黃鎮(zhèn)宇，章 群，盧麗鋒，周 琪，唐楚林

（暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系，廣州 510632）

鯔科（Mugilidae）魚類隸屬硬骨魚綱（Osteichthyes）鯔形目（Mugiliformes），廣泛分布于熱帶亞熱帶及溫帶海洋［1］，不僅影響著鄰近海域生態(tài)系統(tǒng)的營養(yǎng)轉(zhuǎn)移和浮游生物的豐富度，具有重要的生態(tài)意義［2-3］，同時具有生長速率快、產(chǎn)量高、肉味鮮甜等特點(diǎn)，是世界重要的經(jīng)濟(jì)魚類［4-5］。但近年來，受過度捕撈和環(huán)境污染等影響，中國近海范圍內(nèi)的鯔科魚類資源已銳減，處于被過度利用的狀態(tài)［6-7］，亟待開展種質(zhì)資源的保護(hù)及開發(fā)利用的研究。

正確鑒定物種是開展生態(tài)調(diào)查與資源管理的前提。傳統(tǒng)的形態(tài)分類方法易受鑒定者的主觀經(jīng)驗(yàn)、樣本的保存狀況、發(fā)育階段及其環(huán)境因素的影響而出現(xiàn)鑒定錯誤。為避免主觀因素的影響，BEDDOW等［8］提出形態(tài)測量方法，即將在魚類樣本上標(biāo)出一系列坐標(biāo)點(diǎn)間的間距作為不同的形態(tài)參數(shù)，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較不同魚類間形態(tài)的相似性與差異性進(jìn)行物種的分類，但該方法無法完全區(qū)分形態(tài)相似的物種。為此，HEBERT等［9-10］提出了 DNA條形碼的概念，即通過分析一段標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)基因DNA序列對物種進(jìn)行鑒定。在DNA條形碼對鳥類、魚類和昆蟲等生物的鑒定成功［9-10］之后，線粒體 CO I序列5’端處約650 bp長度的序列分析憑借DNA的提取方便、種間與種內(nèi)距離具有明顯間隔等特點(diǎn)，在揭示隱存種、鑒定缺少形態(tài)變化或標(biāo)本殘缺的物種等方面具有突出優(yōu)勢，逐漸成為動物界首選DNA條形碼標(biāo)記［11-12］。

鯔科魚類外部形態(tài)保守（尤其在幼魚階段），有效的種間劃分特征不明顯［13］，迄今分類存在爭議，如NELSON［14］將世界鯔科魚類分為17屬72種，THOMSON［15］則認(rèn)為是 14屬 62種。中國鯔科魚類曾被劃分為5屬28種，后更改為7屬13種［16］。目前，形態(tài)測量方法和DNA條形碼技術(shù)已被運(yùn)用在鯔科魚類的研究中。如劉建勇［5］通過形態(tài)計(jì)測比較了國內(nèi)鯔科魚類的不同地理群體的異同；劉璐等［17］測定了國內(nèi)5省9個地點(diǎn)5種鯔科魚類25個樣本的DNA條形碼序列；上述研究解決了中國部分鯔科魚類的分類問題，但涉及地區(qū)和種類有限。本研究測量了中國8省27個地點(diǎn)的7種鯔科魚類226個樣本的40項(xiàng)形態(tài)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行了形態(tài)聚類分析、主成分分析、判別函數(shù)分析，同時還測定了其中57個樣本的CO I基因5’端的部分序列，并結(jié)合從Genebank數(shù)據(jù)庫下載的關(guān)于中國鯔科魚類的9種魚27條同源序列，開展中國鯔科魚類的DNA條形碼研究，旨在豐富中國鯔科魚類的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，為中國鯔科魚類種質(zhì)資源的管理保護(hù)與開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

圖1 鯔科魚類的框架結(jié)構(gòu)圖（參照BEDDOW等［8］修改）Fig.1 M orphometricmeasurements of Mugilidae（revised based on BEDDOW et al［8］）

1 材料與方法

1.1 物種鑒定、形態(tài)測量和統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)合《南海魚類志》［18］與《中國魚類系統(tǒng)檢索》［19］，鑒定本實(shí)驗(yàn)室保存的鯔科魚類標(biāo)本，參照BEDDOW等［8］的方法和12個解剖學(xué)坐標(biāo)點(diǎn)對采自中國8省27個地點(diǎn)的鮻（Liza haematocheila）49 ind、棱鮻 （Liza affinis）50 ind、圓吻凡鯔（Valamugil seheli）60 ind、灰 鰭 鮻 （Liza melinopterus）1 ind、鯔（Mugil cephalus）11 ind、綠背鮻（Liza subviridis）52 ind、未命名種 B（Liza sp.B）3 ind共226個樣本進(jìn)行40項(xiàng)數(shù)據(jù)的測量，分別如圖 1所示：1（全長）、2（標(biāo)準(zhǔn)長）、3（頭長）、4（頭高）、5（吻長）、6（眼徑）、7（尾柄長）、8（尾柄高）、9（背鰭高）、10（胸鰭長）、11（腹鰭長）、12（臀鰭基長）、13（臀鰭長）、14（眼間距）、AB、AC、BC、BD、BE、CD、CE、DE、DF、DH、EF、EG、EH、FG、FH、GI、GH、GJ、HJ、HI、IJ、IK、IL、JK、JL、LK。然后將測得數(shù)據(jù)（除全長外）全部除以全長，轉(zhuǎn)換成百分比，最后通過SPSS軟件輸出形態(tài)聚類圖、主成分分析圖、判別函數(shù)圖。

1.2 分子實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)處理

參考樂小亮等［20］方法提取魚類樣本的DNA，使 用 擴(kuò) 增 引 物 FishF2_t1：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAG ATATCGGCAC［21］， FR1d_t1： 5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARA AYCARAA［22］，以及本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的引物COIF：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGTGGC AATYACDCGCTGAT，COIR：5’-CAGGAAACAG CTATGACNACYTCNGGRTGNCCRAAGAA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳后將條帶清晰明亮的PCR產(chǎn)物送于華大基因公司，使用引物 5’-TGTAAAA-CGACGGCCAGT［23］進(jìn) 行 測 序。 從GenBank下載中國鯔科魚類同源序列，通過MEGA［24］等軟件對測得的序列進(jìn)行人工校對及堿基構(gòu)成、顛換率的計(jì)算，并構(gòu)建基于K2P模型的系統(tǒng)鄰接樹和計(jì)算分支間、分支內(nèi)遺傳距離，運(yùn)用ABGD（automatic barcode gap discovery）方法進(jìn)行假設(shè)種的分析［25］。本文所分析的序列詳情見表1。

表1 中國鯔科魚類采集地點(diǎn)、數(shù)量、編號與序列來源Tab.1 Sampling locations，sample sizes，codes and sequence origins of M ugilidae from Chinese waters

2 結(jié)果與分析

2.1 鯔科魚類量度特征的分析

在形態(tài)聚類圖上（圖2），首先聚類的是圓吻凡鯔、鯔和棱鮻，然后綠背鮻、Liza sp.B、鮻、灰鰭鮻依次加入聚類。在主成分散點(diǎn)圖上（圖3），棱鮻和鯔與其它種類在第一主成分（軀干特征）中的重疊部分較少；在第二成分（頭部特征）中，各種魚重疊部分較多，不能較好區(qū)分開來。判別函數(shù)分析結(jié)果表明（圖3），棱鮻的判別率是最高的，達(dá)到100%；綠背鮻的判別率最低，只有87.5%。在預(yù)測組中的32例中，1例被誤判為鮻，1例被誤判為鯔，2例被誤判為棱鮻；鮻的判別率為94%，在預(yù)測組中的50例，有3例被誤判為鯔；鯔的判別率為96.7%，在預(yù)測組的30例中，有一例被誤判為鮻；圓吻凡鯔的判別率為96.7%，在預(yù)測組的60例中，一例被誤判為綠背鮻，一例被誤判為棱鮻。此外，因灰鰭鮻及Liza sp.B的樣本數(shù)量不夠，無法進(jìn)行主成分、判別函數(shù)分析。

2.2 鯔科魚類DNA條形碼分析

在652 bp序列中，共發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)221個，簡約信息位點(diǎn)215個，沒有出現(xiàn)堿基的插入或缺失。A、T、C、G平均含量為：23.3%、29.9%、28.5%、18.3%，其中 A+T含量（53.2%）大于 C+G含量（46.8%），與其它硬骨魚類CO I序列堿基組成的基本特征一致。轉(zhuǎn)換與顛換比4.46，表明序列突變沒有達(dá)到飽和，適合于系統(tǒng)發(fā)育分析［26］。

圖2 形態(tài)量度的聚類圖Fig.2 Dendrogram of M ugilidae constructed by morphometric measurements

圖3 5種鯔科魚類40個測量特征的主成分散點(diǎn)圖（左）與判別函數(shù)得分（右）Fig.3 Scatterplot of principal component analysis（left）and discrim inant scores（right）based on 40 morphologicalmeasurements of 5 species of Mugilidae

在鄰接樹上14種魚類84條序列形成了12個明顯的分支（圖 4），分支間平均遺傳距離17.14%（7.26% ～23.94%）約為分支內(nèi)平均遺傳距離 0.24%（0～1.5%）的 71倍（圖 5），與ABGD分析結(jié)果相符（圖6）：當(dāng)先驗(yàn)遺傳距離大于2.15%時，鯔科被分成12個假設(shè)種。其中，Liza sp.A、鮻、大鱗鮻、綠背鮻、黃鯔、粒唇鯔、鯔、帕氏凡鯔獨(dú)立成支，分別對應(yīng)分支 2、3、5、7、8、9、10、11。從Genbank下載的灰鰭鮻序列LizamelY.LeiZ1與實(shí)驗(yàn)測序的棱鮻序列聚合在分支1上，其余的灰鰭鮻序列在分支4；下載的Liza sp.C與實(shí)驗(yàn)測序的Liza sp.B序列混雜在分支6中；下載的長鰭莫鯔序列和測序的圓吻凡鯔序列混雜在分支12。鯔進(jìn)一步分成2個單系分支，分支間平均遺傳距離2.44%約為分支內(nèi)平均遺傳距離0.08%的31倍，與ABGD分析結(jié)果一致（圖5）：當(dāng)先驗(yàn)遺傳距離為0.28% ～2.15%時，鯔科被分成了13個假設(shè)種。

圖4 基于K 2P模型的進(jìn)化樹Fig.4 NJ trees based on K 2Pmodel

3 討論

3.1 鯔科魚類的種間形態(tài)特征

在形態(tài)聚類圖中，大鱗鮻、棱鮻和鯔首先聚類，表明3者形態(tài)較為接近；鮻、灰鰭鮻最后加入聚類，表明與其它魚有較大形態(tài)差異。在主成分散點(diǎn)圖中，棱鮻和鯔與其它種類在第一主成分（軀干特征）上的重疊部分較少，各種魚在第二成分（頭部特征）上重疊部分較多；表明棱鮻和鯔在軀干特征上與其它魚類差異最大。據(jù)判別函數(shù)分析，棱鮻的判別率最高，表明最容易辨認(rèn)；綠背鮻的判別率最低，表明易被誤判為其它物種；但這一結(jié)論不完全符合形態(tài)聚類分析結(jié)果，表明根據(jù)形態(tài)測量進(jìn)行的分類結(jié)果可能會隨著分析的方法不同而有所不同。總體而言，鮻、圓吻凡鯔、綠背鮻、鯔、棱鮻等5種魚在主成分散點(diǎn)圖及判別函數(shù)散點(diǎn)圖（圖2、圖3）上都出現(xiàn)了較高程度的重疊，說明種間的區(qū)別不明顯，不能完全依靠單一的量度特征進(jìn)行分類鑒定。

3.2 根據(jù)DNA條形碼推測鯔科魚類的分類地位

利用基于CO I基因序列的DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定有2個主要標(biāo)準(zhǔn)［9-10］：1）種間遺傳距離接近或大于種內(nèi)遺傳距離10倍。2）種內(nèi)遺傳距離一般不大于2%。鯔科魚類鄰接樹上的12個分支的分支間平均遺傳距離17.14%（7.26%～23.94%）約為分支內(nèi)平均遺傳距離0.24%（0～1.5%）的71倍，其中8種物種獨(dú)立成支，支持其物種有效性。對于混雜分支的魚類而言，因無法對從Genbank數(shù)據(jù)庫下載的序列進(jìn)行形態(tài)鑒定，在此僅對其分類地位的可能性作以下推測：1）鑒定有誤。由于魚類的種間外觀形態(tài)相似，個體形態(tài)隨著發(fā)育階段的不同而改變［27-28］，故根據(jù)傳統(tǒng)分類學(xué)進(jìn)行分類時容易出現(xiàn)鑒定錯誤。下載的灰鰭鮻序列LizamelY.LeiZ1與實(shí)驗(yàn)測定的棱鮻序列聚合在分支1上，其余的灰鰭鮻序列占據(jù)了分支4，而分支1的分支內(nèi)遺傳距離0.2%遠(yuǎn)少于HEBERT等［9-10］提出的種內(nèi)遺傳距離為2%的閾值，表明下載的灰鰭鮻序列LizamelY.LeiZ1可能隸屬棱鮻。2）Liza sp.B與Liza sp.C是同一物種。因2者聚集的分支的分支內(nèi)遺傳距離為0，屬種內(nèi)差異［9-10］。3）圓吻凡鯔及長鰭莫鯔為同種異名。由于鯔科魚類種類繁多且種間的形態(tài)相似，其鑒定結(jié)果中存在不少同種異名，僅鯔就出現(xiàn)過至少33個同種異名［29］。由Genbank下載的長鰭莫鯔序列和實(shí)驗(yàn)室測定的圓吻凡鯔的序列混雜在分支12，其分支內(nèi)遺傳距離為0.2%，屬種內(nèi)水平［9-10］，故推測它們可能是同種異名。4）雜交所致。當(dāng)種間的生殖隔離機(jī)制薄弱時容易出現(xiàn)雜交情況［30］，雜交所產(chǎn)生的后代可能會偏向其中一種親本的形態(tài)，而線粒體為母系遺傳，以致其分子與形態(tài)的鑒定結(jié)果不一致，造成鄰接樹上的分支出現(xiàn)不同物種的混雜。如CASTRO等［31］研究中就曾推測鯔科魚類因雜交而導(dǎo)致鄰接樹的混雜。雜交現(xiàn)象的確認(rèn)需結(jié)合更充足的樣本和核基因分析。

圖5 分支間（左）與分支內(nèi)（右）遺傳距離的柱狀圖Fig.5 The histogram of genetic distance between（left）and among（right）clades

圖6 鯔科魚類ABGD分析Fig.6 Automatic barcode gap discovery analyses of M ugilidae

鯔2個分支間的遺傳距離2.44%，約為分支內(nèi)平均遺傳距離0.08%的31倍，滿足HEBERT等［9-10］提出的10×法則，或可認(rèn)為是不同的物種。但因其分支間的遺傳距離接近 HEBERT等［9-10］提出的種內(nèi)閾值2%，且2個分支對應(yīng)的樣本的外部形態(tài)較為相似，故其可能仍隸屬同一物種。據(jù)宮亞運(yùn)等［32］對棱鳀屬（Thryssa）魚類和BUTLIN等［33］對 Chorthippus parallelus的研究，在分子上有較高的親緣關(guān)系且在形態(tài)上有局部差異的不同群體可能是同一物種的不同亞種，而本項(xiàng)研究中的鯔2個分支存在類似情況，二者分別對應(yīng)尾鰭長較長、體高較短，與尾鰭較短、體高較長等2組形態(tài)，或可作為鯔的2個亞種。由于物種的進(jìn)化是連續(xù)的，種內(nèi)與種間的差異并沒有絕對的標(biāo)準(zhǔn)［34］，故鯔2個分支的準(zhǔn)確分類地位需進(jìn)一步研究。

4 展望

形態(tài)測量結(jié)果表明，鯔科魚類的外部形態(tài)較為相似，僅依據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)分類方法進(jìn)行鑒定會容易出現(xiàn)錯誤。結(jié)合形態(tài)測量及基于線粒體CO I基因5’端序列的DNA條形碼進(jìn)行分類，因統(tǒng)計(jì)學(xué)的客觀性與分子上種間與種內(nèi)間隔明顯等特點(diǎn)，可提高鯔科物種鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。正如我們在前期工作中，由于樣本的保存問題和傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)不足等因素，曾將Liza sp.B與綠背鮻混淆，后通過形態(tài)測量及DNA條形碼分析則可準(zhǔn)確區(qū)分。

由于線粒體是母系遺傳，不能完全反應(yīng)雙親的遺傳信息，對于混雜成支的魚類中存在雜交情況的推測，需結(jié)合核基因進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，本研究僅涉及中國鯔科魚類的部分屬種，且灰鰭鮻、Liza sp.B及鯔的樣本數(shù)量不足，無法進(jìn)行主成分、判別等分析，需在日后的采樣工作中補(bǔ)充物種及樣本數(shù)量，以進(jìn)一步明確中國鯔科魚類的分類地位，為種質(zhì)資源的管理與開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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