廖倡宇，張鵬飛，王 印，*，楊澤曉，姚學(xué)萍，姜睿姣，鄔旭龍， 張 博， 周麗軍，宋 勇

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130； 3.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300300)

莫拉菌屬(Moraxella. ap.)是一類成對(duì)狀或短鏈狀的革蘭陰性菌，短且寬，接近球狀?？ㄋ鷮侔l(fā)現(xiàn)于1896年，當(dāng)時(shí)稱卡他微球菌(MicrococcusCatarrhais)，是上呼吸道的正常菌群之一。過(guò)去人們一致認(rèn)為無(wú)致病性，但近年來(lái)研究表明，該菌可寄生于人和其他溫血?jiǎng)游镳つ?，是一種條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，可單獨(dú)或與其他細(xì)菌共同引起急性中耳炎、鼻竇炎、支氣管肺部感染，以及腦膜炎、心內(nèi)膜炎和敗血癥等各種感染[1]。所導(dǎo)致的感染為多點(diǎn)散發(fā)，偶可引起醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)，卡他莫拉菌是急性中耳炎、鼻竇炎、慢性氣管炎急性發(fā)作和社區(qū)獲得性肺炎最主要的致病菌之一，也是小兒腦膜炎及菌血癥的常見(jiàn)病因，引起了廣泛臨床關(guān)注[2]。該菌可產(chǎn)生穿孔毒素，引起黏膜和結(jié)膜病變，具有傳染性[3]。其中，牛莫拉菌可引起牛傳染角膜結(jié)膜炎，亦稱牛紅眼病(IBK)[4]；該病在美國(guó)常見(jiàn)的牛病中居第二位，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且全球均有發(fā)生[5]。該菌已從兔[6]、駱駝[7]、犬[8]、山羊[9]、綿羊[10]、豚鼠[11]等多種動(dòng)物分離得到。近年來(lái)從患有腦膜炎、心內(nèi)膜炎的病豬中分離的莫拉菌數(shù)量呈上升趨勢(shì)[12-14]。

2016年11月，從四川某地送檢2 頭仔豬，癥狀主要為發(fā)熱，食欲減低，呼吸急促，眼瞼有輕微腫大；病理剖檢發(fā)現(xiàn)胸腔大量積液，同時(shí)心臟上附著有少量偽膜。剖檢主要表現(xiàn)為胸膜炎癥，與副豬嗜血桿菌病理癥狀相似，PCR檢測(cè)圓環(huán)2型病毒核酸為陽(yáng)性。故本研究采用常規(guī)的微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過(guò)純化分離、生化試驗(yàn)、16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序、動(dòng)物試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)以及3種耐藥基因的PCR擴(kuò)增分析。對(duì)送檢的病料進(jìn)行檢測(cè)，為該病的臨床診斷、藥物治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料和試驗(yàn)動(dòng)物

臨床樣品采集自四川省某豬場(chǎng)2 頭豬的病變心臟； SPF健康昆明鼠18～22 g(購(gòu)自四川達(dá)碩生物科技公司)。

1.2 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、綿羊鮮血平板、藥敏紙片及微量生化反應(yīng)管均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、凝膠回收試劑盒等均購(gòu)自成都擎科生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)菌分離

無(wú)菌采集病料樣品接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，挑菌后革蘭染色鏡檢，通過(guò)平板劃線法進(jìn)行細(xì)菌純化，并用鮮血平板鑒定其溶血性。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察與生化鑒定

挑取單菌落接種于已添加5 μL生長(zhǎng)因子NAD的微量生化管中，37 ℃培養(yǎng)48～72 h，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]進(jìn)行生化特性鑒定。

1.5 16S rDNA的擴(kuò)增及序列測(cè)定

利用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，放置于-20 ℃?zhèn)溆?，作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系40 μL: 2×TaqPCR Master Mix 20.0 μL，ddH2O 10.0 μL，上、下游引物各3.0 μL(表1)，模板DNA 4.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物純化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后獲得菌株的16S rDNA序列，將該序列在GenBank上采用BLAST進(jìn)行比對(duì)，確定種屬范圍。選取同屬不同動(dòng)物源性的部分菌株16S rDNA序列用DNAstar軟件進(jìn)行同源性分析，使用MEGA 5.1軟件對(duì)其運(yùn)用鄰近法(neigh-bour joining)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(phylogenetic tree)。

1.7 小鼠致病性試驗(yàn)

參照改良寇氏法，分離菌株接種到胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，將菌液濃度調(diào)整為1×109cfu·mL-1的細(xì)菌懸液。選擇用無(wú)特定病原體小鼠(SPF小鼠)(每只18～22 g)，每組5 只，設(shè)立5 組，腹腔注射每只注射0.2 mL的菌液；同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，注射等量的無(wú)菌生理鹽水。

1.8 藥敏試驗(yàn)

參照CLSI推薦的瓊脂擴(kuò)散法(K-B)進(jìn)行分離株的藥物敏感試驗(yàn)。

1.9 耐藥基因PCR檢測(cè)

選取了β-內(nèi)酰胺酶類Tem-1、DHA-1兩種耐藥基因和耐受碳青霉烯類藥物的耐藥基因OXA-48，并分別使用相關(guān)特異性引物(表1)進(jìn)行耐藥基因的PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系40.0 μL: 2×TaqPCR Master Mix 20.0 μL，模板4.0 μL，上下游引物各1.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。對(duì)PCR陽(yáng)性擴(kuò)增片段進(jìn)行膠回收，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將產(chǎn)物送成都擎科生物科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體形態(tài)觀察

菌株ZY20001在普通平板生長(zhǎng)不良，麥康凱平板不生長(zhǎng)， TSA生長(zhǎng)較好， 40 h以上方可見(jiàn)明顯菌落。該菌的菌落圓潤(rùn)，半透明，光滑，隆起，菌落直徑1～2 mm，無(wú)溶血性。革蘭染色鏡檢為革蘭陰性菌，短桿狀，一般成對(duì)狀排列(圖1)。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果和進(jìn)化樹(shù)分析

將挑取的ZY20001菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，大小約為1 400 bp(圖2)。將其16S rDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與莫拉菌(GenBank登錄號(hào)GU226327.1)同源性高達(dá)99%。在NCBI上選取不同來(lái)源的莫拉菌(表2)16S rDNA序列，通過(guò)DNAstar比對(duì)同源性，發(fā)現(xiàn)ZY20001與Moraxellasp.(GenBank登錄號(hào)：GU226327.1)和(GenBank登錄號(hào)：NR_042666.1)同源性高達(dá)99.5%(圖4)。通過(guò)MEGA 5.1進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該株莫拉菌與豬源分支莫拉菌同源性最高(圖3)，該分支與其他動(dòng)物源分支莫拉菌為并列關(guān)系。

表2試驗(yàn)用引物序列

Table1Primer sequences used in this experiment

基因名稱Genename引物序列Primersequence(5'-3')片段長(zhǎng)度Productslength/bp擴(kuò)增基因名稱Amplifiedgenename16SrDNAP1:AGTTTGATCCTGGCTCAG150016srDNAP2:TTACCTTGTTACGACTOXA-48P1:CTTTCACAGGTGTGCTGGGT743碳青霉素烯酶P2:GTACGCATACTGGCTTTGCCarvapenmaseDHA-1P1:CTTTCACAGGTGTGCTGGGT405產(chǎn)頭孢菌素內(nèi)酰胺酶P2:GTACGCATACTGGCTTTGCAmpCbeta-lactamaseTEM-1P1:AAATTCTTGAAGAC1075產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺類酶P2:CCAATGCTTAATCAExtendedspectrumbeta-lactamases

試驗(yàn)用引物序列參照文獻(xiàn)[17]， 引物由成都擎科生物科技有限公司合成。

Test primer sequences were designed according to the literature [17]. Primers were synthesized by Chengdu Tsingke Biotechnology Technology Limited Engine.

圖1 革蘭染色結(jié)果(10×100)Fig.1 Result of Gram staining (10×100)

2.3 細(xì)菌生化特性

分離菌經(jīng)48～72 h生長(zhǎng)后，觸酶陽(yáng)性；V-P試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、鳥氨酸脫氫酶、運(yùn)動(dòng)性、葡萄糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、七葉酸水解阿拉伯糖、D-葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，0%和1%的NaCl均為陰性。與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》描述的莫拉菌屬部分菌株的部分生化特性相同，該菌生長(zhǎng)需要的營(yíng)養(yǎng)要求較高。普通的單一的營(yíng)養(yǎng)成分基本無(wú)法適應(yīng)其生長(zhǎng)。

2.4 小鼠致病性試驗(yàn)

注射菌液12 h左右，小鼠出現(xiàn)精神不振，部分小鼠停止進(jìn)食。24 h后，隨機(jī)選取部分精神狀態(tài)不佳的小鼠剖檢，未發(fā)現(xiàn)典型的病變特征，48 h剖檢精神狀態(tài)不佳小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠心包少量積液(約0.03 mL)，無(wú)偽膜。無(wú)菌蘸取積液接種于TSA平板，進(jìn)行分離純化，經(jīng)過(guò)細(xì)菌分離鑒定后再次分離到該菌。96 h后，剩余的小鼠開(kāi)始逐步進(jìn)食，飲水。1周內(nèi)所有小鼠逐步恢復(fù)，試驗(yàn)期間，未見(jiàn)死亡。

2.5 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)ZY20001菌株的藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)慶大霉素，阿米卡星等16種抗生素敏感，對(duì)奧復(fù)星，多粘菌素B等5種抗生素中度敏感，對(duì)哌拉西林耐藥(表4)。

M， DL 2000分子質(zhì)量標(biāo)記； 1， 16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果； 2， 陰性對(duì)照。M， DL 2000 marker； 1， 16S rDNA amplification results； 2， Negative control.圖2 16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 16S rDNA amplification results

2.6 耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)分離菌株ZY20001進(jìn)行3種耐藥基因的PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖5)，Tem-1基因條帶陽(yáng)性，長(zhǎng)度為1 075 bp。OXA-48耐藥基因和DHA-1耐藥基因PCR擴(kuò)增為陰性。根據(jù)藥敏結(jié)果顯示，該菌對(duì)青霉素高度敏感，但該菌又含有Tem-1耐藥基因?？梢?jiàn)含有耐藥基因不一定會(huì)表現(xiàn)出該基因的耐藥表型。

表2菌株說(shuō)明

Table2Strain description

菌株Strains登錄號(hào)Accessionnumber來(lái)源Source地區(qū)RegionsSN10-2MGU226327.1豬Porci西班牙Spain248-01NR_042666.1豬Porci西班牙SpainCD12CA4EF396294.1豬Porci西班牙SpainSN9-4MNR_116918.1豬Porci西班牙SpainCCUG_2154NR_041695.1兔Cunculi瑞典SwedenCCUG2154TAF005188.1兔Cunculi瑞典SwedenMOR44FM244731.1駱駝Camel比利時(shí)BelgiumMOR43FM244730.1駱駝Camel比利時(shí)BelgiumATCC25238TAF005185.1人Homosapiens瑞典SwedenNe11NR_028669.1人Homosapiens瑞典SwedenATCC25238NR_118775.1羊Ovis瑞典SwedenATCC33078TAF005186.1羊Ovis瑞典Sweden199/55NR_028670.1羊Ovis瑞典SwedenSp346JN001947.1牛Calf烏拉圭UruguaySJ03BJN001946.1牛Calf烏拉圭UruguayFs328JN001948.1牛Calf烏拉圭UruguayN7NR_028914.1犬Canis美國(guó)USALMG11194TAJ269511.1犬Canis比利時(shí)Belgium

圖3 16S rDNA進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA

圖4 16S rDNA同源性Fig.4 Homology of 16S rDNA

表4分離株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

Table4Drug sensitivity test results of isolates

藥物Drug劑量Dose/μg抑菌圈直徑Diameter/mm敏感度Sensitivity慶大霉素Gentamicin1026S阿米卡星Amikacin2024S卡那霉素Kanamycin3016S四環(huán)素Cyclomycin3027.5S青霉素Penicillin10U24S哌拉西林Piperacillin1000R頭孢曲松Ceferiaxone3024S頭孢哌酮Cefoperazone7525S頭孢氨芐Cefalexin3023S奧復(fù)星Ofloxacin518I多西環(huán)素Doxycycline2425S諾氟沙星Norfloxacin1014I環(huán)丙沙星Ciprofloxacin518I氟苯尼考Florfenicol3020S左氧氟沙星Levofloxacin524S恩諾沙星Enrofloxacin1020S多粘菌素PolymyxinB3014I復(fù)方新諾明Cotrimoxazole23.7516I呋喃唑酮Furazolidone30024S紅霉素Erythromycin1540S頭孢曲松Rocephin3020S麥迪霉素Mydecamycin3020S

S為敏感； I為中度敏感； R為耐藥。

S，Sensitive; I， Intermediary; R， Resistance.

M， DL 2000分子質(zhì)量標(biāo)記； 1、2、3分別為Tem-1，OXA-48，DHA-1； Tem-1長(zhǎng)度是1 075 bp。M， DL 2000 marker. 1， 2， 3 were Tem-1，OXA-48，DHA-1，respectively. The length of Tem-1 is 1 075 bp.圖5 ZY20001部分耐藥基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖檢測(cè)Fig.5 Agarose detection results of ZY20001 partial resistance gene PCR amplification products

3 討論

國(guó)內(nèi)外對(duì)豬源莫拉菌研究較少，但近年來(lái)，分離出的致病豬源莫拉菌呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，國(guó)內(nèi)卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究所分離的豬源莫拉菌國(guó)內(nèi)尚屬首例。

由于國(guó)內(nèi)尚無(wú)對(duì)豬源莫拉菌較為系統(tǒng)的劃分，故本研究將部分莫拉菌屬的16S rDNA序列按動(dòng)物源將莫拉菌進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)豬源莫拉菌是屬于莫拉菌的一個(gè)亞種，與牛源莫拉菌、兔源莫拉菌、犬莫拉菌、卡他莫拉菌一樣，形成一個(gè)獨(dú)立的分支，這與Vela等[14]的研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，豬源莫拉菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，生長(zhǎng)周期較慢，40 h左右才出現(xiàn)明顯的菌落，對(duì)獸醫(yī)臨床常用抗生素表現(xiàn)不同程度的敏感，在環(huán)境中極易死亡[3]。故臨床樣本中極少能分離出該菌。

菌株ZY20001對(duì)21種抗生素表現(xiàn)出不同程度的敏感性。菌株ZY20001具有TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)青霉素敏感，其耐藥的表型與基因型不符，菌株ZY20001具有潛在抗藥性。由于環(huán)境和遺傳調(diào)控著抗生素耐藥性表型表達(dá)，已有研究表明，過(guò)長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期將導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺類的抗生素藥效降低。該菌生長(zhǎng)周期較緩慢，但菌株ZY20001依然表現(xiàn)明顯的敏感性，并且對(duì)多種抗生素表現(xiàn)出敏感，極有可能是菌株ZY20001攝取抗生素的能力較強(qiáng)，即使細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，但是酶尚不足以完全作用于進(jìn)入菌體的青霉素。在某些情況下，例如在PhoPQ系統(tǒng)中，脂質(zhì)A的改變，其降低負(fù)電荷并且導(dǎo)致陽(yáng)離子肽靜電排斥到細(xì)胞表面。這與生物膜中觀察到的另一個(gè)常見(jiàn)的反應(yīng)類似：多重耐藥外排泵的增加，增加抗生素的外排或降低的抗生素?cái)z取的能力，這些功能與代謝活性降低或膜的成分變化有關(guān)[19]。綜上，可能是菌株ZY20001的TEM型β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因位點(diǎn)發(fā)生突變、耐藥基因水平轉(zhuǎn)移等因素導(dǎo)致或該菌具有較強(qiáng)的抗生素?cái)z取的能力。

莫拉菌屬作為一類條件致病菌，主要侵襲部位為人和動(dòng)物的黏膜。受感染的患畜多伴有黏膜部位或結(jié)膜部位的炎癥，在一定條件下可引起仔豬的全身感染。本研究表明，豬源莫拉菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，對(duì)環(huán)境的耐受較差，該菌對(duì)多種抗生素敏感，這可能也是該菌引起的相關(guān)疾病偶有發(fā)生，未大面積出現(xiàn)的重要原因。該菌含有TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因，卻少見(jiàn)地表現(xiàn)出對(duì)青霉素敏感?？梢?jiàn)，有TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因并不一定會(huì)表現(xiàn)出青霉素耐藥，這為豬源莫拉菌的臨床用藥和進(jìn)一步耐藥機(jī)理研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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