李敬達(dá)，余承潔，王仁軍，付常振，修志龍，劉慶平

1 大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

2 大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 遼寧省糖脂代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600

近年來，動(dòng)脈粥樣硬化 (Atherosclerosis，AS)所引發(fā)的心腦血管疾病已成為導(dǎo)致人類死亡的主要原因[1-2]。脂類代謝紊亂與慢性炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程中的重要因素[1,3-4]，與其相關(guān)的主要事件包括：血管內(nèi)皮損傷、單核細(xì)胞浸潤(rùn)入內(nèi)皮下轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞、泡沫細(xì)胞的形成、脂質(zhì)沉積、血小板激活、平滑肌細(xì)胞遷移與增生等[2]，其中獨(dú)立致病因子氧化低密度脂蛋白 (Oxidized low density lipoprotein，oxLDL) 所誘發(fā)的巨噬細(xì)胞泡沫化在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了核心作用[3-7]。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的起始階段，單核細(xì)胞趨化而來的巨噬細(xì)胞能夠通過其細(xì)胞膜表面的清道夫受體CD36、SR-AI等，大量吞噬血管內(nèi)膜空間中的oxLDL，并以膽固醇酯的形式存儲(chǔ)于細(xì)胞中。隨著動(dòng)脈粥樣硬化環(huán)境的加深，巨噬細(xì)胞攝取膽固醇的速度逐漸加快，進(jìn)而引起膽固醇在細(xì)胞中的過度積累，最終導(dǎo)致了巨噬細(xì)胞的泡沫化和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[3-7]。

CD36作為巨噬細(xì)胞表面的主要清道夫受體，介導(dǎo)了約70%的oxLDL攝取作用[3-6]。研究顯示，CD36能夠特異性識(shí)別并結(jié)合oxLDL，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的MAPK (Mitogen-activated protein kinase) 信號(hào)傳導(dǎo)，激活JNK、ERK、p38蛋白激酶活性，導(dǎo)致膽固醇過量吞噬攝取以及泡沫細(xì)胞的形成[7-9]。此外，在oxLDL的作用下，CD36還可經(jīng)由蛋白激酶C (Protein kinase C，PKC) 活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)腫瘤壞死因子及白介素-6等炎癥因子的表達(dá)及釋放，最終引發(fā)血管炎癥反應(yīng)并加速了動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[10-13]。

Caveolin-1作為組成脂筏結(jié)構(gòu)的主要蛋白，密切參與了膽固醇的攝取及細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸作用[14-18]。之前的研究結(jié)果表明，在 caveolin-1基因敲除小鼠中，CD36的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，并且停留于細(xì)胞內(nèi)高爾基復(fù)合體中，不能定向作用于細(xì)胞膜，暗示caveolin-1的表達(dá)可能是CD36到達(dá)膜表面發(fā)揮攝取功能所必需的因素[19–20]。為了進(jìn)一步研究CD36在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中的作用及其與caveolin-1的關(guān)系，本文以小鼠巨噬細(xì)胞 J774A.1為研究對(duì)象，通過慢病毒介導(dǎo)的 shRNA干擾技術(shù)構(gòu)建了穩(wěn)定的CD36基因沉默細(xì)胞株，并以此為模型分析了CD36在caveolin-1蛋白表達(dá)過程中的作用，為后續(xù)研究 CD36功能及巨噬細(xì)胞泡沫化的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

小鼠巨噬細(xì)胞 (J774A.1) 和人胚腎細(xì)胞(HEK293T，后文簡(jiǎn)稱 293T) 購(gòu)于美國(guó)組織培養(yǎng)中心；Anti-CD36 (sc-9154) 抗體購(gòu)于美國(guó)圣克魯斯公司；Anti-caveolin-1 (610407) 抗體購(gòu)于 BD生物公司；Anti-ERK1/2(A0229)、Anti-p-ERK1/2(AP0472)、Anti-JNK (A0288) 抗體購(gòu)于ABclonal公司；Anti-β-actin (ab8226)、Anti-p-JNK (ab124956)購(gòu)于 Abcam公司；人源 LDL、DiI-oxLDL及DiI-LDL購(gòu)于北京協(xié)生生物科技有限公司；FITC及HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)于KPL公司；ERK(PD98059) 及JNK (SP600125) 生物學(xué)抑制劑購(gòu)于Calbiochem 公司；psiCHECK?-Ⅱ質(zhì)粒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒及退火緩沖液購(gòu)于Promega公司；pLKO.1慢病毒shRNA表達(dá)載體、慢病毒包裝載體 psPAX2及 PMD2.G購(gòu)于Addgene公司，Lipofectamin 2000、DMEM medium及Opti-MEM medium購(gòu)于Invitrogen公司；RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白預(yù)染marker、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒及 ECL顯色液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；JM109克隆菌，pMD 19-T simple vector，LATaq酶，DNA連接試劑盒，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ、BamHⅠ，DNA marker DL 2000，DNA凝膠回收試劑盒，RT-PCR試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；超濾管、PVDF薄膜、Amp抗生素及常用試劑均購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；PCR引物合成及DNA測(cè)序由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠源CD36的cDNA基因克隆

根據(jù)GenBank提供的小鼠源CD36的cDNA序列，利用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。

上游引物 (引物 1)：5′-CCGCTCGAG ATGG GCTGTGATCGGAACTG-3′。

下游引物 (引物 2)：5′-ATAGTTTAGCGGCC GCGCCAGTGTATATGTAGGCTCATCC-3′。

其中引物 1中 5′端含有保護(hù)堿基 (斜體)、XhoⅠ酶切位點(diǎn) (下劃線) 以及CD36 5′端部分氨基酸編碼基因序列；引物2中5′端含有保護(hù)堿基(斜體)、NotⅠ酶切位點(diǎn) (下劃線) 以及 CD36 3′端部分氨基酸編碼基因的互補(bǔ)序列。

使用Trizol抽提法提取J774A.1細(xì)胞中的總RNA，之后通過RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板，使用引物1、2對(duì)CD36的cDNA基因序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 1 min；98 ℃變性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后再由凝膠回收試劑盒回收目的基因，并連接至pMD19-T simple vector中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)菌，涂布于含有 Ampicillin (50 μg/mL)抗性的LB平板，獲得的菌落進(jìn)行PCR鑒定，并挑選陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank提供的小鼠CD36的cDNA序列比對(duì)，鑒定序列正確后將重組質(zhì)粒命名為pMD19-T-CD36。

1.2.2 psiCHECK-II-CD36重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將含有pMD19-T-CD36及psiCHECK?-Ⅱ質(zhì)粒的 JM109克隆菌分別擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行質(zhì)粒提取，用XhoⅠ、NotⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。切膠回收酶切產(chǎn)物CD36片段和psiCHECK?-Ⅱ載體片段。使用DNA連接試劑盒將二者按照1∶10的摩爾比，16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入 JM109感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后挑選陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，使用XhoⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定連接情況，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為psiCHECK-Ⅱ-CD36。

1.2.3 CD36-shRNA序列設(shè)計(jì)及慢病毒干擾載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中小鼠CD36基因編碼序列 (登錄號(hào)：NM 001159558)，按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則使用Invitrogen公司在線shRNA序列分析設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì) 5對(duì)針對(duì)目的基因的shRNA干擾序列及一對(duì)Scramble shRNA對(duì)照序列 (表 1)。之后通過 BLAST同源性搜索分析，確定干擾序列及對(duì)照序列的特異性，所設(shè)計(jì)的序列由生工生物工程 (上海) 股份有限公司負(fù)責(zé)合成。每對(duì)合成的互補(bǔ) shRNA序列溶于退火緩沖液中，沸水浴5 min后自然冷卻到室溫。之后通過DNA連接試劑盒將退火處理后帶有黏性末端的雙鏈干擾序列與經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的線性化pLKO.1慢病毒載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，挑選陽性克隆，進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序正確后根據(jù)干擾序列靶向位點(diǎn)將重組干擾載體分別命名為 355-shRNA、393-shRNA、992-shRNA、1 325-shRNA、1 329-shRNA及scramble-shRNA。

表1 CD36的shRNA干擾序列設(shè)計(jì)Table 1 The design of shRNA sequences for CD36 gene

1.2.4 有效CD36-shRNA序列的篩選

293T細(xì)胞37 ℃、5% CO2條件下貼壁培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染前24 h，將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的293T細(xì)胞以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中。培養(yǎng)過夜后，待細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%?90%融合度時(shí)，將 5種干擾質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒 (Scramble-shRNA) 分別與 psiCHECK-Ⅱ-CD36質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入 293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染操作方法參照 Lipofectamin 2000 transfection rengent 使用說明書。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒及多功能酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞裂解液中化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。以單獨(dú)轉(zhuǎn)染psiCHECK-Ⅱ-CD36質(zhì)粒作為陰性對(duì)照并規(guī)定干擾效率為零，計(jì)算其他shRNA的干擾效率。

1.2.5 慢病毒的包裝與純化

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜后，待細(xì)胞融合度為 80%?90%時(shí)，參照 Lipofectamin 2000 transfection rengent使用說明書將篩選得到的干擾載體及對(duì)照載體 (Scramble-shRNA) 分別與輔助包裝載體psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染 48 h后，離心收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液。上清液經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾去除細(xì)胞碎片后，使用 100K孔徑的超濾管，4 000 r/min離心30 min對(duì)毒液進(jìn)行濃縮。病毒濃縮液分裝至EP管中，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 慢病毒感染及CD36穩(wěn)定沉默細(xì)胞株的建立

J774A.1細(xì)胞37 ℃、5% CO2條件下貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中 (另外含有100 IU/mL的青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素10 mmol/L碳酸氫鈉和1 mmol/L丙酮酸鈉)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的J774A.1細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h后，棄去孔中原有培養(yǎng)基，向孔中加入1 mL含有溴化己二甲胺 (終濃度8 μg/mL)的培養(yǎng)基及100 μL CD36- shRNA病毒濃縮液 (對(duì)照細(xì)胞組中加入scramble-shRNA病毒濃縮液)。由于所選用的pLKO.1慢病毒干擾載體的骨架中含有嘌呤霉素抗性基因 (載體基因圖譜如圖2所示)，因此病毒感染 12 h后，各孔更換為含有嘌呤霉素抗性(終濃度 3 μg/mL) 的培養(yǎng)基對(duì)被感染細(xì)胞進(jìn)行篩選。此后每隔1 d更換嘌呤霉素抗性培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%–90%融合度時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)瓶中，并使用嘌呤霉素抗性培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)。嘌呤霉素篩選30 d后，采用Western blotting及激光共聚焦顯微鏡對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中CD36基因沉默效果進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 Western blotting分析CD36基因沉默效果

使用RIPA裂解液分別提取三組細(xì)胞 (NCr: 野生型J774A.1細(xì)胞組；shRNACD36: CD36-shRNA慢病毒感染細(xì)胞組；SCr: Scramble-shRNA慢病毒感染細(xì)胞組) 的全蛋白，并用 BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組樣品中總蛋白濃度。以每孔80 μg的蛋白量上樣，12% SDS-PAGE膠對(duì)樣品進(jìn)行電泳分離。轉(zhuǎn)膜、封閉后，抗CD36抗體 (1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，之后室溫條件下孵育山羊抗兔的二抗稀釋液(1∶1 000) 1 h。TBST洗膜后，ECL顯色，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析檢測(cè)結(jié)果。

1.2.8 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞膜表面 CD36基因沉默效果

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 3組細(xì)胞 (野生型J774A.1細(xì)胞組、CD36-shRNA慢病毒感染細(xì)胞組、Scramble-shRNA慢病毒感染細(xì)胞組) 分別以每皿 2.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于激光共聚焦小皿中。培養(yǎng)過夜后，棄去原有培養(yǎng)基，向小皿中央加入200 μL含有DiI-oxLDL或DiI-LDL (終濃度為 20 μg/mL) 的新鮮培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h。PBS清洗細(xì)胞3次后，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，并用1% gelatin與抗CD16/CD32抗體 (1∶100) 的混合液封閉細(xì)胞1 h。PBS洗3次后，加入抗 CD36抗體 (1∶100)。37 ℃孵育2 h后，使用FITC標(biāo)記的抗兔二抗 (1∶100)，37 ℃條件下孵育細(xì)胞1 h。孵育結(jié)束后PBS洗去非特異性結(jié)合的二抗，最后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.9 JNK與EKR的特異性抑制劑對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的J774A.1細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種于六孔板。過夜培養(yǎng)后，使用JNK或EKR 的特異性抑制劑 SP600125 (10 μmol/L)、PD98059 (10 μmol/L) 預(yù)處理細(xì)胞 30 min，之后更換含有oxLDL (終濃度為30 μg/mL) 的新鮮培養(yǎng)基刺激細(xì)胞 12 h。Western blotting檢測(cè)抑制劑對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響情況。

1.2.10 Western blotting檢測(cè)CD36基因沉默對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞 (野生型J774A.1細(xì)胞組、CD36-shRNA慢病毒感染細(xì)胞組、Scramble-shRNA慢病毒感染細(xì)胞組)，以1×106個(gè)/孔的密度接種于六孔板。過夜培養(yǎng)后，將各孔中原有培養(yǎng)基更換為含有相應(yīng)濃度 oxLDL的培養(yǎng)基，進(jìn)行給藥刺激處理 (oxLDL濃度及刺激時(shí)間如結(jié)果圖中所示)。待刺激處理結(jié)束后消化收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，之后對(duì)樣品進(jìn)行 Western blotting檢測(cè)分析。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來自至少3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差 (SE)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)兩組間比較均經(jīng)Student’s-test檢驗(yàn)，**P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠源 CD36的 cDNA基因克隆及psiCHECK-II-CD36重組表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增得到CD36的cDNA基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，其條帶大小與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中一致 (圖 1A)。將 PCR產(chǎn)物回收后連接于pMD19-T simple vector，并送交生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序，使用Sequencher軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示目的片段無突變。

將構(gòu)建成功的 pMD19-T-CD36載體及psiCHECK-Ⅱ載體分別進(jìn)行XhoⅠ、NotⅠ雙酶切，之后將目的基因片段連接至載體酶切片段并轉(zhuǎn)化入JM109克隆菌中，涂布于Ampicillin抗性平板。挑選平板上陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取重組質(zhì)粒進(jìn)行XhoⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)酶切片段大小與預(yù)期一致 (圖1B)，證明 CD36的 cDNA基因片段已克隆至psiCHECK-Ⅱ載體中，獲得 psiCHECK-II-CD36重組表達(dá)載體。

圖1 psiCHECK-II-CD36載體的構(gòu)建Fig. 1 Construction of psiCHECK-II-CD36 vector. (A)Analysis of PCR product of CD36 by agarose gel electrophoresis. M: DL2000 marker; 1: PCR product of CD36 (1 419 bp). (B) Analysis of psiCHECK-II-CD36 vector by restriction enzyme digestion. M: DL2000 marker; 1: psiCHECK-II-CD36 plasmid; 2: digestion of psiCHECK-II-CD36 plasmid by XhoⅠ; 3: digestion of psiCHECK-II-CD36 plasmid by XhoⅠ and NotⅠ.

2.2 CD36-shRNA慢病毒干擾載體的構(gòu)建

將設(shè)計(jì)合成的干擾序列及對(duì)照序列進(jìn)行退火處理，所形成的雙鏈 DNA片段連接至含有嘌呤霉素抗性的 pLKO.1載體中 (圖 2)，并轉(zhuǎn)化入JM109菌株。挑取陽性克隆菌送至生工生物工程(上海) 股份有限公司測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果 (略)顯示插入序列無堿基突變，證明CD36-shRNA慢病毒干擾載體構(gòu)建成功。

2.3 有效CD36-shRNA序列的篩選

由于 J774A.1細(xì)胞為難轉(zhuǎn)染型細(xì)胞，因此很難通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法篩選獲得有效shRNA。為此，本文使用Promega公司的siCHECKTM系統(tǒng)對(duì)shRNA進(jìn)行篩選。該系統(tǒng)的篩選原理是：psiCHECKTM-Ⅱ載體同時(shí)含有螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶報(bào)告基因，當(dāng)目的基因插入到海腎熒光素酶基因下游多克隆位點(diǎn)時(shí)，能夠形成海腎熒光素酶基因與目的基因的融合序列。將含有目的基因的 psiCHECKTM-Ⅱ重組載體與 shRNA干擾載體共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞后，螢火蟲熒光素酶基因及融合序列得以轉(zhuǎn)錄。如果設(shè)計(jì)的shRNA為無效序列，則融合序列中海腎熒光素酶可被翻譯。如果shRNA為有效序列，則能夠啟動(dòng)干擾機(jī)制降解融合序列，導(dǎo)致融合序列中海腎熒光素酶基因無法翻譯，降低海腎熒光素酶的活性，從而達(dá)到篩選有效shRNA的目的 (有關(guān)shRNA篩選的詳細(xì)原理、方法及步驟參照Promega公司siCHECKTM vectors及 Dual-Luciferase?reporter assay system 產(chǎn)品說明書)。本文中將5條CD36-shRNA慢病毒干擾載體及對(duì)照載體分別與psiCHECK-Ⅱ-CD36質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒及多功能酶標(biāo)儀測(cè)定化學(xué)發(fā)光并計(jì)算干擾效率。結(jié)果如圖 3所示，與Blank 對(duì)照 (未經(jīng)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞) 及SCr對(duì)照 (轉(zhuǎn)染scramble-shRNA的293T細(xì)胞) 相比，1 325-shRNA干擾效果最好，CD36的mRNA表達(dá)水平降低了97%，可作為有效CD36基因沉默干擾序列。

圖2 pLKO.1載體基因圖譜Fig. 2 Map of the pLKO.1 vector.

2.4 CD36基因沉默細(xì)胞株的鑒定

使用制備好的 CD36-shRNA及 scrambleshRNA慢病毒顆粒分別感染J774A.1細(xì)胞。之后通過嘌呤霉素篩選出具有抗性的 CD36基因沉默細(xì)胞株及對(duì)照細(xì)胞株 (Scramble-shRNA)，并通過Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中CD36蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖 4A所示，與野生型 J774A.1細(xì)胞 (NCr) 及 scramble-shRNA對(duì)照細(xì)胞 (SCr)相比，CD36基因沉默細(xì)胞 (shCD36) 中CD36蛋白表達(dá)水平大幅降低。進(jìn)一步的激光共聚焦結(jié)果顯示 (圖 4B)，基因沉默細(xì)胞株細(xì)胞膜表面上的CD36 (綠色) 及結(jié)合的DiI-oxLDL (紅色) 含量較野生型J774A.1細(xì)胞及scramble- shRNA對(duì)照細(xì)胞明顯減少，并且隨著CD36的基因沉默，與CD36相結(jié)合的DiI-oxLDL (黃色) 的數(shù)量也大幅降低。上述結(jié)果表明成功構(gòu)建了具有生物學(xué)活性的CD36基因沉默巨噬細(xì)胞株。

2.5 oxLDL刺激作用對(duì) caveolin-1蛋白表達(dá)的影響

圖3 有效shRNA的篩選Fig. 3 The screening of efficient shRNA. ** P<0.01 versus the Blank control group.

圖4 CD36基因沉默效率分析Fig. 4 CD36 silencing efficiency assays. (A) The CD36 silencing efficiency assays by Western blotting (NCr: wild J774A.1 cells; SCr: scramble-shRNA infection control; shCD36: CD36-shRNA infection control, **P<0.01 versus the SCr control group). (B) The CD36 silencing efficiency assays by confocal microscopy.

Caveolin-1作為脂筏結(jié)構(gòu)中的主要蛋白，在巨噬細(xì)胞對(duì) oxLDL的攝取及細(xì)胞內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[14-18]。研究顯示，在巨噬細(xì)胞中caveolin-1的蛋白表達(dá)受MAPK蛋白激酶家族成員 JNK及 ERK的調(diào)控[21]。本文以J774A.1巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察了oxLDL的刺激作用對(duì)巨噬細(xì)胞caveolin-1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果如圖 5A–B所示，在不同濃度及不同時(shí)間的oxLDL刺激下，J774A.1巨噬細(xì)胞中 caveolin-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，且上調(diào)作用呈濃度及作用時(shí)間依賴性。當(dāng)使用30 μg/mL oxLDL刺激細(xì)胞12 h后，caveolin-1的蛋白表達(dá)水平達(dá)到頂峰，較未刺激組升高3.25倍 (**P<0.01)。此外，oxLDL的刺激作用能夠明顯上調(diào)蛋白激酶JNK及ERK的磷酸化水平 (圖 6A)。進(jìn)一步的抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用SP600125 (JNK) 與PD98059 (ERK) 抑制劑預(yù)處理 J774A.1細(xì)胞能夠顯著抑制 oxLDL誘導(dǎo)的caveolin-1蛋白表達(dá)上調(diào)作用 (圖6B)。與對(duì)照組相比，SP600125組、PD98059組及聯(lián)合處理組的caveolin-1蛋白表達(dá)分別下調(diào)了60%、45%和70% (**P<0.01)。以上結(jié)果表明oxLDL能夠通過JNK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)caveolin-1的表達(dá)。

2.6 CD36基因沉默對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步研究CD36基因沉默對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響，我們使用30 μg/mL oxLDL分別刺激野生型J774A.1細(xì)胞 (NCr)、scramble-shRNA對(duì)照細(xì)胞 (SCr) 及 CD36沉默細(xì)胞 (shCD36)12 h。Western blotting 結(jié)果顯示 (圖 7A)，CD36的基因沉默能夠顯著性抑制 oxLDL誘導(dǎo)的caveolin-1蛋白表達(dá)。與 NCr對(duì)照組 (野生型J774A.1細(xì)胞) 及 SCr對(duì)照組 (Scramble-shRNA感染細(xì)胞) 相比，CD36基因沉默細(xì)胞中 oxLDL誘導(dǎo)的 caveolin-1蛋白表達(dá)降低了 70%(**P<0.01)。此外，使用30 μg/mL oxLDL分別刺激處理各組細(xì)胞30 min后發(fā)現(xiàn)，CD36的基因沉默能夠明顯抑制oxLDL誘導(dǎo)的MAPK蛋白激酶JNK及ERK的磷酸化作用 (圖7B)。以上結(jié)果表明，在oxLDL的刺激作用下，CD36能夠激活巨噬細(xì)胞內(nèi)MAPK蛋白激酶JNK及ERK的磷酸化，從而上調(diào)了caveolin-1的蛋白表達(dá)。

圖5 oxLDL濃度及時(shí)間梯度作用對(duì)caveolin-1蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 The dose-dependent and time-dependent effects of oxLDL in caveolin-1 protein expression. (A) The dose-dependent effect of oxLDL in caveolin-1 protein expression. (B) The time-dependent effects of oxLDL in caveolin-1 protein expression (** P<0.01 versus the untreated group).

圖6 oxLDL經(jīng)由JNK及ERK信號(hào)通路上調(diào)caveolin-1的蛋白表達(dá)Fig. 6 oxLDL upregulate caveolin-1 protein expression through the JNK/ERK-mediated signal pathway. (A) oxLDL upregulate the phosphorylation level of JNK and ERK. (B) The effects of the inhibitors for JNK and ERK in caveolin-1 protein expression (** P<0.01 versus the untreated control group).

圖7 CD36經(jīng)由JNK/ERK信號(hào)通路調(diào)控caveolin-1的蛋白表達(dá)Fig. 7 CD36 modulates the caveolin-1 protein expression through the JNK/ERK-mediated signal pathway. (A) The effect of CD36 in the oxLDL-induced caveolin-1 protein expression. (B) The effect of CD36 in the oxLDL-induced JNK and ERK phosphorylation (NCr: wild J774A.1 cells; SCr: scramble-shRNA infection control; shCD36: CD36-shRNA infection control; Blank: the CD36-shRNA infection cell without oxLDL stimulation, **P<0.01 versus the SCr control group).

3 討論

巨噬細(xì)胞的泡沫化是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，目前認(rèn)為巨噬細(xì)胞泡沫化的主要機(jī)制包括：膽固醇攝入過多，細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)異常、膽固醇過度堆積和膽固醇流出受阻等[4-6]。清道夫受體CD36密切參與了巨噬細(xì)胞的泡沫化過程，貢獻(xiàn)了大約60%?70%的膽固醇酯聚集[3-6]。Rahaman等的研究結(jié)果顯示，CD36能夠啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，活化蛋白激酶JNK及ERK，促進(jìn)膽固醇的攝入作用[7-8]。此外，CD36還能夠通過PKC及p38等蛋白激酶激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ (Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ) 的轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)膽固醇?；D(zhuǎn)移酶 1(Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase 1，ACAT1)及自身的蛋白表達(dá)，加速了膽固醇的脂化及積累作用，最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞泡沫化的形成[1,4]。綜上所述，CD36所介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

Caveolin-1作為構(gòu)成脂筏結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵蛋白，協(xié)同參與了 CD36介導(dǎo)的膽固醇攝取過程。研究發(fā)現(xiàn)，CD36受體蛋白在細(xì)胞膜表面主要定位于由caveolin-1參與組成的胞膜窖 (Caveolea) 結(jié)構(gòu)中，而caveolin-1的基因沉默能夠顯著阻止CD36由高爾基復(fù)合體向細(xì)胞膜的運(yùn)輸作用，進(jìn)而抑制了由CD36介導(dǎo)的膽固醇攝取作用及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)的發(fā)生[20,22]。同時(shí)，在 caveolin-1基因敲除小鼠中，動(dòng)脈粥樣硬化的程度明顯減弱，表明caveolin-1的表達(dá)能夠明顯促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[19]。

巨噬細(xì)胞中 caveolin-1的蛋白表達(dá)受 MPAK蛋白激酶JNK及ERK的調(diào)節(jié)[21]，而CD36能夠調(diào)節(jié) JNK與 ERK的活性，暗示 CD36受體與caveolin-1的蛋白表達(dá)可能存在著密切的調(diào)控關(guān)系。為了進(jìn)一步研究 CD36的功能及其在調(diào)控caveolin-1蛋白表達(dá)過程中的作用，我們構(gòu)建了CD36基因沉默巨噬細(xì)胞模型。由于J774A.1巨噬細(xì)胞為難轉(zhuǎn)染型細(xì)胞，因此通過普通的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)很難獲得高效穩(wěn)定的基因沉默細(xì)胞株。鑒于慢病毒系統(tǒng)在應(yīng)用過程中的優(yōu)勢(shì)，本文選擇使用慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)進(jìn)行CD36基因沉默細(xì)胞模型的構(gòu)建。首先我們?cè)O(shè)計(jì)合成了5條針對(duì)CD36的shRNA干擾序列，并將其構(gòu)建入慢病毒干擾載體中，之后使用 Promega公司的siCHECKTM系統(tǒng)篩選得到有效的 CD36-shRNA干擾序列。將慢病毒干擾載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，包裝得到慢病毒顆粒。慢病毒感染 J774A.1細(xì)胞后，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定的CD36基因沉默細(xì)胞株。Western blotting檢測(cè)證實(shí)CD36基因沉默細(xì)胞株中 CD36的干擾效率可達(dá)90%，進(jìn)一步的激光共聚焦結(jié)果顯示，基因沉默細(xì)胞株表面上的 CD36含量顯著減少，并且隨著CD36的基因沉默，與之相結(jié)合的DiI-oxLDL數(shù)量也大幅降低，證明構(gòu)建得到的 CD36基因沉默巨噬細(xì)胞株具有良好的生物學(xué)活性。之后我們以此為平臺(tái)研究了CD36在caveolin-1蛋白表達(dá)過程中的作用。我們的結(jié)果顯示，CD36的基因沉默顯著降低caveolin-1上游的MAPK蛋白激酶JNK及ERK的磷酸化水平，進(jìn)而抑制了caveolin-1的蛋白表達(dá)，證明CD36能夠經(jīng)由JNK及EKR信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié) caveolin-1的蛋白表達(dá)。考慮到caveolin-1在巨噬細(xì)胞泡沫化過程中的促進(jìn)作用，結(jié)合本研究的結(jié)果，我們推測(cè) CD36作為巨噬細(xì)胞表面重要的受體分子，除能夠直接參與oxLDL的攝取作用外，還可通過啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)MAPK細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào) caveolin-1的蛋白表達(dá)，進(jìn)一步加速細(xì)胞泡沫化的進(jìn)程。本研究首次揭示了 CD36在oxLDL誘導(dǎo)的caveolin-1蛋白表達(dá)過程中的作用，為全面了解巨噬細(xì)胞脂代謝通路以及今后以此為靶點(diǎn)研究治療動(dòng)脈粥樣硬化的策略奠定了理論基礎(chǔ)。

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