白藜蘆醇對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的離體大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷及MCP-1表達(dá)的影響*

陳 淳， 林建偉， 嚴(yán)建平△， 王良興

(1浙江省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 2浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院心血管內(nèi)科， 浙江 杭州 310014； 3溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 浙江 溫州 325000)

肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism，PTE)為臨床常見(jiàn)病、危重病[1]。急性PTE后嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓是該病死亡的直接原因，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是一個(gè)多因素參與的過(guò)程。近年來(lái)研究表明，急性肺栓塞后栓塞血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)引起內(nèi)皮功能紊亂，是引起肺動(dòng)脈高壓的首要因素[2]。單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)屬于炎癥趨化因子，可在急性肺損傷發(fā)生后募集大量炎癥細(xì)胞至損傷部位形成正反饋，產(chǎn)生一系列炎癥相關(guān)介質(zhì)造成肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而引起肺動(dòng)脈壓力升高[3]。

中藥單體白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種植物多酚，除具有心血管的保護(hù)作用外，其抗炎效應(yīng)也已被證實(shí)[4]。研究報(bào)道，白藜蘆醇可有效抑制MCP-1在血管炎癥模型中釋放[5]，且白藜蘆醇在血管動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中同樣可通過(guò)減少M(fèi)CP-1的表達(dá)，預(yù)防血管壁泡沫細(xì)胞生成[6]。本研究在體內(nèi)部分結(jié)果亦已證實(shí)，白藜蘆醇可有效降低急性肺栓塞后MCP-1的大量表達(dá)，有助于緩解急性肺栓塞后肺動(dòng)脈高壓。因此，本實(shí)驗(yàn)在離體大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(rat pulmonary artery endothelial cells，RPAECs)中加用腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，誘導(dǎo)MCP-1大量表達(dá)，體外模擬急性PTE后的炎癥反應(yīng)狀態(tài)，探究白藜蘆醇是否可下調(diào)MCP-1表達(dá)，減少對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

本實(shí)驗(yàn)采用離體培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1表達(dá)，觀察白藜蘆醇對(duì)MCP-l表達(dá)的影響，同時(shí)探討白黎蘆醇降低TNF-α誘導(dǎo)離體大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1表達(dá)的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠6只，體重300～350 g，購(gòu)于上海中科院，許可證號(hào)為SCXK(浙)2005-0019，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心層流實(shí)驗(yàn)室，溫度25 ℃，濕度70%，晝夜照明12/12 h。

白藜蘆醇(Sigma-Aldrich)；兔抗鼠MCP-1多克隆抗體(Abcam)；SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (TOYOBO)；MCP-1特異性中和抗體C1142(Centocor)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和TRIzol(Gibco)。PowerLab系統(tǒng)(ADInstruments)；S1000 PCR儀(Bio-Rad)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 取SPF級(jí)健康成年雄性的SD大鼠6只，參照文獻(xiàn)描述的方法[7]，分離肺動(dòng)脈，用顯微剪將肺動(dòng)脈剪成1.5 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，放入25 cm2無(wú)菌培養(yǎng)瓶(1%明膠預(yù)置，4 ℃過(guò)夜，用前2 h移入37 ℃、5% CO2，95%濕度恒溫CO2培養(yǎng)箱)培養(yǎng)，固化2 h后，小心加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液2 mL，放入培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。約48 h后，可見(jiàn)較多內(nèi)皮細(xì)胞爬出，60 h后將肺組織塊輕輕吸出，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。7 d左右可見(jiàn)細(xì)胞已融合成單層，RPAECs的形態(tài)為多邊形，呈典型的“鋪路石”樣生長(zhǎng)，即可行傳代培養(yǎng)，取第4代培養(yǎng)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定 細(xì)胞形態(tài)鑒定采用倒置相差顯微鏡觀察，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞胞質(zhì)透明，彼此融合生長(zhǎng)，細(xì)胞呈多邊形、短梭形，呈現(xiàn)典型的“鋪路石”和“鵝卵石”樣生長(zhǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定參考第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色試劑盒(Sigma-Aldrich)說(shuō)明，以不加 I 抗為陰性對(duì)照，鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。

2.3白藜蘆醇合適作用濃度的確定 應(yīng)用CCK-8法測(cè)定不同濃度白藜蘆醇對(duì)RPAECs活力的影響，以確定實(shí)驗(yàn)中藥物的合適濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPAECs，消化吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107/L，將細(xì)胞接種到96孔板中，每孔加100 μL，培養(yǎng)24 h。細(xì)胞生長(zhǎng)至次融合狀態(tài)時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。將RPAECs混懸培養(yǎng)液(1×107/L)分別加入3塊96孔板中，每塊板均分6組，即對(duì)照組、調(diào)零組和白藜蘆醇0.5 μmol/L、5 μmol/L、50 μmol/L和500 μmol/L處理組，每組接種6孔，24 h后吸出培養(yǎng)液，用含4% 胎牛血清的RPMI-1640洗3遍,各孔中留100 μL，分別在培養(yǎng)1、4和8 h時(shí)各取出其中一塊96孔板，于各孔分別加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃培養(yǎng)2 h，選擇450 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)吸光度值(A)值。根據(jù)測(cè)定數(shù)值選擇對(duì)RPAECs活性無(wú)影響的白藜蘆醇最高濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為正常組(control組)、溶劑對(duì)照組(solvent組)、TNF-α組(10 μmol/L)、TNF-α+C1142(10 μg/L)組(C1142組)和TNF-α+白藜蘆醇組(Res組)，每組分成1、4和8 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)前取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化分組接種。待細(xì)胞長(zhǎng)滿60%～80%左右，換無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h，然后行藥物干預(yù)。將各組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、95%濕度恒溫CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、4和8 h。

2.5TUNEL法檢測(cè)并計(jì)算肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù) 各組選取1張肺細(xì)胞切片，置于64 ℃烘箱1 h，二甲苯脫蠟3次，每次各5 min。后依次置于100%、95%、90%、80%和70%乙醇中各5 min水化；PBS緩沖液沖洗5 min，滴加蛋白酶K(現(xiàn)配)，37 ℃水浴箱消化30 min；PBS緩沖液洗滌2次，每次5 min；滅活過(guò)氧化酶，滴加3%過(guò)氧化氫溶液室溫靜置10 min；PBS緩沖液洗3次，每次5 min；每張玻片滴加TUNEL反應(yīng)混合液(現(xiàn)配)約50 μL，加蓋玻片，置孵育盒中，37 ℃恒溫水浴箱中反應(yīng)60 min；PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，滴加Convert-POD，加蓋玻片置于37 ℃恒溫水浴箱30 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min，室溫下加DAB顯色試劑混合液，顯色約90 s，顯微鏡下觀察，適時(shí)停止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染5 s，雙蒸水沖洗，依次由低到高濃度置于上述乙醇溶液各3 min脫水，置二甲苯2次，每次3 min，中性樹(shù)膠封片固定。

細(xì)胞核中出現(xiàn)棕色顆粒為T(mén)UNEL 陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。選擇陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)域，高倍鏡下分別計(jì)數(shù)D16目鏡測(cè)微網(wǎng)網(wǎng)格中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。每張切片計(jì)數(shù)10個(gè)網(wǎng)格，重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)，AI(%)=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.6Real-time PCR檢測(cè)MCP-1的mRNA表達(dá) 使用TRIzol從100 mg快速凍存組織中萃取總RNA。RNA濃度在波長(zhǎng)260 nm處的吸光度定量，RNA純度在波長(zhǎng)260 nm和280 nm(A260/A280)檢測(cè)。取1 μg總RNA與2 μL 5×RT buffer、0.5 μL RT enzyme mix和0.5 μL primer mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將逆轉(zhuǎn)錄終產(chǎn)物溶于10 μL去RNA酶水中備用。MCP-1上游引物序列為5’-GTCTCTGTCACGCTTCTG-3’，下游引物序列為5’-TGCTGGTGATTCTCTTGTAG-3’；內(nèi)參照GAPDH上游引物序列為5’-AGAACATCATCCCTGCATCC-3’，下游引物序列為5’-TGGATACATTGGGGGTAGGA-3’。PCR反應(yīng)條件為95 °C 2 min；95 °C 15 s、62 °C 1 min， 40個(gè)循環(huán)。所有PCR結(jié)果由ABI 7500 System SDS軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

2.7Western blot檢測(cè)MCP-1的蛋白表達(dá)水平 所有細(xì)胞的蛋白濃度均使用BCA法檢測(cè)，采用15%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE，用兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃封閉過(guò)夜后，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 II 抗(1∶5 000)孵育2 h；化學(xué)發(fā)光、顯影、定影；將膠片進(jìn)行掃描，用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析各組蛋白表達(dá)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’s T3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1細(xì)胞鑒定

在倒置光學(xué)顯微鏡下，RPAECs呈梭型，細(xì)胞中心有卵圓形細(xì)胞核，細(xì)胞呈多邊形、短梭形，呈現(xiàn)典型的“鋪路石”、“鵝卵石”樣生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1；第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫染色呈棕黃色陽(yáng)性，說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞是肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，見(jiàn)圖2。

Figure 1. The morphological observation of RPAECs under light microscope (×100).

圖1RPAECs光鏡下的形態(tài)

Figure 2. Identification of the RPAECs (Ⅷ factor-related antibody for immunostaining， ×400).

圖2RPAECs的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

2各組RPAECs細(xì)胞8h在倒置光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)改變

在倒置光學(xué)顯微鏡下，control組與solvent組RPAECs相互融合呈貼壁生長(zhǎng)，無(wú)細(xì)胞凋亡；TNF-α組RPAECs有較多凋亡，細(xì)胞皺縮且細(xì)胞數(shù)量較solvent組顯著減少；C1142組也出現(xiàn)部分細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，但較TNF-α組凋亡細(xì)胞數(shù)量較少(P<0.05)，大部分細(xì)胞仍能貼壁生長(zhǎng)，見(jiàn)圖3、4。

Figure 3. The morphological changes of RPAECs at 8 h in different groups (×100).

圖38h各組RPAECs在倒置光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)改變

Figure 4. The effects of C1142 on the apoptosis of RPAECs at 8 h in different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTNF-α group.

圖48hMCP-1特效中和抗體C1142對(duì)各組RPAECs凋亡的影響

3不同濃度白藜蘆醇對(duì)RPAECs增殖的影響

當(dāng)白藜蘆醇<50 μmol/L時(shí)，隨著白藜蘆醇濃度升高, 處理組的A450有增高的趨勢(shì),但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而當(dāng)白藜蘆醇≥50 μmol/L時(shí)，處理組的A450有下降的趨勢(shì)(P<0.05)，提示低于50 μmol/L的白藜蘆醇對(duì)RPAECs的細(xì)胞活力沒(méi)有影響，而當(dāng)白藜蘆醇>50 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力下降。因此選用50 μmol/L的白藜蘆醇作為處理組合適濃度作用于RPAECs，觀察白藜蘆醇對(duì)RPAECs表達(dá)MCP-1的影響，見(jiàn)表1。

4白藜蘆醇對(duì)RPAECs中MCP-1mRNA表達(dá)的影響

與control組比較，各相同時(shí)點(diǎn)，solvent組MCP-1的mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；RPAECs經(jīng)TNF-α刺激后，MCP-1的mRNA表達(dá)水平較solvent組顯著升高(P<0.05)。Res組MCP-1的mRNA表達(dá)水平分別較TNF-α刺激組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

表1白藜蘆醇對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

Table 1. The effects of resveratrol (Res) on the cell activity of RPAECs (Mean±SD.n=6)

Res(μmol/L)A4501h4h8h00．83±0．340．88±0．420．94±0．360．50．84±0．230．90±0．321．14±0．4350．84±0．270．90±0．331．10±0．40500．78±0．35?0．77±0．36?0．75±0．37?5000．77±0．38?0．73±0．32?0．71±0．24?

*P<0.05vs0 μmol/L group.

Figure 5. The effect of resveratrol (Res) on the mRNA expression of MCP-1 in RPAECs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTNF-α group.

圖5白藜蘆醇對(duì)大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1mRNA表達(dá)的影響

5白藜蘆醇對(duì)RPAECs中MCP-1蛋白表達(dá)的影響

與control組比較各相同時(shí)點(diǎn)的變化，solvent組的MCP-1 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；RPAECs經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后，MCP-1 的蛋白表達(dá)水平較solvent組顯著增高(P<0.05)；Res組的MCP-1 蛋白表達(dá)較TNF-α組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure 6. The effect of resveratrol (Res) on protein expression of MCP-1 in RPAECs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTNF-α group.

圖6白藜蘆醇對(duì)各組RPAECs細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)的影響

討 論

PTE是血栓堵塞肺動(dòng)脈引起肺循環(huán)障礙的臨床和病理生理綜合征，急性PTE后肺動(dòng)脈高壓是引起死亡的主要原因。傳統(tǒng)認(rèn)為，血栓對(duì)肺血管系統(tǒng)的機(jī)械阻塞程度是肺動(dòng)脈壓力升高的主要決定因素。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)肺栓塞后機(jī)械性阻塞雖已基本解除，仍存在肺動(dòng)脈高壓，因此認(rèn)為肺栓塞時(shí)肺部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)以及這些炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子可能在肺栓塞后肺動(dòng)脈高壓的形成中起著非常關(guān)鍵的作用[8]。

肺栓塞后，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛受損，大量縮血管物質(zhì)被釋放，如內(nèi)皮素和血管緊張素等均使肺血管收縮。又有研究指出，肺血栓在血管內(nèi)移動(dòng)時(shí)，發(fā)生血小板活化并脫顆粒，釋放血管活性物質(zhì)，包括5-羥色胺、二磷酸腺苷、組胺、前列腺素H2及12-脂氧化酶產(chǎn)物[9-10]。同時(shí)血小板活化因子和12-脂氧化酶產(chǎn)物又誘發(fā)出中性粒細(xì)胞，釋放花生四烯酸代謝產(chǎn)物，如血栓素A2及白三烯B4、C4和D4等，這些物質(zhì)均致肺小動(dòng)脈收縮，反射性引起交感神經(jīng)釋放兒茶酚胺，加重肺動(dòng)脈收縮，引起肺動(dòng)脈高壓[10-11]。

既往多種報(bào)道指出炎癥介質(zhì)如TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和內(nèi)皮素(endothelin，ET)-1等在急性肺栓塞后表達(dá)明顯升高[11-13]，且TNF-α可刺激肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化蛋白-1大量表達(dá)[14-16]。MCP-1是活化和聚集炎癥細(xì)胞至血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要介導(dǎo)者。Eagleton等[17]發(fā)現(xiàn)在肺栓塞早期，肺動(dòng)脈壁中MCP-1表達(dá)量明顯升高，同時(shí)在栓塞后3 h即有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)肺動(dòng)脈壁。MCP-1可在急性肺損傷發(fā)生后募集大量炎癥細(xì)胞至損傷部位形成正反饋，產(chǎn)生一系列炎癥相關(guān)介質(zhì)造成肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起肺動(dòng)脈壓力升高[18]。

為進(jìn)一步證實(shí)MCP-1表達(dá)是否加重對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，本實(shí)驗(yàn)選取大鼠離體肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，加入TNF-α誘導(dǎo)MCP-1大量表達(dá)狀態(tài)，體外模擬急性PTE后大量炎癥因子表達(dá)的內(nèi)環(huán)境，并加用MCP-1特效中和抗體C1142干預(yù)觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變。在倒置光學(xué)顯微鏡下，觀察到正常對(duì)照組與溶劑對(duì)照組RPAECs相互融合且呈貼壁生長(zhǎng)，無(wú)細(xì)胞凋亡改變；TNF-α組RPAECs有較多凋亡及細(xì)胞皺縮且細(xì)胞數(shù)量較solvent組顯著下降。TNF-α+C1142組也出現(xiàn)部分細(xì)胞凋亡，但較TNF-α組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，大部分細(xì)胞仍能貼壁生長(zhǎng)。提示TNF-α誘導(dǎo)MCP-1的大量表達(dá)可加重RPAECs損傷，有助于肺動(dòng)脈高壓的形成。由此可得，降低MCP-1表達(dá)，減少對(duì)RPAECs損傷可能是急性PTE后肺動(dòng)脈壓力的一種有效手段。

中藥單體白藜蘆醇屬芪類化合物, 目前已經(jīng)在21個(gè)科、31個(gè)屬的72 種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇，其中，葡萄、虎杖和花生中白藜蘆醇含量較高，具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎等多種作用。Zhu 等[6]在研究中證實(shí)白藜蘆醇可通過(guò)發(fā)揮抗炎效應(yīng)，抑制TNF-α誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)，從而預(yù)防肥胖相關(guān)性疾病的發(fā)生。亦有報(bào)道指出白藜蘆醇在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，可抑制由IL-1 刺激產(chǎn)生的MCP-1合成與分泌，成為白藜蘆醇保護(hù)心血管系統(tǒng)的機(jī)制之一。白藜蘆醇降低急性PTE后MCP-1表達(dá)的效應(yīng)在本研究第一部分在體實(shí)驗(yàn)中亦被證實(shí)，該結(jié)果已被《Life Science》錄用[19]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)大鼠離體RPAECs，進(jìn)一步探究白藜蘆醇對(duì)TNF-α誘導(dǎo)MCP-1表達(dá)的效應(yīng)。Wes-tern blot及real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可顯著下調(diào)由TNF-α誘導(dǎo)的MCP-1 mRNA和蛋白水平，表明白藜蘆醇可通過(guò)下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá)，減少對(duì)單核細(xì)胞的募集，減輕炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。然而，目前關(guān)于白藜蘆醇如何下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)，減少肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制仍尚不明確。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是生物細(xì)胞內(nèi)一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。多項(xiàng)研究表明，MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)及其核內(nèi)，在引起生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞分化、增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡等)過(guò)程中具有十分重要的作用。p38 MAPK通路是1993年發(fā)現(xiàn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，屬于MAPKs成員之一，其一旦被激活，細(xì)胞質(zhì)中的非磷酸化p38 MAPK轉(zhuǎn)化為磷酸化p38 MAPK，而后移位到細(xì)胞核內(nèi)。既往研究證實(shí)p38 MAPK是MCP-1產(chǎn)生的關(guān)鍵上游分子，抑制p38 MAPK通道可以減少M(fèi)CP-1的大量表達(dá)[20-21]。Gresele等[22]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在急性缺血性心臟疾病中可通過(guò)p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減少大量炎癥趨化因子產(chǎn)生。Chakraborty等[23]亦報(bào)道白藜蘆醇可通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活減少炎癥反應(yīng)發(fā)生。SB203580是p38 MAPK的特異性的吡啶異咪噠唑類抑制劑的突出代表。本實(shí)驗(yàn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)將加用p38 MAPK通路特效抑制劑SB203580預(yù)孵育，繼續(xù)探究白藜蘆醇是否可通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減少TNF-α誘導(dǎo)后MCP-1的大量表達(dá)，抑制肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。

綜上所述，本研究顯示MCP-1的大量表達(dá)參與TNF-α誘導(dǎo)后肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；白藜蘆醇可降低TNF-α誘導(dǎo)后大鼠離體RPAECs中MCP-1表達(dá)，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷；白藜蘆醇可成為一種新型的預(yù)防肺動(dòng)脈內(nèi)皮損傷的藥物。

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