劉子記，朱 婕，牛 玉，楊 衍，*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737；2.海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?570228)

基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平等階段進(jìn)行著精密調(diào)控[1]。啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件[2]，高等植物基因表達(dá)主要由啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用來(lái)調(diào)控，啟動(dòng)子的應(yīng)答元件決定了基因的特定表達(dá)[3]。因此，克隆基因啟動(dòng)子序列并對(duì)其中的調(diào)控元件進(jìn)行分析是了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵。

苦瓜(MomordicacharantiaL.)是葫蘆科苦瓜屬藤蔓性一年生草本植物，是一種藥食兩用的蔬菜[4]，不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，而且具有降血糖、調(diào)節(jié)免疫能力、抗腫瘤和抗病毒等多種功效，受到人們的廣泛關(guān)注[5-6]。α-苦瓜素最早是由Ng等[7]從苦瓜種子中純化出來(lái)的活性蛋白，屬于單鏈的核糖體失活蛋白家族，它能選擇性地殺死絨毛膜癌和黑色素瘤細(xì)胞[8]，較好地抑制S-180實(shí)體瘤[9]、人乳腺癌[10]、子宮頸癌[11]和鼻咽癌[12]細(xì)胞增殖。

目前，有關(guān)α-苦瓜素的研究主要集中在重組表達(dá)和藥理活性分析，蔡秀清[13]研究發(fā)現(xiàn)重組α-苦瓜素對(duì)增殖表皮癌細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)；歐陽(yáng)永長(zhǎng)等[14]研究表明重組α-苦瓜素基因能成功表達(dá)出33 ku的重組蛋白；王書珍[15]研究證實(shí)重組表達(dá)的α-苦瓜素對(duì)尖鐮孢和腐皮鐮孢、銅綠膿桿菌的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用；Qian等[16]研究證明重組表達(dá)α-苦瓜素蛋白可以增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性。有關(guān)α-苦瓜素啟動(dòng)子特征及單倍型的研究鮮有報(bào)道，因此，該研究擬克隆α苦瓜素基因的上游啟動(dòng)子序列，利用生物信息學(xué)分析方法分析潛在的順式作用元件；分析不同苦瓜種質(zhì)資源α-苦瓜素基因啟動(dòng)子序列SNP和InDel分布情況，鑒定單倍型，分析不同單倍型之間在順式作用元件上的差別以及共同點(diǎn)，為進(jìn)一步闡明α-苦瓜素基因的表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試苦瓜材料共28份，來(lái)源于苦瓜初級(jí)核心種質(zhì)庫(kù)[17]，其中3份來(lái)自日本，2份來(lái)自中國(guó)廣東，1份來(lái)自中國(guó)云南，5份來(lái)自中國(guó)海南，4份來(lái)自泰國(guó)，3份來(lái)自印度，4份來(lái)自中國(guó)廣西，5份來(lái)自中國(guó)福建，1份來(lái)自斯里蘭卡(表1)。試驗(yàn)于2016年9月初在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行，將供試苦瓜種子用50 ℃溫水處理30 min，常溫浸種12 h后，播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，按照常規(guī)方法管理。待苦瓜長(zhǎng)至3葉1心時(shí)，摘取葉片貯于-20 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用改良的CTAB法[18]提取待測(cè)苦瓜材料的基因組DNA。

1.2.2 α-苦瓜素啟動(dòng)子序列分離

根據(jù)GenBank α-苦瓜素編碼序列X57682.1比對(duì)苦瓜基因組序列[19]，該編碼序列對(duì)應(yīng)于Scaffold_175，為了獲得α-苦瓜素啟動(dòng)子序列，從α-苦瓜素基因起始密碼子下游200 bp內(nèi)利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物(表2)，獲取起始密碼子上游1.5 kb左右的序列。以苦瓜材料Y5基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Omega Gel Extraction Kit，美國(guó))回收目的條帶，將目的條帶連接到北京全式金生物技術(shù)有限公司pEASY-T5載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，為了消除測(cè)序誤差，每個(gè)目的條帶篩選出5個(gè)陽(yáng)性克隆，委托廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司測(cè)序。

表1供試苦瓜材料

Table1The test materials of bitter gourd

種質(zhì)編號(hào)No.來(lái)源Origin種質(zhì)編號(hào)No.來(lái)源OriginY5、Y7、Y16日本JapanY146、Y147、Y153印度IndiaY43、Y50廣東Guangdong,ChinaY112、Y113、Y115、Y121廣西Guangxi,ChinaY100云南Yunnan,ChinaY122、Y124、Y131、Y134、Y139福建Fujian,ChinaY60、Y66、Y69、Y72、Y77海南Hainan,ChinaY140斯里蘭卡SriLankaY83、Y85、Y87、Y90泰國(guó)Thailand

表2擴(kuò)增α-苦瓜素啟動(dòng)子引物序列

Table2The primer sequence used for amplifyingα-momorcharinpromoter

引物名稱Primer正向引物序列(5'-3')Forwardprimersequence反向引物序列(5'-3')ReverseprimersequenceMCP1GGAGTACTCATTGCCTAACTGGAACCTCCAAGGAAGATTGCGAGMCP2TTGAGGTGTTAGATATTGGACCTCCAAGGAAGATTGCGAGAMCP3CCGTTACAAAAATCACACCCTCAAACCTCCAAGGAAGATTGCGAMCP4GGAGTACTCATTGCCTAACTGGACGAAAGCTAACATCGCCTTMCP5TCCGTTACAAAAATCACACCCTCAACGAAAGCTAACATCGCCTMCP6TCCGTTACAAAAATCACACCCTACAAACGAAAGCTAACATCGCCMCP7CCCCTTTCAATCTCAACAAGGAGAACCTCCAAGGAAGATTGCGMCP8AAACCATGAGCGCCCTTTGAACCTCCAAGGAAGATTGCGA

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括12 μL Premix TaqTM(寶生物工程有限公司)，1 μmol·L-1引物，150 ng模板DNA。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；PCR產(chǎn)物保存于10 ℃。20 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與3 μL上樣緩沖液，2 μL UltraPower DNA染料混合經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠于110 V電泳30 min，顯色進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 α-苦瓜素啟動(dòng)子序列分析

利用在線軟件FGENESH預(yù)測(cè)α-苦瓜素基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。利用P1antCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)工具分析α-苦瓜素啟動(dòng)子序列內(nèi)部順式調(diào)控元件[20]。

1.2.4 α-苦瓜素啟動(dòng)子單倍型分析

采用BioEdit軟件對(duì)不同苦瓜種質(zhì)α-苦瓜素啟動(dòng)子序列進(jìn)行多序列比對(duì)、分組，分析α-苦瓜素啟動(dòng)子單倍型及調(diào)控元件差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-苦瓜素基因啟動(dòng)子片段克隆

為了獲得α-苦瓜素啟動(dòng)子序列，從α-苦瓜素基因起始密碼子下游200 bp內(nèi)利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，獲取起始密碼子上游1.5 kb左右的序列，共設(shè)計(jì)8對(duì)引物。以苦瓜種質(zhì)Y5葉片基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中引物MCP2擴(kuò)增條帶單一，目的片段大小1 600 bp左右，與預(yù)期片段大小吻合，回收特異片段、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，獲得1 620 bp的序列，經(jīng)與α-苦瓜素編碼序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，起始密碼子(ATG)位于1 568 bp處，且起始密碼子下游編碼序列完全與α-苦瓜素編碼序列相匹配，證明所克隆序列為α-苦瓜素基因上游啟動(dòng)子序列。采用FGENESH預(yù)測(cè)α-苦瓜素基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于1 508 bp位點(diǎn)(C)，位于起始密碼子上游60 bp處。選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp序列進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析。

2.2 α-苦瓜素基因啟動(dòng)子序列分析

利用P1antCARE在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)工具分析α-苦瓜素基因啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)，α-苦瓜素基因啟動(dòng)子序列中存在多個(gè)順式作用元件(表3)。其中上游1 491(-6)～1 494(-9)bp位置含有1個(gè)TATA-box，即RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，能夠保證轉(zhuǎn)錄起始的準(zhǔn)確性。1 419(-81)～1 421(-78) bp位置含有1個(gè)CAAT-box，主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的頻率。另外，發(fā)現(xiàn)多個(gè)光響應(yīng)元件，如ATC-motif、Box 4、Box I、Box II、G-Box、GA-motif等；植物激素響應(yīng)元件，如赤霉素響應(yīng)元件TATC-box；特異表達(dá)元件，如胚乳表達(dá)元件GCN4_motif和Skn-1_motif，芽特異表達(dá)元件as-2-box；防御與脅迫響應(yīng)元件，如TC-rich repeats、茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、熱脅迫響應(yīng)元件HSE、干旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS；厭氧誘導(dǎo)元件，如ARE；晝夜節(jié)律調(diào)控響應(yīng)元件，如circadian。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該啟動(dòng)子可能參與光、厭氧、逆境脅迫、水楊酸、茉莉酸和赤霉素等誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)它還可能參與晝夜節(jié)律調(diào)控和醇溶蛋白代謝調(diào)控。

2.3 α-苦瓜素基因啟動(dòng)子單倍型分析

以MCP2為引物，以其余27份苦瓜種質(zhì)基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，回收目的片段進(jìn)行測(cè)序，以α-苦瓜素(Y5)啟動(dòng)子序列為參考序列進(jìn)行行比對(duì)，共發(fā)現(xiàn)24個(gè)SNP位點(diǎn)和1個(gè)InDel，SNP位點(diǎn)分別是119位點(diǎn)的T/C，140位點(diǎn)的C/A，155位點(diǎn)的A/G，183位點(diǎn)的T/C，254位點(diǎn)的C/G，277位點(diǎn)的C/T，348位點(diǎn)的A/G，374位點(diǎn)的G/A，466位點(diǎn)的C/T，530位點(diǎn)的T/G，537位點(diǎn)的A/G，570位點(diǎn)的T/A，591位點(diǎn)的G/T，602位點(diǎn)的C/T，691位點(diǎn)的C/T，774位點(diǎn)的G/C，861位點(diǎn)的G/T，918位點(diǎn)的G/C，1051位點(diǎn)的A/G，1224位點(diǎn)的C/A，1252位點(diǎn)的T/C，1277、1278位點(diǎn)的TT/CA，1352位點(diǎn)的A/G。1個(gè)InDel位點(diǎn)為222位點(diǎn)的A/-(圖1)。通過SNP分組發(fā)現(xiàn)，28份苦瓜種質(zhì)資源α-苦瓜素基因啟動(dòng)子共存在4種單倍型。Y5、Y7、Y16、Y43、Y50、Y90屬于第一組，Y113、Y115、Y140屬于第二組，Y60、Y66、Y77、Y83、Y100、Y112、Y121、Y122、Y134屬于第三組，Y69、Y72、Y85、Y87、Y124、Y131、Y139、Y146、Y147、Y153屬于第四組。結(jié)合順式調(diào)控元件預(yù)測(cè)結(jié)果，3個(gè)SNP(374位點(diǎn)的G/A，691位點(diǎn)的C/T，1352位點(diǎn)的A/G)位于順式元件MBS、GA-motif、Skn-1_motif內(nèi)部，SNP導(dǎo)致預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，可能對(duì)α-苦瓜素基因的表達(dá)調(diào)控有重要作用。

表3α-苦瓜素基因啟動(dòng)子順式作用元件

Table3The cis-acting elements ofα-momorcharinpromoter

元件名稱Element基序序列Motif個(gè)數(shù)No.生物學(xué)功能Biologyfunction5UTRPy-richstretchTTTCTTCTCT1與高轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)的順式作用元件Cis-actingelementconferringhightranscriptionlevelsARETGGTTT1厭氧誘導(dǎo)必需的順式調(diào)控元件Cis-actingregulatoryelementessentialfortheanaerobicinductionATC-motifAGTAATCT1光響應(yīng)保守的DNA模塊PartofaconservedDNAmoduleinvolvedinlightresponseBox4ATTAAT3光響應(yīng)保守的DNA模塊PartofaconservedDNAmoduleinvolvedinlightresponseBoxITTTCAAA1光響應(yīng)原件LightresponsiveelementBoxIIGTGAGGTAATAT1光響應(yīng)原件PartofalightresponsiveelementCAAT-boxCAAT40啟動(dòng)子和增強(qiáng)子普遍存在的順式調(diào)控元件Commoncis-actingelementinpromoterandenhancerregionsCGTCA-motifCGTCA1茉莉酸響應(yīng)原件Cis-actingregulatoryelementinvolvedintheMeJA-responseG-BoxCACACATGGAA1光響應(yīng)原件Cis-actingregulatoryelementinvolvedinlightresponseGA-motifAAAGATGA2光響應(yīng)原件PartofalightresponsiveelementGCN4_motifCAAGCCA1胚乳表達(dá)順式調(diào)控元件Cis-regulatoryelementinvolvedinendospermexpressionHSEAAAAAATTTC4熱脅迫響應(yīng)原件Cis-actingelementinvolvedinheatstressresponseMBSTAACTG2干旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點(diǎn)MYBbindingsiteinvolvedindrought-inducibilityO2-siteGATGACATGA1醇溶蛋白代謝調(diào)控原件Cis-actingregulatoryelementinvolvedinzeinmetabolismregulationSkn-1_motifGTCAT1胚乳表達(dá)順式調(diào)控元件Cis-actingregulatoryelementrequiredforendospermexpressionTATA-boxTATA74核心啟動(dòng)子元件CorepromoterelementTATC-boxTATCCCA1赤霉素響應(yīng)元件Cis-actingelementinvolvedingibberellin-responseTC-richrepeatsGTTTTCTTAC1防御與脅迫響應(yīng)順式元件Cis-actingelementinvolvedindefenseandstressresponseTCA-elementCCATCTTTTT1水楊酸響應(yīng)元件Cis-actingelementinvolvedinsalicylicacidresponseTGACG-motifTGACG1茉莉酸響應(yīng)元件Cis-actingregulatoryelementinvolvedintheMeJA-responseas-2-boxGATAatGATG1嫩芽特異表達(dá)和光響應(yīng)原件Involvedinshoot-specificexpressionandlightresponsecircadianCAANNNNATC1晝夜節(jié)律控制順式調(diào)控元件Cis-actingregulatoryelementinvolvedincircadiancontrol

圖1 α-苦瓜素基因啟動(dòng)子序列SNP和InDel分布Fig.1 The SNP and InDel distribution of α-momorcharin promoter in bitter gourd germplasm

3 討論

核糖體失活蛋白(ribosome inactivating proteins，RIPs)是一類主要存在于植物中具有RNA N-糖苷酶活性的毒蛋白，能夠破壞延伸因子與核糖體的結(jié)合，將蛋白質(zhì)的生物合成抑制在延伸階段的蛋白質(zhì)家族[21]。α-苦瓜素屬于Ⅰ型核糖體失活蛋白，表現(xiàn)出多樣的生物活性，作為具有開發(fā)價(jià)值的蛋白質(zhì)，α-苦瓜素抗腫瘤、抗病毒和抗真菌的活性受到研究者更多的關(guān)注。

真核生物基因的表達(dá)調(diào)控分為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和翻譯水平調(diào)控等。轉(zhuǎn)錄調(diào)控依賴于轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)[22]。外界環(huán)境條件變化時(shí)會(huì)激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合下游基因啟動(dòng)子序列中的順式作用元件，調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)[23]。啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析是探求基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的重要部分，作為轉(zhuǎn)錄激活過程中起發(fā)動(dòng)作用的特異DNA序列，直接影響基因的表達(dá)[24]。本研究選取α-苦瓜素基因TSS上游1 500 bp的序列作為啟動(dòng)子序列進(jìn)行了研究。利用生物信息學(xué)分析手段，對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行了結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子除含有植物啟動(dòng)子所具有的CAAT-box和TATA-box等基本的順式作用元件外，還與光響應(yīng)密切相關(guān)，22個(gè)元件中與光響應(yīng)相關(guān)的有7個(gè)，占31.8%，進(jìn)而推測(cè)光在α-苦瓜素基因表達(dá)過程中具有重要作用。

α-苦瓜素啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)逆境脅迫、水楊酸、茉莉酸響應(yīng)元件，這可能與α-苦瓜素抗病毒、抗真菌、抗蟲的活性相關(guān)[25-27]，因此推測(cè)，外界環(huán)境的變化可能會(huì)通過啟動(dòng)子區(qū)域上的這些順式作用元件激活α-苦瓜素基因的表達(dá)，從而調(diào)控苦瓜對(duì)病原菌的防御和逆境脅迫的抗性。另外，α-苦瓜素啟動(dòng)子含有與胚乳表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件，推測(cè)α-苦瓜素在種子中高效表達(dá)，這與以往研究一致，以往研究證明苦瓜種子中α-苦瓜素含量較高，相關(guān)研究多從苦瓜種子中提取苦瓜素[28-30]。

本研究以28份苦瓜種質(zhì)為材料，分析了α-苦瓜素啟動(dòng)子區(qū)域SNP和InDel分布情況，共發(fā)現(xiàn)24個(gè)SNP位點(diǎn)和1個(gè)InDel，通過SNP分組發(fā)現(xiàn)，28份苦瓜種質(zhì)資源α-苦瓜素基因啟動(dòng)子共存在4種單倍型。結(jié)合順式調(diào)控元件預(yù)測(cè)結(jié)果，3個(gè)SNP位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，可能對(duì)α-苦瓜素基因的表達(dá)調(diào)控有重要影響。在下一步的研究計(jì)劃中，將開展不同單倍型與α-苦瓜素表達(dá)水平的相關(guān)性分析。

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