高波，沈丹，陳才，王賽賽，楊昆侖，陳偉，王偉，張麗，宋成義

揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009

轉(zhuǎn)座子是一類具有遷移特性的可移動遺傳因子，又稱轉(zhuǎn)座因子 (Transposable element，TE)，屬于散在重復(fù)序列的一種，也是在染色體上可移位和自主復(fù)制的基本單位，其本質(zhì)是具有不同結(jié)構(gòu)和換位機(jī)制的移動基因序列[1]。轉(zhuǎn)座子幾乎存在于所有生物基因組中，依據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)制的不同，可以分為兩大類：RNA轉(zhuǎn)座子 (Ⅰ類轉(zhuǎn)座子，也稱為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子) 和 DNA 轉(zhuǎn)座子 (Ⅱ類轉(zhuǎn)座子)。RNA轉(zhuǎn)座子通過 RNA聚合酶Ⅱ先轉(zhuǎn)錄為mRNA，然后在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后再在整合酶的作用下插入到基因組的新位置。這類轉(zhuǎn)座子完成轉(zhuǎn)座后，在其供體位點保留有原始模板。而DNA轉(zhuǎn)座子則是通過“剪切和粘貼”等機(jī)制來轉(zhuǎn)座，不通過RNA媒介，具體過程為：在DNA轉(zhuǎn)座酶的作用下，識別DNA轉(zhuǎn)座子側(cè)翼區(qū)反向重復(fù)序列，直接將轉(zhuǎn)座子供體位點切割，形成突觸復(fù)合物 (Synaptic complex formation，SCF)，然后再在轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)下整合到基因組的新位點。轉(zhuǎn)座子根據(jù)能否獨立行使轉(zhuǎn)座功能，分為自主轉(zhuǎn)座子和非自主轉(zhuǎn)座子。自主轉(zhuǎn)座子一般含有完整的轉(zhuǎn)座酶編碼框和必要的轉(zhuǎn)座元件，而非自主轉(zhuǎn)座子一般沒有轉(zhuǎn)座酶編碼框或者轉(zhuǎn)座酶編碼框不完整，非自主轉(zhuǎn)座子可以通過自主轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)座[1-3]。隨著測序技術(shù)不斷發(fā)展，越來越多物種基因組測序完成，對這些基因組注釋表明轉(zhuǎn)座子是基因組進(jìn)化的重要因素，影響基因組大小和結(jié)構(gòu)變異等[4]。轉(zhuǎn)座子的注釋已成為后基因組時代重要的研究熱點，現(xiàn)在也稱為轉(zhuǎn)座組 (Mobilome)[5]。研究表明轉(zhuǎn)座子在不同物種中分布存在較大差異，轉(zhuǎn)座子占人基因組的45%[6]，鼠基因組的 40%[7]，鳥類基因組的 7%–9%[8-9]，在部分植物中轉(zhuǎn)座子所占比例更高，如小麥基因組中達(dá)到的80%[10]，玉米基因組中達(dá)到85%[11]。且研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座組大小與基因組的大小具有強正相關(guān)性[12-13]，相近物種間的基因組差異常常是由轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增差異導(dǎo)致[14-15]。

魚類是脊椎動物所有綱中最原始的物種，在實驗和進(jìn)化研究中有重要的參考價值，其中硬骨魚類遺傳多樣性最高，在非常相近的種系間，其基因組差異很大[16-17]，但目前對硬骨魚類基因組大小差異原因了解較少。本研究通過生物信息學(xué)手段對在Ensemble數(shù)據(jù)庫能夠獲得基因組序列的9種硬骨魚類 (斑馬魚、青鳉、三刺魚、金娃娃、矛尾魚、紅鰭東方鲀、花斑劍尾魚、羅非魚和大西洋鱈) 轉(zhuǎn)座組進(jìn)行注釋，以期揭示轉(zhuǎn)座組在硬骨魚類中的分布特性，及其對基因組變異和進(jìn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 基因組和已知重復(fù)序列庫數(shù)據(jù)來源

9種硬骨魚類包括大西洋鱈魚 (Cod，Gadusmorhua，gadMor1)、矛尾魚 (Coelacanth，Latimeria chalumnae，LatCha1)、紅鰭東方鲀 (Fugu，Takifugu rubripes，F(xiàn)UGU 4.0)、青鳉 (Medaka，Oryzias latipes，HdrR)、花斑劍尾魚 (Platyfish，Xiphophorus maculatus，Xipmac4.4.2)、三刺魚(Stickleback，Gasterosteus aculeatus，BROAD S1)、金娃娃 (Tetraodon，Tetraodon nigroviridis，TETRAODON 8.0)、羅非魚 (Tilapia，Oreochromis niloticus，Orenil1.0)、斑馬魚 (Zebrafish，Danio rerio，GRCz10) 基因組序列來自Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://www.ensembl.org/)。9種硬骨魚類中已知重復(fù)序列庫來自 GIRI的 Repbase數(shù)據(jù)庫 (http://girinst.org/server/RepBase/index.php)，9種硬骨魚類進(jìn)化樹由在線程序phyloT (http://phylot.biobyte.de/index.html) 產(chǎn)生。

1.2 基因組未知重復(fù)序列庫一致序列的獲得

利用RepeatModeler (http://repeatmasker.org/RepeatModeler.html) 對 9種硬骨魚類的未知重復(fù)序列進(jìn)行從頭注釋，獲得新一致序列，RepeatModeler主要由 RepeatScout和 RECON兩個核心程序組成，可以對基因組上轉(zhuǎn)座子的進(jìn)行從頭預(yù)測，以獲得未知的重復(fù)序列。

1.3 重復(fù)序列參考庫構(gòu)建

將各物種 Repbase數(shù)據(jù)庫的已知重復(fù)序列庫和利用 RepeatModeler獲得的未知重復(fù)序列進(jìn)行合并，去除冗余，構(gòu)建重復(fù)序列參考庫。去除冗余根據(jù)80-80-80規(guī)則進(jìn)行[18]，即如果兩個轉(zhuǎn)座子的序列滿足以下3個條件，則兩個重復(fù)序列可以被劃為同一個家族：1) 重復(fù)序列有 80%的相似度；2) 重復(fù)序列長度有 80%的重疊；3) 重復(fù)序列之間重疊部分至少80 bp長度。

1.4 基因組轉(zhuǎn)座組注釋

以構(gòu)建的重復(fù)序列參考庫為基礎(chǔ)，利用本地RepeatMasker程序[19](http://repeatmasker.org/) 對各物種的轉(zhuǎn)座組進(jìn)行注釋，其運行參數(shù)為：-cutoff 225 -w -s -gccalc -no_is。

2 結(jié)果與分析

2.1 9種硬骨魚轉(zhuǎn)座組大小和構(gòu)成比較

通過RepeatMasker程序注釋表明9種硬骨魚類轉(zhuǎn)座組大小和構(gòu)成差異顯著 (表 1)。9種硬骨魚類轉(zhuǎn)座組含量從高到低分別為斑馬魚(54.96%)、矛尾魚 (41.69%)、青鳉魚 (26.68%)、羅非魚 (25.25%)、花斑劍尾魚 (18.20%)、大西洋鱈魚 (14.08%)、三刺魚 (12.82%)、金娃娃 (5.89%)和紅鰭東方鲀 (2.94%)。斑馬魚和矛尾魚基因組中轉(zhuǎn)座組含量較高，約占基因組大小的一半，與哺乳動物基因組轉(zhuǎn)座組含量相近。矛尾魚中的轉(zhuǎn)座組含量雖然較高，但其中多數(shù)仍為未知轉(zhuǎn)座子序列，占到整個基因組的26.23%。金娃娃和紅鰭東方鲀，轉(zhuǎn)座組含量較低 (<10%)，其他幾種魚轉(zhuǎn)座組含量在10%–30% (表1)。通過將基因組大小和轉(zhuǎn)座子含量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在硬骨魚類中轉(zhuǎn)座子含量和基因組大小具有較強的線性相關(guān)(圖1)，相關(guān)系數(shù)r=0.743P=0.022，達(dá)顯著水平。在進(jìn)化上，親緣關(guān)系、基因組大小和轉(zhuǎn)座組大小大體呈現(xiàn)一致性，基因組和轉(zhuǎn)座組較小的幾個物種其親緣關(guān)系也較近，如金娃娃、三刺魚和紅鰭東方鲀，而與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的斑馬魚、矛尾魚基因組和轉(zhuǎn)座組含量均較大 (圖1和圖2)。其中Ⅱ類 (DNA轉(zhuǎn)座子) 轉(zhuǎn)座子含量差異是9種硬骨魚類轉(zhuǎn)座組含量差異的主要決定因素。斑馬魚DNA轉(zhuǎn)座子含量最高 (38.37%)，羅非魚、青鳉和花斑劍尾魚分別占到11.22%、8.9%和8.38%，其他6種硬骨魚中則不到5%。Ⅰ類轉(zhuǎn)座子 (RNA轉(zhuǎn)座子) 在9種魚中分布也有明顯差異 (12.73%–0.99%)，在矛尾魚和斑馬魚基因組中比例較大，而在基因組較小的金娃娃、羅非魚及紅鰭東方鲀中占比例較小。在硬骨魚類基因組中 SINE轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增最弱，其含量在 7種硬骨魚類基因組 (金娃娃、紅鰭東方鲀、大西洋鱈、青鳉、花斑劍尾魚、三刺魚、羅非魚) 中低于1%，僅在斑馬魚和矛尾魚中較高，分別為3.28%和5.64%。LINE轉(zhuǎn)座子占硬骨魚類基因組的 0.53%–5.75%，顯著低于哺乳動物基因組。LTR轉(zhuǎn)座子除了在斑馬魚和三刺魚中含量達(dá)到 5.58%和 2.51%，在大多硬骨魚類基因組中的含量也比較低，其基因組含量不超過2%。矛尾魚的RNA轉(zhuǎn)座子顯著多于DNA轉(zhuǎn)座子，而紅鰭東方鲀、三刺魚和金娃娃的RNA轉(zhuǎn)座子略高于DNA轉(zhuǎn)座子；斑馬魚、青鳉魚、大西洋鱈魚、羅非魚和花斑劍尾魚的 DNA轉(zhuǎn)座子顯著高于RNA轉(zhuǎn)座子。

表1 9種硬骨魚類轉(zhuǎn)座組注釋 (占基因組比重, %)Table 1 The annotation of mobilome in nine teleost (genome coverage, %)

圖1 轉(zhuǎn)座組比重與基因組大小關(guān)聯(lián)Fig. 1 The correlation between the percentage of mobilome and genome size.

2.2 DNA轉(zhuǎn)座子在硬骨魚類中的分布

轉(zhuǎn)座組注釋表明 DNA轉(zhuǎn)座子在9種硬骨魚類呈現(xiàn)很高的多樣性，共有22個超家族分布，其中大西洋鱈魚、斑馬魚、羅非魚、青鳉、三刺魚和花斑劍尾魚基因組中DNA轉(zhuǎn)座子超家族較多，分別含17、16、16、14、14和13個超家族，而紅鰭東方鲀、矛尾魚和金娃娃略少，分別發(fā)現(xiàn)5、9和8個超家族 (表2)。hAT和Tc/Mariner超家族是硬骨魚類主要的 DNA轉(zhuǎn)座子。hAT超家族是DNA轉(zhuǎn)座子中含量最豐富且最具多樣性的，其在斑馬魚、羅非魚、三刺魚、花斑劍尾魚、青鳉、矛尾魚和大西洋鱈魚基因組中分別占11.14%、3.10%、1.88%、2.61%、3.64%、1.28%和1.33%，而在紅鰭東方鲀 (0.23%) 和金娃娃 (0.62%) 中含量較低 (表2)。Tc1/Mariner超家族是硬骨魚基因組中第二豐富的 DNA轉(zhuǎn)座子，在斑馬魚、羅非魚、花斑劍尾魚和青鳉中分別占測序基因組的5.6%、4.48%、4.25%及2.3%，在紅鰭東方鲀 (0.20%)、三刺魚 (0.74%)、金娃娃 (0.43%)、矛尾魚 (0.28%)和大西洋鱈魚 (0.18%) 中含量較低。在大西洋鱈魚、羅非魚、矛尾魚基因組中發(fā)現(xiàn) Novosib超家族轉(zhuǎn)座子，且在大西洋鱈魚 (1.14%) 中占據(jù)較高比例，而在其他硬骨魚類中沒有發(fā)現(xiàn)。另外，CMC-EnSpm、PIF、MULE-MuDR、Kolobok和PiggyBac等轉(zhuǎn)座子也出現(xiàn)在硬骨魚DNA轉(zhuǎn)座子中，且有些 (CMC-EnSpm和PIF-Harbinger) 在斑馬魚基因組中含量比較高 (表2)。

圖2 9種硬骨魚類進(jìn)化樹Fig. 2 The polygenetic tree of 9 teleost.

2.3 RNA轉(zhuǎn)座子在硬骨魚類中的分布

基因組注釋結(jié)果表明 RNA轉(zhuǎn)座子 (LINE、LTR和 SINE) 在 9種硬骨魚類呈現(xiàn)不同分布特點。其中LINE和LTR轉(zhuǎn)座子在9種硬骨魚類中也呈現(xiàn)出很高的多樣性。LINE類轉(zhuǎn)座子中共有14個超家族分布 (表3)。這些LINE超家族在9種硬骨魚類基因組中呈現(xiàn)不同程度的擴(kuò)增，其中L1、L2、RTE和Rex-Babar轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增最為明顯，尤其是 L2超家族，在羅非魚 (1.96%)、矛尾魚(1.73%)、青鳉 (1.52%)、三刺魚 (1.27%) 和斑馬魚基因組 (1.72%) 組成中都超過 1%；RTE組在青鳉基因組中擴(kuò)增最為豐富，達(dá)到0.86%；而Rex組在三刺魚、金娃娃和羅非魚基因組中擴(kuò)增明顯，分別達(dá)到 0.66%、0.67%和 0.86。Proto2、CR1、Dong-R4、Jockey、R1、DRE和 TAD1等僅在個別魚類中被檢測出來，且基因組含量也較小(0.01%–0.08%)，但CR1在矛尾魚擴(kuò)增達(dá)到2.16%。R1和DRE只分布在青鳉中，而TAD1只分布在花斑劍尾魚中。LTR類轉(zhuǎn)座子共有6類超家族分布 (Copia、DIRS、ERV、Gypsy、Ngaro和 Pao)，其中擴(kuò)增最為明顯的是Gypsy，在青鳉、羅非魚、大西洋鱈魚、三刺魚和斑馬魚中分別達(dá)到0.70%、0.0.47%、0.47%、1.57%和 1.80%。DIRS在矛尾魚 (1.00%) 和斑馬魚 (1.30%) 中有一定程度的擴(kuò)增，而在花斑劍尾魚 (0.01%)、三刺魚 (0.02%)、金娃娃 (0.05%) 和紅鰭東方鲀 (0.00%)中擴(kuò)增很弱。ERV在大多硬骨魚類基因組中豐度較低(<0.50%)，其中三刺魚 (0.52%) 和斑馬魚 (0.47%)基因組中 ERV轉(zhuǎn)座子含量高于大西洋鱈魚(0.10%)、矛尾魚 (0.07%) 及青鳉 (0.07%)，而在花斑劍尾魚中未檢測到ERV分布。Ngaro、Copia和Pao超家族轉(zhuǎn)座子在硬骨魚類基因組中含量較少，Copia超家族在各魚類基因組中都不超過0.1%。SINE中tRNA、5S和MIR三個超家族在部分硬骨魚類中有一定程度擴(kuò)增。其中 tRNA超家族在矛尾魚 (4.09%) 和斑馬魚 (2.57%) 基因組中有明顯擴(kuò)增，5S超家族在矛尾魚 (1.48%) 中有明顯擴(kuò)增，其他超家族成員占基因組的含量均很低 (<0.50%)。

表2 DNA轉(zhuǎn)座子在9種硬骨魚類基因組中分布（拷貝數(shù)/（占基因組比重，%））Table2 The istributiong of DNA transposons in nine teleost(copy number/（genome coverage,%）)

表3 RNA轉(zhuǎn)座子在9種硬骨魚類基因組中分布（拷貝數(shù)/（占基因組比重，%））Table3 The distribution of RNA transposons in nine teleost(copy number/（genome coverage,%）)

3 討論

通過RepeatMasker注釋，本研究獲得了9種硬骨魚類的轉(zhuǎn)座組數(shù)據(jù)。不同于其他脊椎動物，硬骨魚基因組中轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)張呈現(xiàn)很大的差異性(2.94%–54.96%)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過脊椎動物中的哺乳動物 (36%–52%)[6-7,20-22]、蠑螈 (25%–48%)[23]或鳥類等物種間的差異 (7%–9%)[8-9]。本研究中斑馬魚的轉(zhuǎn)座組占基因組的比例 (54.96%) 與先前的報道 (51.83%) 相似[24]，與哺乳動物轉(zhuǎn)座子比例相近，高于目前大多數(shù)報道的脊椎動物，如鯉魚(31.3%)[25]、蜥蜴 (34.4%)[26]、青蛙 (34.5%)[27]和鳥類 (7%–9%)[9,28]。本研究所注釋紅鰭東方鲀轉(zhuǎn)座組 (2.94%) 與先前的報道相近 (2.7%)[29]。大西洋鱈魚轉(zhuǎn)座組注釋結(jié)果 (14.08%) 也與前期注釋 (12.31%) 相近[30]，而本研究其他大部分轉(zhuǎn)座組注釋結(jié)果均高于前期注釋，如矛尾魚 (41.69% vs 25%)[31]、花斑劍尾魚(18.5% vs 5%)[32]、羅非魚(25.25% vs 14%)[33]、青鳉(26.68% vs 16.2%)[34]、金娃娃(5.89% vs <1%)[35]。造成這種差異的主要原因是之前組裝的基因組數(shù)據(jù)與重復(fù)序列庫數(shù)據(jù)不完整，特別是早期重復(fù)序列庫數(shù)據(jù)缺乏，導(dǎo)致轉(zhuǎn)座組比重被嚴(yán)重低估。本研究中三刺魚所注釋轉(zhuǎn)座組的覆蓋率 (12.82%) 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于先前的估量(25.2%)[36]，由于文獻(xiàn)中沒有提供注釋的方法，所以差異的原因并不清楚。

研究表明遺傳關(guān)系相近的物種之間基因組大小差異可歸因于轉(zhuǎn)座子積累程度不同[14-15]，本研究對硬骨魚的轉(zhuǎn)座子注釋進(jìn)一步證實了這一理論。在9個硬骨魚中預(yù)測出的轉(zhuǎn)座子比重和基因組大小呈正相關(guān)，且與進(jìn)化上的親緣關(guān)系相一致，如最小基因組紅鰭東方鲀轉(zhuǎn)座子比例為 5.89%，而最大基因組斑馬魚的轉(zhuǎn)座組則高達(dá)54.96%，轉(zhuǎn)座組差異主要是由 DNA轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增量不同導(dǎo)致。以 DNA轉(zhuǎn)座子為主的轉(zhuǎn)座子的不同擴(kuò)增量是促成硬骨魚基因組大小差異的主要分子機(jī)制。這與兩棲類相似[26-27]，但與多數(shù)哺乳動物和爬行動物的相反。哺乳動物和爬行動物的基因組擴(kuò)張主要取決于LTR或非LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[6-7,20-22]。本文為從轉(zhuǎn)座子角度揭示物種進(jìn)化提供參考。

相比于哺乳動物和鳥類，硬骨魚基因組含有多種Ⅰ類和Ⅱ轉(zhuǎn)座子，并且擁有大量進(jìn)化分支、超家族和家族[12]，本研究顯示9個硬骨魚類基因組中轉(zhuǎn)座組分布差異明顯。雖然 DNA轉(zhuǎn)座子是引起轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增差異的主要力量，但基因組中轉(zhuǎn)座子的差異不僅僅局限于擴(kuò)增量的不同。轉(zhuǎn)座子的多樣性在不同硬骨魚類基因組中也存在較大差異，在較大的轉(zhuǎn)座組物種中如斑馬魚、大西洋鱈魚、青鳉，其轉(zhuǎn)座子多樣性也較高，這也是造成硬骨魚基因組的差異原因之一。在硬骨魚中，轉(zhuǎn)座子在超家族水平上呈現(xiàn)出較大的差異，和較大的基因組相比，較小的基因組含有較低多樣性，這與在蜥蜴中的結(jié)果相一致[23]。目前關(guān)于脊椎動物基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座子多樣性和活性差異原因的了解仍然非常有限，有學(xué)者認(rèn)為這可能是由于抑制轉(zhuǎn)座子活性的宿主防御機(jī)制差異導(dǎo)致的[37]。

4 結(jié)論

本研究對9種硬骨魚類轉(zhuǎn)座組進(jìn)行了全面系統(tǒng)的注釋，分析結(jié)果顯示，硬骨魚基因組中轉(zhuǎn)座子多樣性豐富，轉(zhuǎn)座子在基因組中的分布比例差異很大，尤其是 DNA轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)座組差異與硬骨魚基因組大小有很強的相關(guān)，轉(zhuǎn)座組是決定硬骨魚基因組大小的重要因素。

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