xué)研究進(jìn)展、嬰幼兒腸道病毒定植的影響因素及嬰幼兒腸道病毒組的功能等相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 嬰幼兒腸道病毒組

腸道病毒組學(xué)是指腸道中的真核RNA病毒、DNA病毒及噬菌體組成的復(fù)雜群落與宿主相互作用的總和[4-5]。一個(gè)多世紀(jì)前，病毒作為人類腸道內(nèi)病原微生物已經(jīng)漸漸被人們所熟知，如引起嬰幼兒腹瀉的病毒-輪狀病毒、諾如病毒、腸腺病毒、星狀病毒等[6-8]。這些病毒微粒能夠被早期發(fā)現(xiàn)是由于這些病毒能夠在體外培養(yǎng)。由于病毒具有整合功能，宿主基因組中常有很多病毒來源的遺傳物質(zhì)[9]，如真核生物基因組中的逆轉(zhuǎn)錄病毒元件、細(xì)菌基因組中的前噬菌體。目前研究表明，除了整合到染色體的病毒外，每個(gè)健康個(gè)體終其一生，可能有多種慢性病毒感染，包括皰疹病毒、多瘤病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒和指環(huán)病毒[10]。此外，其他病毒如肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等也時(shí)刻威脅個(gè)體健康。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，病毒的檢測(cè)不再單純依賴傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)，通過第二代高通量測(cè)序技術(shù)、第三代單分子測(cè)序技術(shù)可以直接將特定環(huán)境中的所有病毒遺傳物質(zhì)進(jìn)行快速鑒定[11]。病毒組學(xué)分析過程主要包括病毒的分離純化、病毒基因組提取、病毒基因組測(cè)序、注釋及鑒定等[12]。早在2002年，Brcitbart等[13]采用鳥槍測(cè)序法首次檢測(cè)了海洋生境中的病毒群落，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海洋的病毒群落中富集噬菌體病毒。隨后，進(jìn)一步對(duì)人體糞便的病毒群落進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明健康個(gè)體的糞便中含有約1 200種病毒，其中以噬菌體為主(長(zhǎng)尾噬菌體科為優(yōu)勢(shì)病毒科)[14]。這些研究掀起了病毒組學(xué)研究的序幕。然而即便如此，人體標(biāo)本采用宏基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，與人體相關(guān)的病毒樣顆粒的數(shù)目和類型都被低估了。宏基因測(cè)序相關(guān)的病毒樣顆粒僅有14% ～87%能夠分類，這表明仍有大量的未知病毒定植在人體中[15]。

人體腸道微生物的形成始于嬰兒出生，并在2 ～ 3歲時(shí)逐漸形成類似于成人腸道微生物組的組成結(jié)構(gòu)。在這段時(shí)間內(nèi)，真核病毒及細(xì)菌組不斷擴(kuò)張，同時(shí)噬菌體組不斷收縮[16]。在生命的初期階段，病毒群落組成變化劇烈，這種嬰兒時(shí)期腸道病毒組的不穩(wěn)定性與嬰兒腸道微生物組構(gòu)成的快速變化相一致[17-18]。

Breitbart等[17]收集健康足月順產(chǎn)并混合喂養(yǎng)新生兒的新鮮糞便，提取純化糞便病毒總DNA。結(jié)果表明，新生兒第1周的糞便病毒多樣性較低，其中約66%的測(cè)序序列在GenBank非冗余數(shù)據(jù)庫比對(duì)不上，說明大部分糞便的病毒可能是新型病毒[17]。可識(shí)別的雙鏈DNA序列為噬菌體病毒，包括Podoviruses、Siphoviruses和Myoviruses等，以Siphoviruses和前噬菌體病毒為主。此后，將第1周和第2周的糞便病毒DNA樣本，與以第1周病毒序列為模板構(gòu)建的微陣列探針雜交[17]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 ～ 2周齡發(fā)育過程中，病毒組群落組成發(fā)生了劇烈變化，超過半數(shù)在第1周出現(xiàn)的病毒種類在第2周檢測(cè)不到。

Reyes等[19]采集美國密蘇里州的4對(duì)同卵雙胞胎和母親的糞便進(jìn)行病毒組學(xué)研究。分別收集在研究開始時(shí)、出生后2個(gè)月及1年的糞便樣本，抽提病毒DNA后采用多重鳥槍454焦磷酸測(cè)序法進(jìn)行全基因組擴(kuò)增測(cè)序，與自定義的非冗余病毒數(shù)據(jù)庫(NR_Viral_DB)比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)81%±6%的測(cè)序序列不能匹配已知的病毒，而比對(duì)到的病毒主要是前噬菌體和溫和噬菌體(如大腸埃希菌噬菌體P22)。進(jìn)一步采用α及β多樣性分析發(fā)現(xiàn)，盡管雙胞胎之間具有高度的遺傳關(guān)聯(lián)度，但他們個(gè)體的病毒組具有相對(duì)獨(dú)特性[19]。個(gè)體內(nèi)部的病毒多樣性非常低，＞95%的病毒類型在隨訪期間能夠保持，并且?guī)讉€(gè)少數(shù)的優(yōu)勢(shì)溫和噬菌體病毒具有顯著的遺傳穩(wěn)定性。

Lim等[16]收集美國圣路易斯州的4對(duì)順產(chǎn)、母乳喂養(yǎng)的雙胞胎嬰兒的糞便，分別采集出生1 ～ 4 d、3個(gè)月、6個(gè)月、18個(gè)月及24個(gè)月的糞便提取總DNA。為了全面檢測(cè)DNA和RNA病毒，糞便樣本中提取的總核酸采用多重置換擴(kuò)增法(MDA)和序列依賴的DNA和RNA擴(kuò)增法(SIA)。經(jīng)過文庫的構(gòu)建后，Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。所測(cè)得的病毒序列比對(duì)定制的病毒數(shù)據(jù)庫(公開數(shù)據(jù)庫NCBI NT和NR下載優(yōu)化)。結(jié)果表明，相比于真核RNA和真核DNA病毒，嬰幼兒糞便中更富集噬菌體家族。此外，嬰幼兒糞便標(biāo)本中，可以檢出真核RNA病毒如杯狀病毒、星狀病毒和小核糖核酸病毒；僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)古細(xì)菌病毒家族(lipothrixviridae)。從出生到2歲，真核生物病毒組和細(xì)菌組微生物逐漸擴(kuò)張，但是這一過程也伴隨著噬菌體病毒組組成萎縮及移位。在新生兒糞便中，他們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于真核RNA和DNA病毒，噬菌體病毒組占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，以有尾噬菌體目和微病毒科為主。而新生兒糞便樣本中真核病毒的豐度較低，隨后逐漸擴(kuò)張。最常檢出的真核RNA病毒為Pnterovirus、Parechovirus、Tombamovirus和Sapovirus；真核DNA病毒Anelloviruses科占有優(yōu)勢(shì)。與真核病毒變化相反，噬菌體在剛出生時(shí)豐度最高，隨著年齡增長(zhǎng)而下降。最常見的噬菌體是Caudovirales目(Siphoviridae、Inoviridae、Myoviridae和Podoviridae科)和Microviridae科。

2 嬰幼兒腸道病毒定植的影響因素

2.1 孕期及分娩 既往研究表明，許多致病性真核病毒如巨細(xì)胞病毒、流感病毒、風(fēng)疹病毒、水痘病毒、人乳頭狀病毒及艾滋病病毒等，均可以通過胎盤或者產(chǎn)道傳染新生兒[20]。這些病毒感染，可能無明顯癥狀到導(dǎo)致流產(chǎn)。針對(duì)性的羊水PCR檢測(cè)多種病毒，如腺病毒、巨細(xì)胞病毒、呼吸道合胞病毒、腸病毒、EB病毒和微小病毒B19等[21]。但這些可檢測(cè)到的真核病毒對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的臨床意義尚未可知。子宮羊水的病毒宏基因組學(xué)測(cè)序可能對(duì)胎兒的健康起重要提示作用。此外，不同的分娩方式的差異，可能會(huì)導(dǎo)致新生兒胎便病毒的不同。相較于順產(chǎn)新生兒胎便，剖宮產(chǎn)的新生兒胎便中富含銅綠假單胞菌噬菌體[22]。McCann等[23]采集科克大學(xué)產(chǎn)科醫(yī)院2012年2月- 2014年5月的10例順產(chǎn)及10例急診剖宮產(chǎn)嬰兒1歲時(shí)糞便進(jìn)行病毒組學(xué)測(cè)序研究。結(jié)果顯示，陰道分娩和剖宮產(chǎn)影響嬰兒的病毒組組成。陰道分娩的嬰兒腸道具有更多的病毒與噬菌體多樣性。提示病毒從母體到兒童的垂直傳播可能在塑造早期生命微生物群中起作用，并且在研究生命早期的腸道病毒時(shí)應(yīng)考慮出生方式[23]。

2.2 母乳及飲食 母乳中的雙歧桿菌群落及噬菌體可以通過母乳的垂直傳播穩(wěn)定地傳遞給新生兒[24-25]。此外，母乳也能分泌一些病毒，如人類免疫缺陷病毒1型和2型、人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒、巨細(xì)胞病毒、肝炎ABC病毒、單純皰疹病毒1型和2型、水痘-帶狀皰疹病毒等，可能增加?jì)胗變焊腥镜娘L(fēng)險(xiǎn)。此外，采用飲食干預(yù)研究人類腸道病毒的動(dòng)態(tài)變化過程表明，腸道病毒組變異的主要是因?yàn)閭€(gè)體之間的差異，但是病毒種群的顯著變化和轉(zhuǎn)換與確定的飲食有明顯的相關(guān)性，并且對(duì)于類似飲食的個(gè)體，可以觀察到病毒種群的趨同性[26]。

2.3 地理環(huán)境 嬰幼兒腸道病毒組的發(fā)育成熟離不開環(huán)境因素的塑造。Ly等[27]研究群體的口腔及腸道病毒生態(tài)發(fā)現(xiàn)，大量的腸道與口腔病毒(大部分是噬菌體)在遺傳不相關(guān)的同居個(gè)體之間共享；并隨時(shí)間推移，噬菌體在家庭內(nèi)的分布表明它們?cè)诩彝ソ佑|的微生物群之間傳播[27]。一項(xiàng)研究比較了87例分別來自墨爾本和澳大利亞北部地區(qū)的兒童腹瀉隊(duì)列中的真核病毒[28]。來自澳大利亞北方地區(qū)的兒童腹瀉樣本較墨爾本的腹瀉樣本含有更多的病毒家族，這些病毒包括腺病毒、小RNA病毒科(腸病毒屬)。不同的飲食、居住條件、水質(zhì)環(huán)境因素、衛(wèi)生和(或)社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位可能在腸道病毒的組成中發(fā)揮重要作用[28]。

2.4 個(gè)體差異 目前的研究表明，腸道病毒存在著高度的個(gè)體特異性。在一項(xiàng)研究中，研究者在1年中的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)成人同卵雙胞胎及其母親的糞便樣品進(jìn)行研究[19]。研究結(jié)果表明，家庭成員間的腸道微生物組具有更高的相似性，暗示了環(huán)境暴露在人體腸道微生物群落形成過程中的重要作用；同時(shí)，研究顯示雙胞胎與其母親間的病毒組差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于相應(yīng)的細(xì)菌組差異，表明個(gè)體之間的病毒組存在明顯的差異[19]。盡管個(gè)體之間的病毒組差異明顯，成人個(gè)體內(nèi)部的病毒組的縱向變化卻很小，腸道病毒在個(gè)體間變異性也是有限的。在嬰幼兒期，腸道病毒在雙胞胎個(gè)體間的相似性較非相關(guān)嬰兒更高。雙胞胎可以將接種輪狀病毒疫苗的嬰兒傳播到未接種疫苗的嬰兒，提示密切接觸可能是病毒間傳播的驅(qū)動(dòng)力。

3 嬰幼兒腸道病毒組的功能

腸道微生物群落對(duì)宿主的生長(zhǎng)、發(fā)育及健康維持具有十分重要的作用。腸道病毒組可以直接或間接調(diào)控嬰幼兒免疫應(yīng)答、微生物代謝與營養(yǎng)、黏膜保護(hù)等，從而對(duì)宿主產(chǎn)生影響[2,29-30]。

眾所周知，噬菌體可以與細(xì)菌通過捕食-被捕食的關(guān)系改變細(xì)菌微生物組成結(jié)構(gòu)。研究表明，通過傳統(tǒng)的捕食-被捕食模型進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，被捕食者(細(xì)菌)的波動(dòng)一般在捕食者(噬菌體)波動(dòng)之前發(fā)生。然而，在嬰幼兒早期發(fā)育過程中噬菌體-細(xì)菌相互作用卻從相反的動(dòng)態(tài)過程開始。早期的細(xì)菌定植與噬菌體病毒群落的收縮相關(guān)，但是仍然符合捕食-被捕食模型的動(dòng)力學(xué)特征[31]。這些結(jié)果提示我們噬菌體有可能對(duì)新生兒腸道微生態(tài)環(huán)境起著保護(hù)作用，這樣可以通過噬菌體選擇抑制異常細(xì)菌定植并保留益生菌定植。

嬰幼兒早期的腸道病毒定植可能有助于免疫系統(tǒng)的發(fā)育，從而抵抗隨后的感染并阻止過度免疫反應(yīng)。既往研究表明，胃腸道的真核病毒如Murine Norovirus感染無菌或者抗生素治療的小鼠，能夠抵消抗生素對(duì)腸道損傷作用并防止致病細(xì)菌感染，恢復(fù)腸道表層細(xì)胞數(shù)量及功能，可以部分代替腸道菌群的功能，并且還有助于恢復(fù)腸道免疫系統(tǒng)功能[32]。此外，有研究顯示噬菌體在黏液中富集是通過噬菌體衣殼上暴露的Ig樣蛋白結(jié)構(gòu)域與黏蛋白糖蛋白的結(jié)合相互作用發(fā)生，保護(hù)宿主上皮細(xì)胞免受細(xì)菌感染[33]。噬菌體和宿主之間的共生關(guān)系，能夠主動(dòng)保護(hù)黏膜表面，提供了新的抗微生物防御機(jī)制[33]。噬菌體的基因可以通過水平轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)菌，從而對(duì)嬰幼兒健康產(chǎn)生影響。腸道噬菌體基因編碼厭氧核苷酸合成、細(xì)胞壁合成和降解，毒力因子相關(guān)基因、糖類代謝利用基因、耐藥基因等相關(guān)的基因，可以通過基因的水平轉(zhuǎn)移使噬菌體基因組進(jìn)入宿主細(xì)菌中，對(duì)宿主細(xì)菌在腸道中的穩(wěn)態(tài)維持起重要作用[19]。

4 結(jié)語

隨著腸道微生態(tài)組學(xué)研究的不斷深入，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到腸道微生態(tài)在嬰幼兒發(fā)育、成長(zhǎng)中的重要作用。但針對(duì)嬰幼兒腸道病毒組的研究尚不深入，病毒組數(shù)據(jù)庫還不完善，病毒組的作用尚不十分明確。在未來的研究中，需結(jié)合高通量測(cè)序和生物信息學(xué)的方法全面解析嬰幼兒腸道病毒組的種群及數(shù)量，深入探討腸道病毒組與其他微生物(如細(xì)菌、真菌)種群間的相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步明確嬰幼兒腸道病毒組在健康中的作用。