李文博，劉薇，陳璨，范文輝，張鶴，劉文軍，孫蕾

1 中國科學(xué)院微生物研究所 病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

親環(huán)素A (Cyclophilin A，CypA) 具有肽基脯氨酰順/反異構(gòu)酶 (PPIase) 活性，是一種在生物界廣泛存在、高度保守的蛋白質(zhì)[1]。細(xì)胞在靜息狀態(tài)時(shí)，CypA主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，只有當(dāng)受到活性氧等外界刺激或發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)才會(huì)分泌到細(xì)胞外[2-3]。胞外CypA (eCypA) 表現(xiàn)出促炎活性和趨化活性，在炎癥發(fā)生的過程中發(fā)揮著重要作用。例如，脂多糖 (Lipopolysaccharides，LPS)刺激的巨噬細(xì)胞分泌大量的eCypA，參與宿主的炎癥反應(yīng)[3]；在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[4-5]、敗血病[6]、動(dòng)脈粥樣硬化[7]、萊姆病[8]等炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生過程中，eCypA表達(dá)量明顯上升。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，eCypA可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)子 (Extracellular matrix metalloproteinase inducer，emmprin，CD147)的表達(dá)水平[9]，并與 CD147以配體-受體形式結(jié)合，參與單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞的趨化，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的白細(xì)胞滲入病變組織。CD147是一種高度糖基化的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，可以與多種蛋白相互作用，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]，參與調(diào)節(jié)生殖與視覺功能以及發(fā)育早期神經(jīng)系統(tǒng)功能等[11]，同時(shí)也參與多種疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程。

目前，以eCypA或CD147為靶點(diǎn)，利用免疫抑制劑 Cyclosporin A (CsA) 和 FK-506、anti-CD147抗體、CD147拮抗肽或者 RNA干擾技術(shù)等抑制eCypA-CD147相互作用，均可在體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)中顯示出很好的治療效果，一定程度上延緩疾病的發(fā)展[12]，這充分揭示了這一藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)的應(yīng)用前景。在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎模型中，經(jīng)anti-CD147抗體或CsA處理后，小鼠支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞滲出比例下降到50%，減輕病變組織的炎癥反應(yīng)。而聯(lián)合使用anti-CD147抗體和CsA兩種藥物與單獨(dú)使用其中一種相比治療效果差別不大，表明anti-CD147抗體和CsA都是針對eCypA-CD147復(fù)合物起作用[13]。此外，干擾eCypA-CD147的相互作用也可減少急性過敏性哮喘中嗜酸性細(xì)胞和 CD4+T細(xì)胞 Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生[14]。然而，上述藥物或抗體在使用過程中不僅會(huì)阻斷eCypA-CD147的結(jié)合，還有可能產(chǎn)生一些副作用。例如，針對PPIase活性的免疫抑制劑CsA和FK-506的特異性較差，可同樣作用于除 CypA之外的其他親環(huán)素家族成員(例如 CypB)[1]，而且會(huì)引起機(jī)體的免疫抑制；anti-CD147抗體封閉CD147使其失活的同時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致CD147其他的正常生理功能受到影響。

由于anti-CypA抗體只在細(xì)胞外針對eCypA發(fā)揮作用，不會(huì)影響細(xì)胞內(nèi) CypA的正常功能，因此，anti-CypA抗體作為一種抗炎癥藥物，用于阻斷 eCypA-CD147相互作用并治療炎癥的可行性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他藥物，將極大地增強(qiáng)藥物的特異性并減少副作用的產(chǎn)生。已有研究將抗華支睪吸蟲親環(huán)素A抗體用于小鼠膿毒血癥的治療，發(fā)現(xiàn)其可以通過減輕炎癥反應(yīng)、抑制彌散性血管內(nèi)凝血保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等多方面發(fā)揮保護(hù)作用，從而降低死亡率[15]。而本研究利用LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和小鼠急性肺炎模型證明了eCypA促進(jìn)炎癥發(fā)生的作用，并進(jìn)一步探討了能夠特異性阻斷eCypA-CD147相互作用的人anti-CypA抗體在抑制小鼠急性肺炎中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6–8周齡雌性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；新西蘭白兔由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)及免疫。

1.2 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞株

表達(dá)人CypA的重組質(zhì)粒pET-30a-CypA、用于聯(lián)合免疫的質(zhì)粒 pcDNA3.0-CypA由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；大腸桿菌TOP10、BL21 (DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存；小鼠骨髓衍生的巨噬細(xì)胞(Bone marrow-derived macrophage，BMDM) 取自C57BL/6小鼠股骨骨髓，原代培養(yǎng)經(jīng)巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)誘導(dǎo)后使用。

1.3 主要試劑及儀器

α-糜蛋白酶、N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide四肽底物、脂多糖、LPS、弗氏完全佐劑購自Sigma公司；Trizol購自Invitrogen公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑購自Promega公司；兔白細(xì)胞介素 (IL-1β) 多克隆抗體購自 Santa Cruz公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS) 購自 Gibco公司；ROX Reference DyeⅡ、SYBR Premix DimerEraser購自 TaKaRa公司；ToxinEraserTM內(nèi)毒素去除試劑盒、ToxinSensorTMChromogenic LAL 內(nèi)毒素檢測試劑盒購自金斯瑞生物科技有限公司；Quantikine ELISA Mouse IL-1β試劑盒購自R&D公司；Superdex 75TM16/60及HiTrap Protein G HP柱購自GE Healthcare并使用其AKTA FPLC蛋白純化系統(tǒng)；紫外分光光度計(jì)Spectrophotometer ND-1000為NanoDrop公司產(chǎn)品；TECAN infinite M200 PRO酶標(biāo)儀購自瑞士Sunrise公司；7500實(shí)時(shí)定量PCR儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)；實(shí)驗(yàn)中所用鹽酸胍、醋酸、辛酸、硫酸銨、葡萄糖、檸檬酸鈉、檸檬酸、乙醇、二甲苯、冰醋酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 CypA蛋白表達(dá)、純化及穩(wěn)定性檢測

將 pET-30a-CypA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，37 ℃平板倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接入含1‰卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)6 h后1∶100接入2 L 1‰卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600在0.6–0.8之間，留取少量誘導(dǎo)前全菌作為對照，在剩余培養(yǎng)液中 1∶2 000加入異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，37 ℃、200 r/min誘導(dǎo)4 h。500 r/min離心15 min收集菌體，取誘導(dǎo)前后菌體破碎并收集沉淀進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 分析，鑒定目的蛋白的表達(dá)。包涵體經(jīng)洗滌后使用6 mol/L鹽酸胍變性，12 000 r/min離心取上清，所得產(chǎn)物復(fù)性換液至含20 mmol/L Tris、20 mmol/L NaCl的緩沖液中。利用Superdex 75TM16/60分子篩純化，收集產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE分析以確定目的蛋白，使用Bicinchoninic acid (BCA) 法測定蛋白含量。

將純化CypA蛋白分別置于37 ℃培養(yǎng)箱中3、6、12、24、36、48、72 h后取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，觀察其降解情況。

1.5 純化CypA蛋白PPIase活性檢測及內(nèi)毒素含量檢測

1.5.1 純化蛋白PPIase活性檢測

采用Fischer等[16]建立的糜蛋白酶偶聯(lián)法，略為改進(jìn)，建立2 mL反應(yīng)體系，包含10 μmol/L α-糜蛋白酶，78 μmol/L N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide四肽底物 (溶于含 0.47 mol/L LiCl的三氟乙醇中)，10 nmol/L純化CypA蛋白。取1 860 μL 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 與 100 μL 200 μmol/L α-糜蛋白酶溶液，混合后在0 ℃下預(yù)平衡 10 min以達(dá)到熱平衡。加入純化所得的1 μmol/L CypA 蛋白 20 μL，5 min 后加入 20 μL的 7.8 mmol/L四肽底物 N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide，迅速混合引發(fā)反應(yīng)。用分光光度計(jì)記錄390 nm處OD值在60 s 內(nèi)的變化，以含20 mmol/L Tris、20 mmol/L NaCl的緩沖液為對照，0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)為空白，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程溫度需控制在0 ℃。

1.5.2 純化蛋白內(nèi)毒素去除及殘余量測定

使用以修飾過的粘菌素 B (PMB) 為配體制成的內(nèi)毒素去除樹脂裝填柱子，純化蛋白經(jīng) 0.22 μm膜過濾除菌后上樣，經(jīng)洗脫去除內(nèi)毒素后收集淋洗液，使用ToxinSensorTMChromogenic LAL內(nèi)毒素檢測試劑盒測定內(nèi)毒素含量。

1.6 anti-CypA多克隆抗體制備及純化

1.6.1 動(dòng)物免疫

新西蘭白兔正常飼養(yǎng)至體重為2 000–2 500 g，觀察7–10 d，身體狀態(tài)無異常備用。第一次免疫(1 d) 取質(zhì)粒 pcDNA3.0-CypA 0.5 mg和純化CypA蛋白1 mg與等體積弗氏完全佐劑(Sigma公司) 乳化至混合物在水中不擴(kuò)散，家兔背部皮下6–8點(diǎn)、雙后腳皮下注射以聯(lián)合免疫。第二次免疫(22 d) 和第三次免疫 (36 d) 均使用0.5 mg純化蛋白和等體積弗氏不完全佐劑乳化至混合物在水中不擴(kuò)散，家兔背部皮下4–6點(diǎn)免疫。檢測血清效價(jià)，使用1 mg純化蛋白加強(qiáng)免疫一次 (50 d)。10 d后，家兔頸動(dòng)脈放血至死亡，取全血大約 100 mL置于4 ℃冰箱過夜，離心分血清約40 mL，分裝后–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 多克隆抗體純化

血清離心取上清，用4倍體積60 mmol/L醋酸緩沖液稀釋，調(diào)至pH 4.5。1∶40加入辛酸，室溫?cái)嚢?0 min，4 ℃靜置2 h以上。離心收集上清，加入1/10體積的10×PBS，調(diào)至pH 7.4，在4 ℃條件下，以0.277 g/mL加入硫酸銨，攪拌30 min，靜置過夜。離心收集沉淀，溶于20 mmol/L磷酸鈉緩沖液 (pH 7.0) 中，使用HiTrap Protein G HP親和層析，以20 mmol/L磷酸鈉緩沖液 (pH 7.0)上樣沖洗，0.1 mol/L Gly-HCl (pH 2.7) 洗脫。收集純化抗體，透析換液至 PBS中，BCA法測定含量。

1.6.3 Western blotting鑒定抗體的有效性

制備小鼠BMDM細(xì)胞，加入M-CSF誘導(dǎo)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞分化貼壁，用細(xì)胞裂解液 (150 mmol/L NaCl，20 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸 (Hepes)，1 mmol/L EDTA，1% TritonX-100，10%甘油，蛋白酶抑制劑) 收取細(xì)胞，4 ℃裂解30 min，12 000 r/min 離心取上清，加入5×上樣緩沖液，95 ℃處理樣品10 min。同時(shí)，取菌體超聲破碎后離心分離得到的包涵體，初步洗滌后于少量PBS中加入5×上樣緩沖液，經(jīng)上述處理后與細(xì)胞裂解液一同進(jìn)行 SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜 (15 V，25 min)。用含1% BSA和5%脫脂奶的TBST封閉過夜，使用純化后抗體以1∶20 000作為一抗，以鼠單抗β-tubulin (1∶2 000)為內(nèi)參，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。二抗為羊抗兔和羊抗鼠，1∶5 000稀釋，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，使用底物顯色試劑盒曝光顯影。

1.7 eCypA對小鼠BMDM中炎癥因子表達(dá)水平的影響

1.7.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中原代培養(yǎng)經(jīng)M-CSF誘導(dǎo)分化的BMDM使用細(xì)胞刮刀刮下，吹打混勻后計(jì)數(shù)，稀釋至 1×106/mL后接入12孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2過夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。換為無血清DMEM培養(yǎng)基，加入不同劑量eCypA刺激其炎癥因子產(chǎn)生。

1.7.2 BMDM中炎癥因子表達(dá)水平檢測

移去細(xì)胞培養(yǎng)基，使用Trizol提取RNA，以oligo(dT18) 作為引物，AMV反轉(zhuǎn)錄酶 (Promega公司) 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得 cDNA，反應(yīng)體系包括12 μL RNA、4 μL oligo (dT18)、16 μL 2.5 mmol/L dNTPs、1 μL AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、10 μL 5×AMV 緩沖液、1 μL RNase抑制劑，加雙蒸水補(bǔ)充至50 μL。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR) 方法檢測IL-1β、IL-6、TNFα的表達(dá)水平，反應(yīng)體系包括 2 μL cDNA、0.2 μmol/L 引物、0.4 μL ROX Reference DyeⅡ、10 μL SYBR Premix DimerEraser (TaKaRa)，加入雙蒸水補(bǔ)足到20 μL。使用7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行 qPCR反應(yīng)，Ct值反應(yīng)程序?yàn)榈谝徊?95 ℃30 s，第二步共 40 個(gè)循環(huán)，包括 95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s。每個(gè)樣品重復(fù) 3次，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，利用公式2-△△Ct計(jì)算其相對表達(dá)量。

用細(xì)胞裂解液收取細(xì)胞，SDS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，封閉過夜，一抗為兔多抗IL-1β (1∶2 000)，二抗為羊抗兔(1∶5 000)，以鼠單抗β-tubulin (1∶2 000) 為內(nèi)參，利用Western blotting檢測IL-1β表達(dá)水平，具體方式同1.6.3。

1.7.3 BMDM上清中IL-1β表達(dá)量檢測

收集每組細(xì)胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 測定各組細(xì)胞上清中炎性因子IL-1β的含量。測定方法按 Quantikine ELISA Mouse IL-1β試劑盒說明書進(jìn)行，每組設(shè) 3個(gè)重復(fù)，于490 nm處讀取OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出蛋白含量。

1.8 anti-CypA抗體對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎治療效果評價(jià)

1.8.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及LPS誘導(dǎo)急性肺炎模型建立

取6–8周齡雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白組(PBS)、未治療組 (LPS)、治療組 (LPS+anti-CypA)3組，每組5只?？瞻捉M每只小鼠經(jīng)鼻腔滴注50 μL PBS，未治療組和治療組小鼠經(jīng)乙醚麻醉后，每只小鼠經(jīng)鼻腔滴注 3 μg LPS (溶于 50 μL PBS)。

1.8.2 治療組anti-CypA抗體給藥

取anti-CypA抗體 200 μg溶于300 μL PBS中，于LPS誘導(dǎo)24 h前腹腔注射給藥一次，LPS誘導(dǎo)后隨即再給藥一次，共計(jì)兩次。

1.8.3 血液和肺組織中IL-1β表達(dá)水平檢測

末次給藥18 h后小鼠眼球取血，1∶1加入阿氏液 (Alsever’s solution) 中，使用Trizol提取RNA。同時(shí)取小鼠肺臟，稱重后加入Trizol研磨，3 000 r/min離心5 min去除沉淀后依照說明書操作提取RNA。經(jīng)RT-PCR后利用實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行qPCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，利用公式2-△△Ct計(jì)算IL-1β相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)方法及體系同1.7.2。

1.8.4 肺指數(shù)檢測及病理切片制作

記錄小鼠體重和肺重量，利用公式 (肺指數(shù)=肺重/體重×100) 計(jì)算肺指數(shù)。拍照記錄小鼠肺表面形態(tài)，并沿支氣管向肺葉中充入10%甲醛。分離肺葉于10%甲醛中固定48 h，經(jīng)脫水透明后包埋于石蠟中以制作病理切片，將切片經(jīng)H&E染色后于鏡下觀察并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組CypA蛋白的表達(dá)和純化

將pET-30a-CypA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集所得菌體經(jīng)超聲破碎后離心，沉淀洗滌后加入 6 mol/L鹽酸胍變性，SDS-PAGE檢測包涵體中重組 CypA蛋白的表達(dá)情況。如圖 1A所示，蛋白以包涵體形式表達(dá)，分子量約為24 kDa，與預(yù)期大小相符。所得變性蛋白復(fù)性濃縮后，利用Superdex 75TM16/60層析柱分離目的蛋白，利用SDS-PAGE鑒定蛋白純度。如圖1B所示，所得蛋白僅在24 kDa存在目的條帶，無其他雜帶，其純度在90%以上。

2.2 CypA蛋白的穩(wěn)定性檢測

將純化蛋白置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別于3、6、12、24、36、48、72 h后取樣進(jìn)行 SDS-PAGE，結(jié)果如圖2所示。CypA蛋白在37 ℃ 24 h內(nèi)可保持穩(wěn)定，在后續(xù)的 CypA刺激細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，作用時(shí)間均在12 h以內(nèi)，排除了由于CypA蛋白降解對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.3 CypA蛋白的PPIase活性檢測

CypA蛋白具有PPIase活性，可催化含脯氨酸的底物肽從反式到順式構(gòu)象的轉(zhuǎn)換。利用糜蛋白酶偶聯(lián)法建立2 mL反應(yīng)體系，記錄60 s內(nèi)390 nm處OD值變化，以O(shè)D390對t(s)作圖。由圖3可見，與空白對照相比，加入CypA樣品的體系中酶反應(yīng)加快，表明2個(gè)CypA蛋白樣品均具有PPIase活性。

圖1 重組CypA蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE analysis of the recombinant CypA. (A)1: protein molecular weight marker; 2: pellet of the post-induced bacterial lysates from ultrasonic disruption. (B)1: protein molecular weight marker; 2: purified recombinant protein by molecular sieve.

圖3 CypA蛋白的PPIase活性檢測Fig. 3 Determination of PPIase activity of CypA.

2.4 CypA蛋白中內(nèi)毒素的去除

PMB可與內(nèi)毒素特異性結(jié)合，以修飾過的PMB為配體制成內(nèi)毒素去除樹脂，可特異性地去除內(nèi)毒素。將純化蛋白分3次去除內(nèi)毒素，其去除效果由鱟試驗(yàn)驗(yàn)證。鱟試劑與樣品內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物顯色，通過比對其與標(biāo)準(zhǔn)品其釋放出的呈色團(tuán)的多少而測定內(nèi)毒素含量。所得結(jié)果如表1所示，3份樣品內(nèi)毒素含量均低于0.000 3 EU/μg，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中可有效避免因內(nèi)毒素存在而誘發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。

2.5 anti-CypA抗體的Western blotting分析

將兔血清經(jīng)辛酸-硫酸銨初步純化后，利用HiTrap Protein G HP柱親和層析，獲得純化后抗體。PBS中透析過夜，測得含量為3.3 mg/mL。為了鑒定抗體的有效性，將純化后 anti-CypA抗體1∶20 000稀釋作為一抗，利用Western blotting對BMDM的細(xì)胞裂解液和表達(dá)CypA蛋白的大腸桿菌包涵體進(jìn)行檢測。由圖4可見，anti-CypA抗體可特異性地識(shí)別BMDM中約為18 kDa的CypA蛋白。在針對包涵體的檢測中，雖然可檢測到其他非特異性條帶，但在24 kDa處條帶更為明顯，識(shí)別度更高。因此，我們制備的anti-CypA抗體能夠有效地識(shí)別真核及原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的CypA蛋白。

表1 CypA蛋白內(nèi)毒素含量的測定Table 1 Determination of endotoxin contamination

2.6 eCypA對小鼠BMDM中炎癥因子表達(dá)的影響

在C57BL/6小鼠BMDM中加入eCypA，終濃度分別為 0.1、0.5、1、2 μmol/L，9 h后收集細(xì)胞，利用 qPCR檢測 IL-1β表達(dá)量的變化。由圖5A可見，eCypA在0–1 μmol/L范圍內(nèi)隨著劑量加大，IL-1β表達(dá)量也隨之提高，表明IL-1β表達(dá)量對 eCypA劑量存在依賴性。但當(dāng) eCypA濃度達(dá)到2 μmol/L時(shí)，IL-1β表達(dá)量顯著下降，可能與高劑量eCypA對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用有關(guān)。加入eCypA 12 h后收集細(xì)胞上清，利用ELISA方法檢測BMDM分泌的IL-1β的含量。由圖5B可見，空白樣品和 0.1 μmol/L樣品中未能檢到 IL-1β，1 μmol/L樣品中IL-1β含量顯著高于0.5 μmol/L樣品。當(dāng) eCypA濃度達(dá)到2 μmol/L時(shí)，上清中IL-1β的含量顯著下降。細(xì)胞裂解后利用Western blotting方法檢測細(xì)胞中pro-IL-1β表達(dá)量的變化。由圖5C可見，細(xì)胞中pro-IL-1β表達(dá)量的變化趨勢與圖 5B中細(xì)胞分泌的 IL-1β含量的變化趨勢一致。

圖4 Anti-CypA抗體有效性鑒定Fig. 4 Identification of anti-CypA antibody by Western blotting analysis. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: CypA protein expressed in BMDM cells;Lane 3: pellet of the post-induced bacterial lysates from ultrasonic disruption.

圖5 eCypA劑量對IL-1β表達(dá)水平的影響Fig. 5 Effect of eCypA’s dose on expression level of IL-1β. (A) qPCR analysis of IL-1β expression level in BMDMs stimulated by eCypA with different doses for 9 h. (B) ELISA analysis of IL-1β concentration in supernatant of BMDMs stimulated by eCypA with different doses for 12 h. (C) Western blotting analysis of IL-1β expression level in supernatant of BMDMs stimulated by eCypA with different doses for 12 h.

以1 μmol/L eCypA刺激BMDM細(xì)胞，分別在3、6、9 h后收集細(xì)胞，利用qPCR方法檢測炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNFα表達(dá)水平變化，結(jié)果如圖6所示。eCypA可誘導(dǎo)IL-1β的表達(dá)，eCypA刺激BMDM 9 h后，IL-1β的表達(dá)量與空白對照相比有極顯著的提高 (P<0.001) (圖6A)。IL-6在BMDM中本底表達(dá)較低，eCypA刺激后IL-6的表達(dá)量上升更為明顯，刺激后3 h和9 h，IL-6的表達(dá)量有顯著提高 (P<0.01)，6 h時(shí)差異極顯著(P<0.001) (圖6B)。TNF-α為早期炎癥因子，其表達(dá)水平在eCypA刺激3 h后便迅速達(dá)到高峰，而后隨時(shí)間下降，與空白對照相比同樣差異顯著(P<0.01，圖 6C)。

以上研究結(jié)果表明，小鼠BMDM中炎癥因子IL-1β的表達(dá)水平對 eCypA存在一定的劑量依賴性，當(dāng)eCypA濃度為1 μmol/L時(shí)基因表達(dá)水平最高。以1 μmol/L eCypA刺激BMDM后，炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNFα的表達(dá)量與空白對照相比均顯著上升?？梢?，eCypA能夠促進(jìn)小鼠BMDM中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。

2.7 anti-CypA抗體治療LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎的效果評價(jià)

如圖 7A所示，空白組肺組織表面無損傷，光滑，紅潤，無出血點(diǎn)；未治療組肺組織表面可見明顯出血點(diǎn)，血管紋路明顯；治療組肺組織表面雖存在少量出血點(diǎn)，但較未治療組相比程度明顯減輕。肺指數(shù)可在一定程度上指示肺損傷強(qiáng)度，由圖 7B可見，未治療組肺指數(shù)顯著高于對照組(P<0.01)，LPS誘導(dǎo)的急性肺炎模型建立成功。治療組肺指數(shù)較未治療組降低了約30%，二者差異顯著 (P<0.05)。肺組織病理切片H&E染色結(jié)果可見(圖7C)，空白組無明顯損傷，肺泡腔完整，無炎性細(xì)泡分泌浸入，肺泡間隙無炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁未見明顯增厚，纖維結(jié)締組織無增生，組成氣管壁的柱狀細(xì)胞排列規(guī)則緊密，氣管內(nèi)無粘液。未治療組肺組織損傷明顯，可觀察到大量單核細(xì)胞滲入肺泡中，肺泡完整性遭到破壞，可見肺泡內(nèi)出血，鄰近肺泡融合為一體，氣管上皮細(xì)胞界限模糊，排列不規(guī)整，呈現(xiàn)急性炎癥表現(xiàn)，其病理形態(tài)證實(shí)小鼠急性肺炎模型建立成功。治療組小鼠肺組織同樣可觀察到白細(xì)胞浸潤，但程度遠(yuǎn)不及未治療組，可觀察到少量單核細(xì)胞進(jìn)入肺泡，肺泡有充血但結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰，氣管上皮細(xì)胞排列較為緊密，氣管中未見粘液。結(jié)合肺部病變和肺指數(shù)計(jì)算結(jié)果，可以認(rèn)為LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎模型建立成功，并且經(jīng)過anti-CypA抗體的治療，小鼠肺部炎癥程度減輕。

圖6 eCypA對炎癥因子表達(dá)水平的影響Fig. 6 Effect of eCypA on expression levels of inflammatory factors. (A) qPCR analysis of IL-1β expression level in BMDMs stimulated by eCypA for 3, 6, 9 h, respectively. (B) qPCR analysis of IL-6 with the same treatment. (C) qPCR analysis of TNF-α with the same treatment.

未治療組小鼠肺組織中 IL-1β顯著高于對照組 (P<0.01) (圖7D)，同樣表明LPS誘導(dǎo)的急性肺炎模型建立成功。經(jīng) anti-CypA抗體治療后小鼠肺組織中IL-1β表達(dá)量下降約60%，與未治療組差異顯著 (P<0.01)。由于IL-1β主要存在于血液中，故小鼠血液樣本中其表達(dá)量變化更為明顯。經(jīng) anti-CypA抗體治療的小鼠血液中 IL-1β低于未治療組，二者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖 7E)。

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的未治療組小鼠肺表面可見明顯出血點(diǎn)，肺指數(shù)較空白組顯著上升，肺組織及血液中 IL-1β表達(dá)水平較空白組顯著增高，表明LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎模型建立成功。經(jīng) anti-CypA抗體兩次給藥后的治療組與未治療組相比，肺表面出血點(diǎn)較少，損傷程度較輕，肺指數(shù)下降。其肺組織和血液中 IL-1β表達(dá)水平與未治療組相比下降顯著，說明anti-CypA抗體在一定程度上阻止了 LPS對小鼠肺臟損傷，減輕和緩解了LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，具有一定治療效果。

圖7 anti-CypA抗體對LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺炎治療效果的評價(jià)Fig. 7 Therapeutic evaluation of anti-CypA antibody in LPS-induced inflammation. (A) Gross lesion of lungs. (B)Lung index (100× lung/body weight). (C) Lung tissue was fixed in 10% formalin, sectioned, and stained with H&E for histological analysis. Representative histological sections from the following groups are shown: PBS alone; LPS alone;LPS plus anti-CypA treatment. The magnification was 800×. (D) Relative gene expression of IL-1β in lung tissue. (E)Relative gene expression of IL-1β in peripheral blood.

3 討論

大部分與CypA相關(guān)的研究認(rèn)為，CypA是一種廣泛存在的胞內(nèi)蛋白，主要在蛋白折疊過程中作為分子伴侶起作用[17]，也有研究表明其在細(xì)胞通訊中起著轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[18]。與此同時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在受到炎癥刺激[3,19]或者氧化應(yīng)激[2,20]狀態(tài)下會(huì)分泌 CypA，活化的血小板同樣會(huì)分泌CypA[7]。由于CypA不具有一般分泌型蛋白所具有的穿膜信號肽，其外泌主要是通過小泡途徑[20]。已有研究表明，胞外CypA與CD147以配體-受體形式結(jié)合，在炎癥反應(yīng)中起著重要作用。Suzuki等[21]發(fā)現(xiàn) CD147胞外結(jié)構(gòu)域中Pro180-Gly181位點(diǎn)在CypA特異性的信號通路中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞表面的肝素率先與eCypA結(jié)合，將其呈遞給 CD147，使下游 ERK通路被激活。IL-1β屬于白細(xì)胞介素-1家族，主要通過刺激炎癥相關(guān)基因的表達(dá)來誘導(dǎo)效應(yīng)蛋白表達(dá)，在免疫調(diào)節(jié)及炎癥進(jìn)程起著重要作用。在使用eCypA刺激小鼠BMDM細(xì)胞后，IL-1β表達(dá)量受到影響，隨著eCypA劑量的增加而上調(diào)，并在1 μmol/L劑量下達(dá)到巔峰。在該eCypA劑量下，早期炎癥因子TNFα表達(dá)水平最先出現(xiàn)上調(diào)，IL-6及IL-1β隨之出現(xiàn)表達(dá)量上升的現(xiàn)象。進(jìn)一步肯定了eCypA作為促炎因子在炎癥反應(yīng)中的作用和地位，為以其為靶點(diǎn)的炎癥藥物設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。

由于目前與eCypA相關(guān)的炎癥反應(yīng)研究中，CypA蛋白主要由原核細(xì)胞表達(dá)獲得，其所含有的LPS可能同樣會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生刺激，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能清晰表達(dá)。因此，我們利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化出高濃度 CypA蛋白后，檢測其穩(wěn)定性，并做內(nèi)毒素去除，檢測其殘余含量，以避免細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中存在的不確定因素。

特異性地阻斷 eCypA-CD147通路的新型藥物設(shè)計(jì)思路可以分為針對 eCypA和針對 CD147兩個(gè)部分，這樣的藥物可同樣對其他與eCypA或者 CD147有關(guān)的疾病起到作用，如癌癥和 HIV感染[22-24]。與以往的利用免疫抑制劑 CsA和FK-506、CD147抗體、CD147拮抗肽或者 RNA干擾技術(shù)等抑制eCypA-CD147相互作用不同，本研究以eCypA為靶點(diǎn)，使用特異性anti-CypA抗體阻斷 eCypA-CD147的相互作用，從而抑制下游的炎癥反應(yīng)，這也不失為一種藥物設(shè)計(jì)思路。

本研究選用C57BL/6小鼠構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的急性肺炎模型。LPS與 TLR4結(jié)合后，主要激活兩條信號通路：髓樣分化因子 88 (Myeloid differentiation factor 88，MyD 88) 依賴的信號通路和MyD 88非依賴的信號通路，促使相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的合成及釋放，最終導(dǎo)致全身炎癥的發(fā)生[25]。胞外 CypA與 CD147以配體-受體形式結(jié)合，在炎癥反應(yīng)中起促進(jìn)作用。CypA與 CD147的作用機(jī)制可能為：在高爾基體囊泡腔內(nèi) Cyp60作用于CD147的Pro211，促進(jìn)了CypA從高爾基體分泌到細(xì)胞外。細(xì)胞外的 CypA與細(xì)胞表面的硫酸肝素蛋白多糖與CD147胞外區(qū)Pro180及跨膜區(qū)Pro211結(jié)合，引起脯氨酸異構(gòu)化，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號事件[18]。然而，細(xì)胞內(nèi)信號通路起始的具體過程和機(jī)制，仍需要進(jìn)一步研究。使用anti-CypA抗體特異性地阻斷eCypA與CD147的結(jié)合，可以抑制CD147下游信號事件啟動(dòng)，干預(yù)eCypA-CD147介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生，避免機(jī)體炎癥反應(yīng)加劇。

我們成功建立了LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎模型，使用 anti-CypA抗體進(jìn)行治療后，可以在一定程度上減輕和緩解炎癥反應(yīng)。本研究為促進(jìn)anti-CypA抗體藥物的臨床應(yīng)用進(jìn)行了一次有益的探索，同時(shí)也為開發(fā)抗炎癥藥物提供了一種新的思路和策略。

[1]Handschumacher RE, Harding MW, Rice J, et al.Cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for cyclosporin A. Science, 1984, 226(4674): 544–547.

[2]Jin ZG, Melaragno MG, Liao DF, et al. Cyclophilin a is a secreted growth factor induced by oxidative stress. Circ Res, 2000, 87(9): 789–796.

[3]Sherry B, Yarlett N, Strupp A, et al. Identification of cyclophilin as a proinflammatory secretory product of lipopolysaccharide-activated macrophages. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89(8): 3511–3515.

[4]Wang L, Wang CH, Jia JF, et al. Contribution of cyclophilin A to the regulation of inflammatory processes in rheumatoid arthritis. J Clin Immunol,2010, 30(1): 24–33.

[5]Billich A, Winkler G, Aschauer H, et al. Presence of cyclophilin A in synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. J Exp Med, 1997, 185(5):975–980.

[6]Tegeder I, Schumacher A, John S, et al. Elevated serum cyclophilin levels in patients with severe sepsis. J Clin Immunol, 1997, 17(5): 380–386.

[7]Coppinger JA, Cagney G, Toomey S, et al.Characterization of the proteins released from activated platelets leads to localization of novel platelet proteins in human atherosclerotic lesions.Blood, 2004, 103(6): 2096–2104.

[8]Kratz A, Harding MW, Craft J, et al. Autoantibodies against cyclophilin in systemic lupus erythematosus and Lyme disease. Clin Exp Immunol, 1992, 90(3):422–427.

[9]Yurchenko V, Pushkarsky T, Li JH, et al. Regulation of CD147 cell surface expression: involvement of the proline residue in the CD147 transmembrane domain.J Biol Chem, 2005, 280: 17013–17019.

[10]Biswas C, Zhang Y, DeCastro R, et al. The human tumor cell-derived collagenase stimulatory factor(renamed EMMPRIN) is a member of the immunoglobulin superfamily. Cancer Res, 1995,55(2): 434–439.

[11]Muramatsu T, Miyauchi T. Basigin (CD147): a multifunctional transmembrane protein involved in reproduction, neural function, inflammation and tumor invasion. Histol Histopathol, 2003, 18(3):981–987.

[12]Yurchenko V, Constant S, Eisenmesser SC, et al.Cyclophilin-CD147 interactions: a new target for anti-inflammatory therapeutics. Clin Exp Immunol,2010, 160(3): 305–317.

[13]Arora K, Gwinn WM, Bower MA, et al. Extracellular cyclophilins contribute to the regulation of inflammatory responses. J Immunol, 2005, 175(1):517–522.

[14]Gwinn WM, Damsker JM, Falahati R, et al. Novel approach to inhibit asthma-mediated lung inflammation using anti-CD147 intervention. J Immunol, 2006, 177(7): 4870–4879.

[15]Song TZ, Yang M, Chen JT, et al. Prognosis of sepsis induced by cecal ligation and puncture in mice improved by anti-Clonorchis sinensiscyclopholin a antibodies. Parasites Vectors, 2015, 8: 502.

[16]Fischer G, Bang H, Mech C. Determination of enzymatic catalysis for the cis-trans-isomerization of peptide binding in proline-containing peptides.Biomed Biochim Acta, 1984, 43(10): 1101–1111 (in German).

[17]Schiene C, Fischer G. Enzymes that catalyse the restructuring of proteins. Curr Opin Struct Biol, 2000,10(1): 40–45.

[18]Bukrinsky MI. Cyclophilins: unexpected messengers in intercellular communications. Trends Immunol,2002, 23(7): 323–325.

[19]Xu Q, Leiva MC, Fischkoff SA, et al. Leukocyte chemotactic activity of cyclophilin. J Biol Chem,1992, 267(17): 11968–11971.

[20]Suzuki J, Jin ZG, Meoli DF, et al. Cyclophilin a is secreted by a vesicular pathway in vascular smooth muscle cells. Circ Res, 2006, 98(6): 811–817.

[21]Yurchenko V, Zybarth G, O’Connor M, et al. Active site residues of cyclophilin A are crucial for its signaling activity via CD147. J Biol Chem, 2002,277(25): 22959–22965.

[22]Pushkarsky T, Yurchenko V, Laborico A, et al. CD147 stimulates HIV-1 infection in a signal-independent fashion. Biochem Biophys Res Commun, 2007,363(3): 495–499.

[23]Pushkarsky T, Zybarth G, Dubrovsky L, et al. CD147 facilitates HIV-1 infection by interacting with virus-associated cyclophilin A. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(11): 6360–6365.

[24]Obchoei S, Wongkhan S, Wongkham C, et al.Cyclophilin A: potential functions and therapeutic target for human cancer. Med Sci Monit, 2009,15(11): RA221–RA232.

[25]Lu YC, Yeh WC, Ohashi PS. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine, 2008, 42(2):145–151.