戴 曦，李國平，楊小瓊，王孝蕓，伍 娟，梁麗嫻

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，四川 瀘州 646000；

2.澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/澳門藥物與健康應(yīng)用研究院，澳門特別行政區(qū) 999078；

3.成都市第三人民醫(yī)院/西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 成都 610000；

4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院炎癥與變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000；

5.四川省第二中醫(yī)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 成都 610000

我國由于工業(yè)化速度加快、環(huán)境污染加重等因素，現(xiàn)已位居腫瘤發(fā)病率和死亡率榜首，成為因肺癌死亡人數(shù)攀升最快的國家。國家癌癥中心發(fā)布數(shù)據(jù)顯示，2006—2011年，我國肺癌發(fā)病率為130.2萬，其中，男性84.6萬，女性45.6萬［1］。到2015年，我國全年約有429萬例新發(fā)癌癥患者和281萬例因癌癥導(dǎo)致的死亡患者，其中，無論是發(fā)病率還是死亡率，肺癌均占據(jù)第1位［2］。據(jù)美國發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2016年美國大約有224 390例新發(fā)肺癌患者，共15 808例患者死于肺癌［3］。由此可見，肺癌在全球范圍內(nèi)都是發(fā)病率、死亡率極高的腫瘤，造成的社會負(fù)擔(dān)日趨沉重，是一個亟待解決的公共健康問題。目前我國肺癌采用的是手術(shù)、化療、放療及生物治療相結(jié)合的綜合治療方法，但其1和5年生存率僅為44%和17%，其中小細(xì)胞肺癌的5年生存率僅7%［4］。肺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因參與、多因素影響和多步驟進(jìn)展的復(fù)雜過程，近年來，雖然針對非小細(xì)胞肺癌的分子靶向藥物取得了一定的療效，但仍有較多限制，因此深入研究肺癌，正確認(rèn)識其生物學(xué)特性，進(jìn)一步尋找新的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，并由此發(fā)現(xiàn)新的藥物針對潛在分子治療靶點(diǎn)進(jìn)行治療，對于肺癌的防治至關(guān)重要。

Lyn激酶是受體酪氨酸蛋白激酶(Src family of protein tyrosine kinases，SFK)家族的重要成員之一，該家族作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶，廣泛參與機(jī)體免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)等病理生理過程［5］。在進(jìn)一步的研究中，越來越多的證據(jù)表明，SFK家族成員參與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究著重探討Lyn激酶通過影響表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)下游信號通路調(diào)節(jié)EGFR突變肺腺癌細(xì)胞株Hcc827發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，對于肺腺癌的診斷、分子靶向治療都有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

人肺腺癌細(xì)胞株Hcc827(EGFR外顯子19缺失突變，購自美國模式培養(yǎng)物保藏所)由澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存并復(fù)蘇；5周齡雄性裸鼠購自重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動物公司；EFIA-eGFP-puro、EFIA-eGFP-Lyn-puro慢病毒載體構(gòu)建于賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司；Lyn、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3和Bcl-2抗體購自英國Abcam公司；PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT1、小鼠抗兔二抗和猴抗小鼠二抗購自美國Santa公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Hcc827細(xì)胞株培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染

將合適密度的Hcc827細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為預(yù)熱的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素雙抗)，隔天更換培養(yǎng)基，所有操作均在超凈工作臺上完成。選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度約為85%時，常規(guī)胰酶消化計數(shù)，將細(xì)胞按2×105/ 孔接種于6孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到30%時，棄原培養(yǎng)基，每孔加入1 mL新鮮無血清培養(yǎng)基，分別加入適量EFIA-eGFP-puro(Hcc827-GFP，空載體對照組)或EFIA-eGFP-Lyn-puro(Hcc827-Lyn+/+，Lyn高表達(dá)實(shí)驗(yàn)組)病毒液，培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換新鮮全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后在熒光顯微鏡下觀察到明顯綠色熒光表達(dá)證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。

1.2.2 裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)

5周齡Balb/c-nu裸鼠15只，隨機(jī)分為3組(n=5)，選擇對數(shù)生長期Hcc827細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hcc827-GFP、Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，用1 mL注射器將細(xì)胞與基質(zhì)膠1∶1混合液注射至裸鼠前腿根部皮下，每只裸鼠注射0.2 mL，第2天使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，長軸記為A，短軸記為B，腫瘤體積=A×B2/2，繪制腫瘤生長曲線。第35天脊髓離斷處死裸鼠，剝離瘤塊。裸鼠的飼養(yǎng)及相關(guān)操作均于西南醫(yī)科大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物房中完成。

1.2.3 免疫熒光檢測腫瘤細(xì)胞Lyn蛋白表達(dá)

選擇對數(shù)生長期Hcc827、Hcc827-GFP和Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞，以較低密度接種于共聚焦皿，第2天換液，待觀察到形成細(xì)胞克隆群時以4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，依次完成細(xì)胞核穿孔、封閉、溫育一抗、二抗及DAPI染色等步驟，在共聚焦顯微鏡下觀察Lyn蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn)

選擇對數(shù)生長期Hcc827、Hcc827-GFP和Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞，按5×103個/孔接種于96孔板上，每孔100 μL，每組設(shè)10個復(fù)孔，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下分別培養(yǎng)24和48 h；另將上述3種細(xì)胞按3×103個/孔接種于96孔板上，每孔100 μL，每組設(shè)10個復(fù)孔，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)72 h。避光條件下每孔加入MTT溶液10 μL，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h取出，300×g離心5 min，棄上清液，每孔加入100 μL Formanzan溶解液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在顯微鏡下觀察到黑紫色結(jié)晶完全溶解后，搖床振蕩搖勻，酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處吸光度(D)值，并計算存活率，存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組D值－空白組D值)/(對照組D值－空白組D值)×100%。

1.2.5 克隆實(shí)驗(yàn)

選擇對數(shù)生長期Hcc827、Hcc827-GFP和Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后按500個/皿接種于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，第2天更換培養(yǎng)基。10 d后棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，瑞氏-吉姆薩染液染色，觀察克隆形成情況。

1.2.6 侵襲實(shí)驗(yàn)

低溫下用無血清的RPMI-1640分別將Matrigel稀釋至3 mg/mL，人纖維連接蛋白稀釋至125 μg/mL，分別均勻涂在Transwell上室的內(nèi)、外表面，超凈工作臺內(nèi)過夜干燥，使用前用紫外線照射1 h。水化1 h后在下室中加入1 mL RPMI-1640全培養(yǎng)基，將對數(shù)生長期的Hcc827、Hcc827-GFP和Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞按1×105個/mL的密度重懸于含0.1%胎牛血清蛋白的RPMI-1640無血清培養(yǎng)基中，每孔300 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置3個復(fù)孔，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定上室外表面30 min，瑞氏-吉姆薩染液染色，在顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測EGFR、p-EGFR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平

將對數(shù)生長期Hcc827細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hcc827-GFP、Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞接種于6孔板上，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)48 h，提取總蛋白并測定蛋白濃度；配制SDSPAGE凝膠，按步驟完成電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗、二抗溫育，洗膜，顯影，測量灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。除裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)外，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計量數(shù)據(jù)用x±s表示，完成數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD或Tamhane’s法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以相同細(xì)胞數(shù)目接種在相同條件下飼養(yǎng)35 d，Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的成瘤能力，接種Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞的裸鼠最終成瘤體積平均值為591.0 mm3，明顯大于Hcc827細(xì)胞(253.2 mm3)和Hcc827-GFP細(xì)胞(240.9 mm3)接種裸鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.583，P=0.005，圖1A)。瘤塊生長曲線顯示，Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞組成瘤能力明顯高于Hcc827細(xì)胞和Hcc827-GFP細(xì)胞組，后兩者生長曲線趨于一致(圖1B)；組間比較結(jié)果顯示，在不同時間點(diǎn)，Hcc827細(xì)胞組和Hcc827-GFP細(xì)胞組接種裸鼠之間，瘤體大小差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞接種裸鼠的瘤體大小大于Hcc827細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1C)。

圖 1 Lyn 激酶高表達(dá)促進(jìn)體內(nèi)種植的Hcc827細(xì)胞生長Fig. 1 Over-expression of Lyn kinase promotes growth of Hcc827 cell line in vivo experiment

2.2 免疫熒光檢測腫瘤細(xì)胞Lyn蛋白表達(dá)

在共聚焦顯微鏡下觀察，Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞組熒光強(qiáng)度高于Hcc827和Hcc827-GFP細(xì)胞組，即Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞組Lyn蛋白表達(dá)高于Hcc827細(xì)胞組和Hcc827-GFP細(xì)胞組，提示轉(zhuǎn)染成功(圖2A)。

2.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測Lyn激酶高表達(dá)對Hcc827細(xì)胞生長的影響

結(jié)果顯示，培養(yǎng)24、48和72 h時，Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞組D值均高于Hcc827細(xì)胞組和Hcc827-GFP細(xì)胞組，以Hcc827細(xì)胞組為參照，Lyn激酶高表達(dá)提高了Hcc827細(xì)胞的存活力。而空載體對照組Hcc827-GFP細(xì)胞組與Hcc827細(xì)胞組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表1，圖2B、C)。

2.4 克隆實(shí)驗(yàn)檢測Lyn激酶高表達(dá)對Hcc827細(xì)胞增殖能力的影響

結(jié)果顯示，Hcc827細(xì)胞組克隆形成數(shù)為94.67個/皿，Hcc827-GFP細(xì)胞組克隆形成數(shù)為96.00個/皿，Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞組克隆形成數(shù)為166.33個/皿。Hcc827-GFP細(xì)胞組與Hcc827細(xì)胞組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.909)，而Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞組克隆形成數(shù)明顯高于Hcc827細(xì)胞組和Hcc827-GFP細(xì)胞組，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均=0.001)。Lyn激酶明顯促進(jìn)了Hcc827細(xì)胞的增殖(圖3)。

2.5 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測Lyn激酶高表達(dá)對Hcc827細(xì)胞侵襲能力的影響

在10倍目鏡下觀察，結(jié)果顯示，Hcc827細(xì)胞組穿膜細(xì)胞數(shù)為27.27個/視野；Hcc827-GFP細(xì)胞組穿膜細(xì)胞數(shù)為26.47個/視野；Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞組穿膜細(xì)胞數(shù)為54.87個/視野。Hcc827-GFP細(xì)胞組與Hcc827細(xì)胞組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.776)，而Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于Hcc827細(xì)胞組和Hcc827-GFP細(xì)胞組，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.001)。Lyn激酶高表達(dá)增強(qiáng)了Hcc827細(xì)胞的侵襲能力(圖3)。

圖 2 Lyn激酶高表達(dá)促進(jìn)體外培養(yǎng)的Hcc827細(xì)胞增殖Fig. 2 Over-expression of Lyn kinase promotes proliferation of Hcc827 cell line in vitro experiment

表 1 MTT實(shí)驗(yàn)比較各組D值及存活率Tab. 1 Comparison of D value and survival rate among each group by MTT experiment

圖 3 Lyn激酶高表達(dá)增強(qiáng)體外培養(yǎng)的Hcc827細(xì)胞的克隆和侵襲能力Fig. 3 Over-expression of Lyn kinase enhances the ability of cloning and invasion of Hcc827 cell line

2.6 Western blot檢測EGFR及其下游信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示，與Hcc827細(xì)胞組和Hcc827-GFP細(xì)胞組比較，Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞組Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Caspase-3蛋白表達(dá)降低，提示Lyn激酶高表達(dá)改變了Hcc827細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白平衡，上調(diào)了抑凋亡蛋白表達(dá)水平同時下調(diào)了促凋亡蛋白表達(dá)水平。并且，Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞組EGFR、p-EGFR，以及其下游信號通路相關(guān)蛋白PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、STAT3和p-STAT3的表達(dá)均明顯升高，提示Lyn激酶高表達(dá)進(jìn)一步激活了EGFR信號通路，通過該信號通路發(fā)揮其促進(jìn)Hcc827細(xì)胞增殖、侵襲的作用(圖4、5)。

圖 4 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平Fig. 4 Expression level of the related proteins detected by Western blot

圖 5 Lyn激酶通調(diào)節(jié)EGFR信號通路影響Hcc827細(xì)胞生物學(xué)特性Fig. 5 Lyn kinase affects the biological characteristics of Hcc827 cell line through EGFR signal pathway

3 討 論

SFK屬于非受體類蛋白酪氨酸激酶家族，該家族成員之間的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有高度的同源性，包括SH1(酶促反應(yīng)結(jié)構(gòu)域)、SH2和SH3(調(diào)節(jié)SFK活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域)、特異性N端SH4結(jié)構(gòu)域及C端酪氨酸激酶功能域，當(dāng)SH1區(qū)域的416位點(diǎn)正控區(qū)發(fā)生磷酸化時SFK被激活，進(jìn)而通過其形成的一系列不同細(xì)胞膜受體在細(xì)胞生長、分化、遷移、形態(tài)特征及生存等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［6-7］。近年來，越來越多的證據(jù)顯示，SFK通過生長因子信號級聯(lián)參與實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［8-12］，其中Lyn激酶是SFK家族重要成員，在整合素信號途徑中扮演關(guān)鍵角色，該信號通路與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，同時已經(jīng)明確EGFR是肺腺癌生長、侵襲的關(guān)鍵表面受體之一，EGFR通過持續(xù)激活，形成二聚化后刺激Ras蛋白，導(dǎo)致磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生來激活其下游PI3K/Akt信號通路，從而引起腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，我們預(yù)測Lyn激酶與EGFR信號通路存在關(guān)聯(lián)，進(jìn)而對肺腺癌發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

多變量分析中提到，Lyn表達(dá)水平與總體低存活率有關(guān)，尤其在不吸煙的女性肺腺癌患者中表現(xiàn)突出，使用SFK抑制劑達(dá)沙替尼抑制Lyn活性后能降低Lyn高表達(dá)的肺腺癌細(xì)胞株的存活率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力［13］。另有學(xué)者提出，EGFR磷酸化調(diào)節(jié)與Lyn激酶活性有關(guān)，該效應(yīng)是通過RACK1和Cbp/PAG蛋白實(shí)現(xiàn)的［14］。此外，國內(nèi)外尚缺乏更多相關(guān)研究報道。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)人肺腺癌組織中Lyn表達(dá)明顯高于癌周正常組織，但我們在鱗癌、小細(xì)胞癌組織中，并沒有發(fā)現(xiàn)Lyn高表達(dá)，進(jìn)一步支持Lyn激酶與EGFR可能存在的相關(guān)性。本研究選用19號密碼子缺失的EGFR突變細(xì)胞株Hcc827，通過建立Lyn激酶高表達(dá)細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)Lyn對該細(xì)胞株的增殖、克隆及侵襲能力均起到了促進(jìn)作用，裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中，Hcc827-Lyn+/+細(xì)胞株也表現(xiàn)出更強(qiáng)的成瘤能力和倍增能力。進(jìn)一步的機(jī)制研究證實(shí)，Lyn明顯上調(diào)了EGFR表達(dá)和磷酸化水平，并且激活了下游PI3K/PDK/AKT和JAK/STAT3信號通路，將EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞中。

在腫瘤中，PI3K/PDK/AKT信號通路的編碼基因存在DNA水平的結(jié)構(gòu)突變，缺乏iSH2和C-SH2結(jié)構(gòu)域，這種突變直接導(dǎo)致PI3KT/AKT信號通路的活化和細(xì)胞轉(zhuǎn)化，尤其AKT，是針對腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號因子［15］。Lyn激酶不僅通過持續(xù)激活EGFR影響肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性，也與EGFR下游信號通路形成Lyn/PI3K/Akt、Lyn/STAT3信號途徑，直接磷酸化STAT3［16］，參與EGFR突變肺腺癌細(xì)胞株的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移。Lyn激酶對肺癌的調(diào)節(jié)還有待更深入的研究，進(jìn)一步闡釋其機(jī)制，這有助于將肺癌生物靶向治療和個體化精準(zhǔn)治療推向一個新的高度。

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