原花青素對Aβ25-35作用下PC12細胞的保護作用*

汪 琴, 楊 燕, 王 東, 安 俊, 張 力, 葉茂斌

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 武漢 430024)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)又稱原發(fā)性老年癡呆，是一種老年人群最常見的神經(jīng)退行性疾病。流行病學調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，AD患病率呈現(xiàn)隨年齡增長而發(fā)病率升高的趨勢。數(shù)據(jù)顯示[1]，年齡在65歲以上的人群中AD患病率約為5%，而在年齡85歲以上的人群中其患病率達到20%左右。在臨床表現(xiàn)上，AD患者表現(xiàn)出漸進性的記憶衰退、認知功能障礙、語言能力退化、判斷力下降和喪失生活自理能力，最終導致死亡[2]。阿爾茲海默病其病理特征主要表現(xiàn)為β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元和突觸丟失以及腦血管淀粉樣病變等[3-4]。迄今為止，關(guān)于AD的有效治療方案并沒有得以實現(xiàn)，目前臨床上使用較多的藥物為膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑等，不但經(jīng)濟花費大，而且并不能逆轉(zhuǎn)病情的持續(xù)惡化。所以進一步探索AD的病因及發(fā)病風險因素，對預防AD的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

原花青素(procyanidins，PC)是一種天然的強效抗氧化劑，具有較強的抗氧化和清除活性氧簇(reactive oxygen species，ROS) 的能力，還具有抗腫瘤、預防心血管疾病及改善人體微循環(huán)等多重功效。已有研究表明，神經(jīng)中樞的過氧化損傷以及機體抗氧化能力降低所致的氧化-還原穩(wěn)態(tài)失衡是AD發(fā)病機制中的關(guān)鍵因素[5-6]。據(jù)此推測原花青素對AD患者的治療有著廣闊的前景，但相關(guān)臨床基礎(chǔ)研究鮮有報道。本研究采用Aβ25-35處理PC12細胞誘導細胞損傷，觀察原花青素對PC12細胞是否具有保護作用及可能的機制，從而為AD的臨床治療提供新的參考。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

PC12細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所；原花青素(純度≥98%)購自成都德銳可生物科技有限公司；二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、MTT、DMSO和Aβ25-35均購自Sigma；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；JC-10線粒體膜電位檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人caspase-3 多克隆抗體和兔抗人GAPDH單克隆抗體購自Cell Signaling Techno-logy。酶標儀購自Bio-Rad；流式細胞儀購自BD；全自動數(shù)碼凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)及分組處理 PC12細胞使用含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基復蘇，并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞單層生長至90%左右密度時，使用0.25%胰酶37 ℃消化傳代。根據(jù)實驗需求分為對照(control)組、模型組和PC處理(PC)組。每組設(shè)4個平行孔，PC組分別加入終濃度為25、50和100 mg/L的原花青素，對照組和模型組分別以等量含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基代替，培養(yǎng)24 h后在模型組和各處理組中分別加入終濃度為25 μmol/L的Aβ25-35繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進行后續(xù)實驗檢測。

2.2MTT檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期的PC12細胞，以每孔1×103個接種于96孔板中，細胞分組處理后，在避光條件下每孔加入終濃度為5 g/L的MTT 20 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清每孔加入100 μL DMSO，輕輕振蕩10 min，待紫色甲瓚顆粒充分溶解后，置于酶標儀上測波長為570 nm處的吸光度(A)，取均值計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組A-空白組A)/(對照組A-空白組A)×100%。

2.3AnnexinⅤ/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的PC12細胞，以每孔1×104個接種于6孔板中，細胞分組處理后，0.25%胰酶消化收集細胞，調(diào)整細胞濃度為1×108/L，經(jīng)離心、洗滌后加入500 μL Incubation Buffer重懸細胞，加5 μL Annexin V-FITC混勻，再加5 μL PI充分混勻，避光孵育15 min，上流式細胞儀進行檢測，實驗重復3次。

2.4Western blot 檢測凋亡蛋白caspase-3的表達 取對數(shù)生長期的PC12細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，待細胞生長至60%的細胞密度時進行細胞分組處理。處理結(jié)束后吸去培養(yǎng)液，使用PBS洗2次，使用細胞刮收集細胞于15 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清留細胞沉淀，視細胞沉淀體積適量加入RIPA裂解液，在冰上充分裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清，采用Bradford法進行蛋白定量。取25 μg 蛋白進行SDS-PAGE，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，分別加入兔抗人caspase-3 多克隆抗體(1∶1 000)和兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBS洗滌3次，加入II抗HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(1∶10 000)室溫孵育1 h，TBS洗滌3次，ECL發(fā)光顯色，采用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)自動顯影與數(shù)據(jù)分析，實驗重復3次。

2.5流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS含量 取對數(shù)生長期的PC12細胞，以每孔1×104個接種于6孔板中，待細胞生長至60%時進行分組處理。處理結(jié)束后用0.25%胰酶消化收集細胞，調(diào)整細胞密度為1×108/L，經(jīng)離心、洗滌后加入熒光探針DCFH-DA 10 μmol/L，37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀上機檢測，實驗重復3次。

2.6流式細胞術(shù)檢測細胞線粒體膜電位的變化 接種處于對數(shù)生長期的PC12細胞于6孔板中，待細胞生長至60%時進行分組處理。處理結(jié)束后0.25%胰酶消化收集細胞，調(diào)整細胞密度為1×108/L，經(jīng)離心、洗滌后加入2 μmol/L JC-10，37 ℃避光孵育1 h，流式細胞儀上機檢測，實驗重復3次。

3統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素分析，采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行結(jié)果作圖分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1原花青素提高Aβ25-35作用下PC12細胞的存活率

采用25 μmol/L的Aβ25-35與PC21細胞共培養(yǎng)48 h后，相對于對照組，模型組的細胞存活率下降至(41.67±3.86)%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L的原花青素預處理，相對于模型組，PC12細胞存活率逐步提高，依次為(53.00±2.45)%、(65.00±4.08)%和(84.33±5.31)%(P<0.05或P<0.01)。說明原花青素可以抑制Aβ25-35對PC12細胞的損傷作用,見圖1。

Figure 1. The effect of procyanidins on the viability of PC12 cells exposed to Aβ25-35. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsmodel group.

圖1原花青素對Aβ25-35作用下PC12細胞存活率的影響

2原花青素降低Aβ25-35誘導的PC12細胞內(nèi)的ROS水平

利用DCFH-DA熒光探針單染，流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)活性氧水平的結(jié)果顯示，與Aβ25-35共培養(yǎng)后，模型組細胞內(nèi)的ROS水平急劇上升，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),說明Aβ25-35作用下PC12細胞的氧化損傷較嚴重。而經(jīng)過不同濃度的原花青素預處理后，發(fā)現(xiàn)隨著原花青素濃度的升高，細胞內(nèi)ROS水平逐漸降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),說明原花青素能夠清除Aβ25-35誘導的PC12細胞內(nèi)異常增多的ROS，見圖2。

3原花青素阻礙Aβ25-35作用下PC12細胞線粒體膜電位的下降

JC-10單染流式細胞術(shù)檢測細胞線粒體膜電位的結(jié)果所示，與Aβ25-35共培養(yǎng)后，模型組細胞線粒體膜電位急劇下降，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。采用不同濃度原花青素預處理后，發(fā)現(xiàn)Aβ25-35作用下PC12細胞的線粒體膜電位下降程度有所減弱，說明原花青素對AD模型細胞的線粒體膜具有保護作用，可維持線粒體膜的完整性，見圖3。

Figure 2. The effect of procyanidins on the intracellular ROS level of PC12 cells exposed to Aβ25-35. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖2原花青素對Aβ25-35作用下PC12細胞內(nèi)ROS水平的影響

Figure 3. The effect of procyanidins on the mitochondrial membrane potential of PC12 cells exposed to Aβ25-35. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsmodel group.

圖3原花青素對AD細胞模型PC12細胞線粒體膜電位的影響

4原花青素抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡

Western blot結(jié)果顯示，Aβ25-35作用下模型組PC12細胞中凋亡蛋白caspase-3的切割活性最高，不同濃度原花青素預處理后caspase-3切割活性隨原花青素濃度的升高而降低(P<0.01),見圖4A。而且，AnnexinⅤ/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，Aβ25-35共培養(yǎng)后可導致PC12細胞凋亡率上升至(43.77±3.67)%，遠高于對照組的(8.63±1.48)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。采用不同濃度原花青素預處理后，原花青素可降低AD模型細胞PC12的凋亡率，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明原花青素能夠抑制AD模型PC12細胞的凋亡，見圖4B。

討 論

AD是一種發(fā)病機制十分復雜的彌漫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前，Aβ的毒性級聯(lián)反應(yīng)被公認為是AD病理進程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]，而氧化應(yīng)激則是Aβ病理機制中的關(guān)鍵影響因子[8-9]。有研究表明，AD患者體內(nèi)存在大量活性氧的產(chǎn)生以及抗氧化能力的下降[10]。氧化-還原穩(wěn)態(tài)失衡可導致毒性活性氧簇的產(chǎn)生，增加Aβ的生產(chǎn)。Aβ在腦內(nèi)聚集，星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞被激活，進行性突觸和神經(jīng)突觸受損，引起氧化應(yīng)激損傷，最終導致細胞凋亡[11]。大量研究表明[12-13]，Aβ25-35處理可以復制AD的病理過程。因此，本研究采用Aβ25-35體外處理PC12細胞，探討AD的發(fā)病機制。

原花青素是一種強效的抗氧化劑，其抗氧化能力強于維生素C和維生素E[14]，能夠抑制體內(nèi)氧自由基的生成以及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化[15]。原花青素在醫(yī)藥、保健食品和化妝品等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，是極具發(fā)展前景的天然植物提取物。

本實驗中使用25 μmol/L的Aβ25-35與PC12細胞共培養(yǎng)48 h，用不同濃度(25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L)的原花青素預處理均能使Aβ25-35作用下的PC12細胞存活率明顯提高，其中以100 mg/L原花青素最為明顯，說明原花青素對PC12細胞具有保護作用。有研究表明，原花青素能減輕H2O2引起PC12細胞的氧化損傷[16]，提示原花青素對PC12細胞的保護作用可能是通過減輕細胞氧化損傷的途徑實現(xiàn)的。ROS是機體內(nèi)各種形式的氧自由基和非氧自由基形式存在的含氧化合物的總稱，機體內(nèi)ROS含量的高低能夠反映機體氧化損傷程度[17]。細胞內(nèi)ROS含量檢測結(jié)果顯示，與Aβ25-35共培養(yǎng)后，PC12細胞中ROS含量顯著上升，說明Aβ導致PC12細胞的氧化損傷較嚴重。而經(jīng)過不同濃度的原花青素預處理后，發(fā)現(xiàn)隨著原花青素濃度的升高細胞內(nèi)ROS含量逐漸降低，說明原花青素能夠清除Aβ25-35作用下細胞內(nèi)異常增多ROS。蔡洪斌等[18]研究也表明，葡萄籽原花青素可清除AD 模型大鼠腦組織中氧自由基。另外，線粒體是機體動力工廠，也是機體ROS產(chǎn)生的場所。原花青素清除機體ROS可能與線粒體功能相關(guān)。本研究實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，Aβ25-35作用下細胞的線粒體膜電位下降非常明顯，而原花青素預處理組細胞線粒體膜電位下降幅度并不明顯，尤其是100 mg/L原花青素組，說明原花青素對線粒體雙層膜具有保護作用，可能是通過清除線粒體內(nèi)產(chǎn)生的ROS，減弱了ROS對線粒體膜的攻擊作用。

Figure 4. The effect of procyanidins on the apoptosis of PC12 cells exposed to Aβ25-35. A： the protein level of cleaved caspase-3 was detected using Western blot; B: the apoptosis of PC12 cells was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖4原花青素對Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡的影響

線粒體膜電位下降可以導致線粒體內(nèi)膜通透性增加，進一步促進線粒體內(nèi)部氧自由基以及促凋亡因子的釋放。有研究表明，線粒體膜電位的下降是細胞凋亡的早期事件[19]。原慧萍等[20]等研究發(fā)現(xiàn)原花青素可抑制微波誘導視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，與Aβ25-35共培養(yǎng)后，PC12細胞凋亡明顯，而原花青素預處理后，隨著原花青素的濃度升高而細胞的凋亡率逐漸下降。而且Western blot檢測凋亡蛋白caspase-3的結(jié)果也顯示，模型組的cleaved caspase-3活性最高，隨著原花青素預處理濃度的升高cleaved caspase-3的活性逐漸降低。說明，原花青素能夠抑制Aβ25-35作用下PC12細胞的凋亡。

綜上所述，原花青素通過清除Aβ25-35作用下PC12細胞內(nèi)的ROS含量，減輕細胞線粒體膜氧化損傷，最終抑制細胞發(fā)生凋亡，進而對Aβ25-35作用下PC12細胞產(chǎn)生保護作用。因此，原花青素有望成為治療AD的一種潛在藥物。

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