張文玲，劉曉婷，張立文，王成彬

解放軍總醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，北京 100853

自20世紀(jì) 60年代后期染色體條帶技術(shù)開展以來，染色體核型分析作為產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”被廣泛應(yīng)用于臨床，但其只能檢測出染色體片段＞5 Mb的異常，無法發(fā)現(xiàn)染色體上微小片段(小于3 ～ 5 Mb)的缺失及重復(fù)[1]，無法準(zhǔn)確定位額外小標(biāo)記染色體(small supernumerary marker chromosomes，sSMC)的來源；而且染色體核型分析需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，報告周期長(10 ～ 14 d)。染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)是一項(xiàng)新興的染色體分析技術(shù)，能夠檢測出大于1 kb的拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)微缺失/微重復(fù)，故而被稱為“分子核型”[2]。與染色體核型分析相比，CMA具有更好的分辨率、更高的自動化程度和更快的檢測周期，彌補(bǔ)了染色體核型分析的不足。2013年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會建議當(dāng)胎兒存在一個或多個系統(tǒng)超聲異常并需要進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷時應(yīng)用CMA技術(shù)[3]。本文對CMA的檢測原理、在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用、CMA結(jié)果解讀與遺傳咨詢、CMA的優(yōu)勢與局限性等進(jìn)行系統(tǒng)綜述，為該領(lǐng)域科技人員提供參考。

1 CMA的檢測原理

根據(jù)芯片設(shè)計與檢測原理的不同，CMA技術(shù)可分為基于微陣列的比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)微陣列技術(shù)。

aCGH是在比較基因組雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的芯片技術(shù)，其原理是分別用不同顏色的熒光(如綠色的Cy3熒光素和紅色的Cy5熒光素)標(biāo)記待測樣品與健康人參照樣品全基因組DNA等比例混合后，與載體上固定好的微陣列序列競爭性雜交，通過計算機(jī)軟件分析比較待測樣品和參照樣品兩種熒光強(qiáng)度，待測樣品中的缺失區(qū)域會產(chǎn)生更強(qiáng)烈的Cy5信號(紅色)，而重復(fù)區(qū)域會產(chǎn)生更強(qiáng)烈的Cy3信號(綠色)，從而確定待測樣品全基因組水平上拷貝數(shù)變化情況。aCGH的分辨率取決于所用探針的數(shù)量和類型以及它們在整個基因組中的分布。最初用于aCGH的探針來源于細(xì)菌人工染色體克隆，通常為100 ～ 150 kb，現(xiàn)多被寡核苷酸探針(25 ～ 75 bp)取代，因寡核苷酸探針能提供更高的分辨率與更好的重現(xiàn)性[2]。

與aCGH技術(shù)不同，SNP微陣列技術(shù)只需標(biāo)記待測樣品的基因組DNA并與SNP微陣列雜交。給定SNP的A和B等位基因用不同的熒光染料標(biāo)記，測量待測樣品的絕對熒光強(qiáng)度，并通過與正常參照樣品數(shù)據(jù)庫的熒光強(qiáng)度(計算機(jī)模擬)比較來確定拷貝數(shù)變化。臨床應(yīng)用的大多數(shù)SNP陣列是包含SNP探針與拷貝數(shù)探針的雜合陣列。與aCGH相比，SNP陣列具有檢測等位基因失衡的優(yōu)勢，除了能檢測CNV外，SNP微陣列技術(shù)還能夠檢測出大多數(shù)的單親二倍體與三倍體[2]。

目前大多數(shù)臨床使用的CMA平臺具有“靶向性”，可以檢測靶向區(qū)域的20 ～ 50 kb的不平衡和與非靶向區(qū)域中100 ～250 kb的不平衡[4]。這種設(shè)計減少了對臨床意義不明確的拷貝數(shù)變異(variant of uncertain significance，VOUS)的檢出，同時保持平臺高效檢測亞顯微不平衡染色體重排，以及與已知基因組疾病相關(guān)的缺失與重復(fù)。然而，部分學(xué)者主張使用全基因組陣列以提高靈敏度。全基因組陣列在發(fā)現(xiàn)新的亞顯微綜合征中作用顯著，同時全基因組陣列將檢測到更多VOUS。申請CMA檢測時，臨床醫(yī)師應(yīng)了解當(dāng)前使用的各種CMA平臺及其局限性。

2 CMA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

目前，CMA的臨床應(yīng)用主要有：1)兒童復(fù)雜、罕見遺傳病在排除染色體病、代謝病及脆性X綜合征之后的全基因組CNV檢測。2)對自然流產(chǎn)、胎死宮內(nèi)、新生兒死亡等妊娠產(chǎn)物的遺傳學(xué)檢測。3)對產(chǎn)前診斷中核型分析結(jié)果異常但無法確認(rèn)異常片段的來源和性質(zhì)者進(jìn)行DNA水平的更精細(xì)分析。4)對產(chǎn)前超聲檢查異常而染色體核型分析結(jié)果正常的胎兒進(jìn)一步行遺傳學(xué)檢測。在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域中，CMA主要應(yīng)用于后兩種[5]。

2.1 明確核型分析異常片段的來源和性質(zhì) 在產(chǎn)前診斷中，sSMC的發(fā)生率為0.075%[6]。sSMC的表型效應(yīng)與其來源、片段大小以及是否含有重要的功能基因和調(diào)控基因等相關(guān)，而染色體核型分析不能確定sSMC的來源和性質(zhì)。CMA技術(shù)能夠在分子水平精確定位sSMC片段來源，確定包含的基因及其功能，對染色體疾病基因型-表型關(guān)系的診斷具有重大的應(yīng)用價值[7-9]。此外，染色體易位的形成往往伴隨著一些微小片段的丟失或重復(fù)，受檢測水平的限制，傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)診斷出的平衡易位核型很有可能隱藏著眾多的微小不平衡。Schluth-Bolard等[10]發(fā)現(xiàn)，約40%的染色體平衡易位通過CMA進(jìn)一步檢測，可能為不平衡易位。對于產(chǎn)前診斷中染色體核型檢查發(fā)現(xiàn)的胎兒染色體平衡易位，CMA技術(shù)可以進(jìn)一步明確該易位是否打斷編碼基因、是否在斷裂點(diǎn)附近存在小片段的缺失或重復(fù)，這些都有助于明確胎兒染色體平衡易位是否具有病理性質(zhì)，有利于遺傳咨詢及胎兒預(yù)后評估[11]。

2.2 對產(chǎn)前超聲檢查異常而染色體核型分析正常的胎兒進(jìn)一步檢測 CMA用于產(chǎn)前診斷染色體異常時表現(xiàn)出優(yōu)異的診斷性能(靈敏度96.2%，特異性100.0%)[12]。與染色體核型分析相比，CMA能夠提供超過常規(guī)核型分析的診斷信息，顯著提高胎兒染色體異常的檢測成功率和診斷率[13-14]，尤其當(dāng)超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常時，產(chǎn)前CMA分析最有效[3]。Hillman等[15]的系統(tǒng)評價發(fā)現(xiàn)，常規(guī)核型分析“正?！?，不考慮診斷指征時，CMA可以檢測到3.6%的基因組失衡；當(dāng)診斷指征是超聲結(jié)構(gòu)畸形時，檢測到的基因組失衡將增加到5.2%。Hillman等[16]的前瞻性隊(duì)列研究證實(shí)，當(dāng)胎兒超聲檢查異常時，與常規(guī)核型分析相比，CMA提高了4.1%的異常檢出率。胡婷等[17]對477例已排除常見染色體非整倍體的超聲異常胎兒羊水樣本進(jìn)行CMA檢測，檢出致病性CNV 24例，檢出率為5.03%。其中62例多系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常胎兒中檢出致病性CNV 6例，檢出率為9.68%；147例單系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常胎兒中檢出致病性CNV 11例，檢出率為7.48%；268例超聲軟指標(biāo)異常胎兒中檢出致病性CNV 7例，檢出率為2.61%，多系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常胎兒具有更高的CNV檢出率。De Wit等[18]的文獻(xiàn)系統(tǒng)評價也顯示，超聲異常限于一個解剖系統(tǒng)的胎兒攜帶致病性CNV的概率為3.1% ～ 7.9%，這取決于受影響的解剖系統(tǒng)；對于多發(fā)性超聲異常胎兒，這一概率增至9.1%。多項(xiàng)研究均證實(shí)CMA在不同表現(xiàn)的胎兒超聲異常中的診斷和預(yù)后價值，如生長發(fā)育遲緩[19]、NT增厚[20-21]、心臟異常[22-25]、神經(jīng)系統(tǒng)異常[26-27]等。國內(nèi)外均已提出專家共識，建議當(dāng)胎兒存在一個或多個超聲異常并需要進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷時，推薦使用CMA；對于胎兒核型分析結(jié)果不能確定染色體畸變情況時，建議采用CMA技術(shù)進(jìn)一步分析以明確診斷[3,5]。

3 CMA結(jié)果的解讀

2011年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會發(fā)布了CNV解釋指南，建議采用5級報告系統(tǒng)，即致病性的、可能致病性的、不確定的、可能良性的或良性的CNV[28]。CMA報告應(yīng)提供以下與報告的CNV相關(guān)的特定信息：細(xì)胞遺傳學(xué)位置(染色體和條帶)；CNV類別(即缺失或重復(fù))及機(jī)制(如果已知)；CNV大小與基因組構(gòu)建的坐標(biāo)(即hg19)；5級制度界定的重要聲明(包括證據(jù)和參考文獻(xiàn))；所涉及的基因(如果CNV與已知綜合征相關(guān)，則列出與病癥相關(guān)的基因；其他情況下列出所有參考序列基因)；適當(dāng)?shù)呐R床隨訪建議。

確定CNV的臨床意義可以參考已發(fā)表的病例報道、病例對照分析、病例綜述等資料，查閱共享的公共數(shù)據(jù)庫，如DGV數(shù) 據(jù) 庫(http：//dgv.tcag.ca)、DECIPHER數(shù) 據(jù) 庫(http：//decipher.sanger.ac.uk)、OMIM數(shù) 據(jù) 庫(http：//www.omim.org)、UCSC數(shù)據(jù)庫(http：//genome.ucsc.edu)、ISCA數(shù)據(jù)庫(https：//www.clinicalgenome.org)和PubMed(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)等，數(shù)據(jù)庫的不斷完善對規(guī)范和明確CMA結(jié)果的解釋及遺傳咨詢起著重要作用。

雖然CMA具有檢測1 kb堿基范圍內(nèi)CNV的潛力，但在產(chǎn)前檢查中，大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室多報告已被充分驗(yàn)證且在已知致病區(qū)域中的CNV。在這些臨床重要區(qū)域之外的CNV通常僅在滿足特定標(biāo)準(zhǔn)時才報告。這些標(biāo)準(zhǔn)因?qū)嶒?yàn)室而異，但通常包括大小閾值(＞1 ～ 3 Mb)以及CNV含有OMIM基因等要求。

4 CMA產(chǎn)前診斷的遺傳咨詢

隨著醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究的深入，對CNV的臨床解釋可能發(fā)生改變，原本認(rèn)為良性的CNV可能在一定時間后被認(rèn)為是致病性的。類似這樣的問題，在產(chǎn)前診斷中很可能導(dǎo)致法律糾紛。因此，CMA檢測前患者充分的知情同意與檢測后CMA結(jié)果的咨詢解釋不可或缺。臨床CMA的報告應(yīng)由具有適當(dāng)專業(yè)培訓(xùn)和認(rèn)證的人員進(jìn)行，該測試的理想實(shí)驗(yàn)室設(shè)置是具有細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)專業(yè)檢測能力的實(shí)驗(yàn)室[28]。

在進(jìn)行CMA檢測前與患者討論非常重要?？梢耘c患者討論檢測目的、方法學(xué)、獲取樣本的選項(xiàng)(即羊膜穿刺術(shù)、絨毛膜取樣、血清或組織)、不完全外顯率和變異表達(dá)率的不可預(yù)測性以及檢測的局限性等[29]。除可能檢測到VOUS外，CMA還可能檢測到與成人時期發(fā)病的疾病相關(guān)的遺傳異常，某些類型的陣列還可以識別血緣關(guān)系(血親關(guān)系或亂倫)和非親緣關(guān)系，這些與醫(yī)學(xué)倫理相關(guān)的問題需要給予關(guān)注。報告的信息類型和數(shù)量取決于所使用的陣列類型以及執(zhí)行分析的實(shí)驗(yàn)室策略。在一項(xiàng)評估產(chǎn)前CMA知情決策水平以及影響決策因素的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，只有49%的醫(yī)師作出了明智的決定，“信息越多越好”成為影響被調(diào)查者接受產(chǎn)前CMA決定的主導(dǎo)因素[30]。因此，在患者接受CMA檢測之前，遺傳咨詢和知情同意是必不可少的。

同樣，檢測后CMA結(jié)果的咨詢解釋也極為重要，非預(yù)期診斷的報告并不少見。Gijsbers等[31]認(rèn)為，隨著CMA分辨率越來越高，實(shí)驗(yàn)室程序不斷改善，將有越來越多VOUS被發(fā)現(xiàn)。CMA在臨床應(yīng)用中所面臨的最大困難之一是臨床醫(yī)師如何對VOUS進(jìn)行遺傳咨詢。即使CMA檢測已包括知情同意過程，許多患者依舊對結(jié)果不確定的可能性缺乏足夠了解，并且在收到異常結(jié)果后需要決定是否繼續(xù)妊娠時感到非常痛苦[32]。在對193名產(chǎn)前遺傳咨詢師進(jìn)行的一項(xiàng)調(diào)查中，當(dāng)CMA結(jié)果發(fā)現(xiàn)VOUS時，只有59%的醫(yī)師能夠輕松提供遺傳咨詢，只有43%的醫(yī)師能夠很好地幫助患者做出終止妊娠的決定[33]。由于越來越多地使用產(chǎn)前微陣列檢測，不確定的檢查結(jié)果越發(fā)常見，因此需要更詳細(xì)的檢測前后咨詢，以及為醫(yī)師提供更多的教育資源，以便他們能夠更好地服務(wù)患者，確保患者可以做出恰當(dāng)?shù)臎Q定。

5 CMA在產(chǎn)前診斷應(yīng)用中的臨床指南

美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會于2009年首次提出在產(chǎn)前診斷中應(yīng)用CMA技術(shù)，建議常規(guī)核型分析仍然是產(chǎn)前診斷的主要細(xì)胞遺傳學(xué)工具，CMA目前不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。在胎兒結(jié)構(gòu)異常情況下可以進(jìn)行CMA檢測。在傳統(tǒng)染色體核型正常且胎兒沒有結(jié)構(gòu)畸形的情況下，也可向已接受產(chǎn)前診斷風(fēng)險并了解VOUS可能性的婦女提供CMA[1]。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會建議對CMA檢測到染色體失衡情況的后續(xù)分析，應(yīng)包括患者的細(xì)胞遺傳學(xué)或熒光原位雜交研究、親本評估以及臨床遺傳評估和咨詢等[34]。

美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會和美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會在2013年更新了CMA在產(chǎn)前診斷中應(yīng)用的指南，建議無論母親的年齡或其他風(fēng)險因素如何，都應(yīng)通過篩查或診斷檢測為孕婦提供非整倍性的產(chǎn)前評估。當(dāng)胎兒結(jié)構(gòu)異常和(或)死產(chǎn)的情況下進(jìn)行遺傳分析時，可以使用CMA代替常規(guī)核型分析。在胎兒結(jié)構(gòu)正常的情況下進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷時，可以進(jìn)行CMA或常規(guī)核型分析。由于CMA發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)致病性CNV與母親年齡增加無關(guān)，所以檢測不應(yīng)局限于35歲或以上的女性[3,35]。2011年加拿大婦產(chǎn)科學(xué)會和加拿大醫(yī)學(xué)遺傳協(xié)會在產(chǎn)前診斷中應(yīng)用CMA技術(shù)的規(guī)范中聯(lián)合指出，CMA不建議用于結(jié)構(gòu)性染色體異常低風(fēng)險的妊娠(如高齡孕婦、母體血清學(xué)篩查陽性、先前的三體性或胎兒超聲“軟指標(biāo)”異常)，但在超聲或磁共振成像檢測到胎兒結(jié)構(gòu)異常的情況下可以使用CMA。如果快速非整倍性篩查是陰性的并且確保適當(dāng)?shù)臋z測周期，則可以CMA代替核型分析。任何有資格進(jìn)行CMA檢測的孕婦，在檢測之前都應(yīng)該先接受醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)家的咨詢，以便詳細(xì)了解CMA分析的好處、局限性、可能的 結(jié)果和解釋CNV的困難[36]。2017年更新后的規(guī)范建議當(dāng)檢測到多系統(tǒng)胎兒畸形或頸部半透明NT≥3.5 mm時，應(yīng)在正常快速非整倍性篩查后提供CMA。為了盡量減少不確定結(jié)果的報告，建議產(chǎn)前診斷不常規(guī)報告小于500 kb缺失或1 Mb重復(fù)的VOUS[37]。

6 CMA在產(chǎn)前診斷應(yīng)用中優(yōu)勢與局限性

美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會指出，與核型分析相比CMA的優(yōu)勢在于：1)可以分析更廣泛的標(biāo)本類型，不需要組織培養(yǎng)(CMA同樣適用于未培養(yǎng)的絨毛、羊水、胎兒組織和血液，包括儲存的樣本和石蠟塊)。2)分辨率更高，可以鑒定傳統(tǒng)染色體核型未發(fā)現(xiàn)的微缺失和微重復(fù)。3)檢測平臺可定制，可以根據(jù)特定要求而在感興趣的區(qū)域增加探針密度，調(diào)整檢測范圍。4)更直觀準(zhǔn)確地描述核型上發(fā)現(xiàn)的結(jié)果，精準(zhǔn)定位異常片段來源，客觀數(shù)據(jù)的解釋，而不是對帶強(qiáng)度的主觀視覺評估，對基因型-表型關(guān)系及預(yù)后給予更準(zhǔn)確診斷，從而利于遺傳咨詢[35]。

CMA也存在自身的局限性：1)不能有效測出基因組平衡的染色體易位及倒位。2)低水平嵌合的檢出依賴于平臺種類、樣本類型、DNA質(zhì)量、數(shù)據(jù)質(zhì)量以及不平衡的大小等因素。3)可能無法闡明遺傳失衡的染色體機(jī)制，缺乏關(guān)于CNV機(jī)制的信息(核型將在大多數(shù)情況下提供此信息，如不平衡易位，標(biāo)記染色體等)。4)可能無法檢測或難以檢測到四倍體或其他多倍體。5)無法檢測到平臺上未覆蓋基因組區(qū)域的CNV。6)受芯片設(shè)計所限，不可能檢測出與特定綜合征相關(guān)的所有相關(guān)位點(diǎn)異常，陰性CMA結(jié)果不能100%排除染色體疾病。7)并非所有的CNV都是致病性的，CMA可能會檢測到VOUS。

7 結(jié)語

與傳統(tǒng)染色體核型分析相比，CMA提供了更高的分辨率，可以有效診斷額外6%的先天性異常胎兒的染色體微缺失和微重復(fù)[38]。因?yàn)椴恍枰?jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)，CMA具有更快的檢測周期，這個優(yōu)點(diǎn)在宮內(nèi)胎兒死亡、自發(fā)性流產(chǎn)和妊娠晚期羊膜穿刺術(shù)中尤其明顯。盡管VOUS的檢出會給CMA的咨詢解釋帶來挑戰(zhàn)，但隨著更多大規(guī)模前瞻性隊(duì)列研究和CMA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用，CNV數(shù)據(jù)庫將不斷完善，更多染色體病基因型-表型關(guān)系將不斷被闡明，CMA在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域?qū)⒄宫F(xiàn)更大的應(yīng)用價值。