繆 欣，丁 嵐，劉 浩，李曉敏，徐 聰，賈筱琴，李國利

1.揚州大學醫(yī)學院病理學教研室，江蘇 揚州 225009；

2.揚州市江都人民醫(yī)院病理科，江蘇 揚州225000

微小RNA(microRNA，miRNA)長度一般為18～25個核苷酸，廣泛存在于真核生物中，屬于高度保守與非編碼的小分子單鏈RNA的一種。miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，直接或間接參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展。成熟的miR-16來源于兩個不同的前體miR-16-1和miR-16-2。miR-16-1位于人類基因組脆弱點11q24，同時也是秀麗線蟲lin-4的同源基因，在人類卵巢癌、子宮癌、乳腺癌和肺癌患者體內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)此位點基因的缺失突變。課題組前期研究應用miRNA芯片技術篩選出肝癌組織差異表達miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-16在肝癌組織中表達下調(diào)。推測出現(xiàn)miR-16表達的下調(diào)可能與腫瘤細胞的快速增殖有關。本實驗初步探討miR-16對BEL-7402肝癌細胞的增殖及凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人BEL-7402肝癌細胞及293T細胞購自上海酶研生物科技有限公司；RPMI-1640及DMEM購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，凋亡試劑盒購自美國eBioscience公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

配制含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，接種人BEL-7402肝癌細胞株，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁生長，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 過表達miR-16慢病毒穩(wěn)定細胞株的建立

將慢病毒載體質(zhì)粒(LV-hsa-miR-16-1)和包裝質(zhì)?；旌衔?Lenti-Easy Packaging Mix)混合，在混合后的物質(zhì)中加入脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)，形成脂質(zhì)體復合物(DNA-LipofectamineTM2000復合物)，加入293T細胞(要求293T細胞的細胞密度在80%左右，并處于對數(shù)生長期、已進行共轉染)，將集中的細胞混勻，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。轉染8 h后，將培養(yǎng)液更換為DMEM細胞培養(yǎng)基(含胎牛血清10%)，培養(yǎng)48～72 h后，收集慢病毒顆粒的細胞上清液，將搜集到的上清液進行濃縮與純化處理，可得到滴度與純度均較高的慢病毒濃縮液，轉染293T細胞后進行病毒滴度測定。

1.2.3 慢病毒感染人BEL-7402肝癌細胞

感染前24 h，取對數(shù)生長期的BEL-7402肝癌細胞，胰酶消化制成細胞懸液，計數(shù)調(diào)整細胞的濃度，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到30%左右時停止。根據(jù)BEL-7402肝癌細胞的MOI值，加入適量的濃縮病毒液，感染16 h后，更換培養(yǎng)基；感染96 h后，采用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光的強度，檢測慢病毒顆粒的感染效率。

1.2.4 采用細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)檢測細胞增殖

選擇對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后培養(yǎng)基重懸制成細胞懸液。使用血球計數(shù)板計數(shù)細胞，以每孔2 000個細胞的標準，于96孔板中進行細胞接種。實驗分為miR-16感染組和陰性對照組，每組5個復孔，每孔100 μL，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)0、1、2、3、4和5 d后，每孔加入10 μL CCK-8，2～4 h后，振蕩器振蕩5～10 min，酶標儀450 nm進行吸光度(D)值檢測，以各時間點的D值為依據(jù)，繪制出詳細的細胞生長曲線圖。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞周期

確保細胞還未進入生長平臺期時，選擇生長覆蓋率在80%左右的細胞進行試驗，收集轉染48 h的人BEL-7402肝癌細胞，PBS洗滌，細胞濃度調(diào)整為1×106/mL，使用70%的乙醇進行固定，加入36 μL的PI(2 mg/mL)、14.5 μL的RNase(10 mg/mL)及1 450 μL的PBS重懸，室溫避光溫育10 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集人BEL-7402肝癌細胞，將細胞濃度調(diào)整為1×106/mL，加入10 μL的annexin V-PE進行細胞染色，室溫避光10～15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0軟件對本次研究中的數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計，實驗數(shù)據(jù)為計量資料，用x±s表示，采用t檢驗對組間差別進行檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 過表達miR-16慢病毒穩(wěn)定細胞株

目的質(zhì)粒轉染293T細胞熒光顯微鏡觀察結果見圖1。過表達miR-16慢病毒BEL-7402肝癌細胞穩(wěn)定株熒光顯微鏡下觀察結果見圖2。

2.2 感染miR-16慢病毒對BEL-7402肝癌細胞增殖能力的影響

miR-16慢病毒對BEL-7402肝癌細胞感染后，采用CCK-8檢測細胞的生長情況，根據(jù)細胞的生長狀況，繪制細胞增殖曲線圖(圖3)。結果顯示，感染組在2 d前差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而在2～5 d差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明感染miR-16慢病毒后，BEL-7402肝癌細胞的增殖能力明顯降低。

圖 1 目的質(zhì)粒轉染293T細胞Fig. 1 The target plasmid was transfected into 293T cells

圖 2 過表達miR-16慢病毒穩(wěn)定細胞株Fig. 2 Over-expression of miR-16 lentivirus stable cell lines

2.3 感染miR-16慢病毒對BEL-7402肝癌細胞周期的影響

BEL-7402肝癌細胞感染miR-16慢病毒，流式細胞術檢測細胞周期(圖4)。與陰性對照組相比，BEL-7402細胞周期的G1期細胞百分率下降，S及G2/M細胞的百分率數(shù)值上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，證明miR-16可使BEL-7402肝癌細胞部分停滯于S及G2/M期，延緩了細胞分裂的速度，抑制了細胞增殖。

2.4 感染miR-16慢病毒對Bel-7402肝癌細胞凋亡的影響

人BEL-7402肝癌細胞感染miR-16慢病毒后，采用流式細胞儀對兩組細胞凋亡率進行檢測，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖5、6)，證明miR-16對7402肝癌細胞的凋亡有較為明顯的作用和影響。

圖 3 過表達miR-16慢病毒對BEL-7402肝癌細胞增殖能力的影響Fig. 3 Effects of over-expression of miR-16 lentivirus on the proliferation of BEL-7402 hepatocarcinoma cells

圖 4 過表達miR-16對Bel-7402肝癌細胞周期影響Fig. 4 Overexpression of miR-16 on cell cycle of BEL-7402 hepatocarcinoma cells

圖 5 流式細胞術檢測兩組細胞凋亡情況Fig.5 Detect the apoptosis of the two groups by fl ow cytometry

圖 6 過表達miR-16對BEL-7402肝癌細胞凋亡的影響Fig. 6 Effects of over-expression of miR-16 on apoptosis of BEL-7402 hepatocarcinoma cells

3 討 論

肝癌對于人類的生存健康有著極大的威脅，屬于病死率較高的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，近年來我國死于肝癌的患者逐漸增多，年平均值已達到30萬左右，占全球肝癌死亡人數(shù)的50%左右，肝癌的高死亡率為我國醫(yī)學界造成了極大的難題和負擔［1-4］。肝癌治療研究雖然已深入至基因水平，但目前仍沒有找出對治療有效且具有特異性的分子靶點。

miRNA目前多數(shù)存在于真核生物中，屬于高度保守及非編碼的小分子單鏈RNA的一種。miR-16/miR-15a主要靶向抑制Bcl-2、WT-1、WNT3A、MCA1、MCL1及CCDN1等致癌基因的活性，進而促進腫瘤細胞的凋亡［5］。miR-16最早被發(fā)現(xiàn)在白血病中表達下調(diào)［7］，miR-16在肝癌、胃癌、垂體腺瘤、肺癌、前列腺癌和多發(fā)性骨髓瘤中表達均下調(diào)［8］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-16/miR-15a亦可靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子的分泌而發(fā)揮抗腫瘤活性［6］。

本研究表明，相對于陰性對照組，BEL-7402細胞周期中G1期細胞百分率下降，S及G2/M期細胞的百分率上升，表明miR-16可使BEL-7402肝癌細胞部分停滯于S及G2/M期，從而延緩細胞分裂的速度。因此，進一步證實了miR-16抑制癌細胞的機制之一是通過影響細胞周期從而抑制細胞的增殖。

有研究報道，miR-16負調(diào)控Bcl-2，miR-16的缺失或下調(diào)，導致Bcl-2表達的升高，促進白血病、淋巴瘤和前列腺癌的發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-16通過激活外源性APAF-1-胱天蛋白酶-9-PARP凋亡途徑，參與凋亡過程［11］。本研究初步證實，miR-16能抑制肝癌Bel-7402細胞增殖及促進細胞凋亡，而miR-16介導肝癌細胞增殖和調(diào)節(jié)細胞凋亡的分子機制，仍需后續(xù)實驗進一步探討。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-16過表達能抑制肝癌BEL-7402細胞增殖及促進細胞凋亡，提示miR-16有望成為肝癌基因治療重要的新靶點。相信隨著研究的深入，miR-16在癌癥治療方面的應用價值將逐漸展現(xiàn)出來。

［1］ PARK J A, LEE K Y, OH Y J, et al. Activation of caspase-3 protease via a Bcl-2 insensitive pathway during the process of ginsenoside Rh2-inducedapoptosis［J］. Cancer Lett, 1997,121(1): 73.

［2］ NAKATA H, KIKUCHI Y, TODE T, et al. Shinomiya inhibitory effects of ginsenoside Rh2 on tumor growth in nude mice bearing human ovarian cancer cells［J］. J Cancer Res,1998, 89(7): 733.

［3］ ZENG X L, TU Z G. In vitro induction of differentiation by ginsenoside Rh2 in SMMC-7721 hepatocarcinoma cell line［J］. Pharmacol Toxicol, 2003, 93(6): 275.

［4］ OH M, CHOI Y H, CHOI S, et al. Anti-proliferating effects of ginsenoside Rh2 on MCF-7 human breast cancer cells［J］.Int J Oncol, 1999, 14(5): 869-875.

［5］ PEKARSKY Y, CROCE C M. Role of miR-15/16 in CLL［J］. Cell Death Differ. 2015, 22(1): 6-11.

［6］ TUNG Y T, HUANG P W, CHOU Y C, et al. Lung tumorigenesis induced by human vascular endothelial growth factor (hVEGF)-A165 overexpression in transgenic mice and amelioration of tumor formation by miR-16 ［J］. Oncotarget,2015, 6(12): 10222-10238.

［7］ DAL BO M, ROSSI F M, ROSSI D, et al. 13q14 deletion size and number of deleted cells both influence prognosis in chronic lymphocytic leukemia［J］. Genes Chromosomes Cancer, 2011, 50(8): 633-643.

［8］ CIMMINO A, CALIN G A, FABBRI M, et al. miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(39): 13944-13949.

［9］ STELLER H. Mechanisms and genes of celluar suicide［J］.Science, 1995, 267(5203): 1445.

［10］ RONINSON I B. Tumor senescence as a determinant of drug response in vivo［J］. Drug Resist Updat, 2002, 5(5): 204-208.

［11］ ZHANG X, WAN G, MLOTSHWA S, et al. Oncogenic Wip1 phosphatase is inhibited by miR-16 in the DNA damage signaling pathway［J］. Cancer Res, 2010, 70(18): 7176-7186.